Abstract
Vi rapporterer en ny tilpasning af Radial Monolayer Cell Migration assay først rapporteret at måle den radiale vandring af adhærente tumorceller på ekstracellulære matrixproteiner, til måling af motiliteten af fluorescens-mærkede, ikke-klæbende humane eller murine effektorceller immunceller. Denne teknik anvender en rustfri manifold og 10-godt Teflon dias til fokalt deponere ikke-klæbende T-celler i brønde fremstillet med enten sammenflydende tumor cellemonolag eller ekstracellulære matrixproteiner. Lys og / eller multi-kanal fluorescens mikroskopi anvendes til at spore bevægelse og adfærd effektorcellerne over tid. Fluorescerende farvestoffer og / eller virale vektorer, der koder for fluorescerende transgener anvendes til differentielt at mærke de celletyper til billeddannelse. Denne metode adskiller sig fra tilsvarende type in vitro-analyser, der sporer vandret eller lodret migration / invasion udnytte slide kamre, agar eller Transwell plader. Analysen giver detaljerede billeddata til be indsamlet med forskellige celletyper kendetegnet ved særlige fluorescerende markører; endog specifikke subpopulationer af celler (dvs. transduceret / nontransduced) kan overvåges. Surface intensitet fluorescens plots genereres ved hjælp af specifik fluorescens kanaler, der svarer til migrerende celletype. Dette giver mulighed for bedre visualisering af det ikke-klæbende immuncelle mobilitet på bestemte tidspunkter. Det er muligt at indsamle bevismateriale for andre effektorcellepopulationer funktioner, såsom cytotoksicitet eller overførsel af virale vektorer fra effektor at målrette celler, så godt. Således tillader fremgangsmåden forskere mikroskopisk dokumentere celle-til-celle-interaktioner af differentielt mærket, ikke-klæbende med adhærente celler af forskellige typer. Sådanne oplysninger kan være særlig relevant i vurderingen af biologisk manipulerede eller aktiverede immune celletyper, hvor visuel dokumentation for funktionalitet ønskes med tumor målceller før deres anvendelse til kræftbehandling.
Introduction
Radial monolag cellemigrationsassay blev oprindeligt udviklet til at måle infiltrative egenskaber adhærente tumorceller 1-4 på objektglas coatet med ekstracellulær matrix (ECM) proteiner 5-7 eller med individuelle ECM komponenter, såsom fibronectin eller laminin 1,2. Teknikken involveret podning en enkelt cellesuspension af tumorceller i centrum af brønde med en rustfri stål-celle sedimentation manifold (CSM). Efter sedimentation ville tumorcellerne holde sig til bunden af brønden og ændringen i diameter af den oprindelige cellepopulation over tid blev anvendt til at etablere en hastighed på vandret motilitet. Radial monolag cellemigrationsassay forefindes et visuelt fordel over andre eksisterende metoder, der anvendes Transwell plader assay in vitro migrerende funktioner af celler; disse assays er ikke-befordrende for billeddannelse 8. Så godt, det også en stor mængde af frihed i valget af tidspunkternes Når migration vurderes, uden nogen øvre grænse for antallet af tidspunkter en forsker kan vælge at billedet efter bundfældning.
Fordi evnen til at migrere er en vigtig funktion for ikke-adhærente celler, især i området for immunterapi, eller hvor de kan anvendes som tilførselsvehikler til virale vektorer, vi tilpasset brugen af CSM at evaluere migration af ikke-klæbende celler typer på tumor cellemonolag, i tillæg til ECM-proteiner. Den ekstra fordel, mikroskopisk visualisering af migration af ikke-adhærente celler på levedygtige tumor cellemonolag på komplekse ECM isoleret fra tumor, eller på de enkelte ECM komponenter gør dette assay alsidig. Analyser, der beskæftiger brønde belagt med et enkelt ekstracellulært protein ikke præcist afspejler ECM væv substrat eller tumor cellerne ville migrere gennem in vivo.
Her brugte vi alloreaktive cytotoksiske T-lymfocytter (alloCTL), lysfølsomme til større histocompatibility kompleks (MHC) proteiner ved hjælp af en-vejs blandet lymfocyt tumorcellelinier reaktioner (MLTR) eller blandede lymfocyt-reaktioner (MLR) 9, som vores repræsentative ikke-klæbende celletype. Vi testede celler af både human og murin oprindelse. Da migration blev målt på tumor monolag, tumorcellerne anvendte var enten delvis relevante mål, viser nogle af de samme MHC proteiner, der findes på den celle population anvendes til at bevidstgøre effektorerne eller fuldt relevante mål, med et komplet sæt af MHC-molekyler, at effektorer var blevet sensibiliseret mod. I nogle eksperimenter anvendte vi fluorescerende CellTracker Red CMPTX eller celleproliferation farvestof eFluor 670 til at skelne mellem effektorceller og målceller. Vi har også anvendt transduktion med virale vektorer, der koder for fluorescerende proteiner som en ekstra måde at visualisere cellerne. For visse analyser, vi transduceret den alloCTL med retrovirale replikerende vektorer (RRV) koder for Emerald Green (EMD) fluorescerende protein 10,11; for othERS blev tumorceller transduceret med lentivirale vektorer, der koder for mStrawberry.
Den alloCTL blev podet gennem en kanal af manifolden ind i midten af enten tumor- cellemonolag eller ECM høstet fra tumor cellemonolag. Adhærente og non-adhærente celle-interaktioner blev visualiseret ved lys og / eller ved fluorescensmikroskopi over tid. Forstyrrelser i tumor cellemonolaget ved lav effekt, eller tumorceller med fragmenterede kerner ved høj effekt var indikatorer for celle skade ved lyse og apoptose hhv. Vi skabte digitalt overflade intensitet fluorescerende kort, der viser migration af ikke-klæbende fluorescerende T-celler over enkeltlagskulturer. Vi bemærkede også cytotoksicitet affødt til det klæbende gliom cellemonolaget efter klyngedannelse af overlejret ikke-klæbende alloCTL. Samt, var vandret transduktion af RRV-EMD fra alloCTL til gliom monolag overholdes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Skub Forberedelse
- Indsæt Cell Sedimentation Manifold glider ind sterilisering poser og forsegle med autoklave tape. Face Teflon-coatede side af slæden papiret side af posen for at undgå plast aflejringer på brøndene.
- Autoklave poser i 15 minutter ved 121 ° C.
- Fjern dias fra sterilisering pose inde i et biosikkerhed kabinet og sted i en steril 150 x 15 mm steril petriskål. Op til fire dias kan passe per skål. Placer en 35 x 10 mm petriskål ved siden af dias. Tilsæt 2-3 ml sterilt H2O for at tilvejebringe befugtning.
- Pre-coat lysbilleder med poly-D-lysin ved 100 ug / ml ved anvendelse af nok volumen til at dække hele godt. Efter en time ved stuetemperatur, aspireres opløsningen og skylles overfladen af brønden to gange ved pipettering 1x PBS over overfladen af brøndene.
- Du kan også tilføje fibronectin eller andre ECM komponenter for at sikre stærkere tumorceller tilslutning. Tilføj fibronectin ved 5 ug / ml i tilstrækkelig volumen that brøndene vil ikke tørre inden for en kort tidsperiode ved stuetemperatur.
- Efter 1 time aspireres sidesten løsning og vask to gange ved pipettering op og ned med 1x PBS.
- Hold PBS på brøndene indtil tumor er klar til plettering. Brug glider samme dag.
- Høste sammenflydende kolbe af den ønskede klæbende tumor celletype. Tæl levedygtige celler under anvendelse af trypanblåt-udelukkelse ved lysmikroskopi og resuspender i 5 x 10 6 celler / ml i tilstrækkelig pufret vækstmedium-for eksempel Dulbeccos minimale essentielle medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS), L- glutamin og natriumpyruvat.
- Hvis der ønskes fluorescerende billeddannelse af adhærerende cellepopulation, mærke adhærerende cellepopulation med en vital fluorescerende farvestof eller en celle proliferation farvestof ved at følge protokollerne leveret af producenten.
- Blødt afpipetteres 10 pi komplet medium i hver brønd af slæden tage sig at undgå at skabe bobler i welLS, da disse kan forhindre ensartet tumor cellevedhæftning.
- Tilføj 2,5-5,0 x 10 4 celler (5-10 pi cellesuspension) til mediet i hver brønd (figur 1A). Juster det optimale antal afhængig tumor celletype og antal dages vækst ønskede. Større tumorceller eller hurtigtvoksende celler kan kræve færre celler i første omgang. Bring godt volumen op til 40 pi ved tilsætning medium og pipette op og ned for at sikre en jævn fordeling af celler.
- Efter at alle brønde podes tillade tumorcellerne at klæbe ved stuetemperatur, og derefter placere låget på 150 x 15 mm petriskål og omhyggeligt flytte skålen til et 37 ° C / 5% CO 2 befugtet inkubator i mindst 24 timer.
- Skift dyrkningsmediet dagligt. Pipette forsigtigt en del af det brugte medium fra monolaget og erstatte med frisk komplet medium.
BEMÆRK: På grund af fordampning, vil mere volumen skal tilføjes end blev taget ud. Wells vil være klar til analyse, når en jævn, conflgelige lag af celler er til stede. Det er typisk 1-3 dage efter indledende podning. - Vask monolag forsigtigt gang med PBS som beskrevet i trin 1.4 og enten gå videre til trin 2, hvis der ønskes monolag, eller til trin 1.13 nedenfor for at udtrække ECM-proteiner fra monolag.
- Lav en 0,5% Triton-X (v / v) opløsning i komplet medium og tilsættes 30 pi til hver brønd. Lad monolag fordøje i hætte i 2 minutter, derefter vaskes to gange med komplet medium ved pipettering som beskrevet ovenfor.
BEMÆRK: ECM lag kan være synlige ved lysmikroskopi (figur 2). Brug slides med det samme, eller holde i komplet medium i befugtet CO2-inkubator i 1-2 dage. Lad ikke brønde at tørre ud.
2. Sedimentation af ikke-klæbende T celler på Slide
- Hvis der ønskes fluorescerende billeddannelse af den ikke-klæbende cellepopulation mærke de ikke-adhærente cellepopulationer med en vital fluorescerende farvestof, såsom CFSE, Cell Tracker Red CMPTX eller eFluor670 ved at følge protokollerne fra producenten mindst 1 time forud for analysen. Alternativt manipulere celler til at udtrykke fluorescerende proteiner kodet af virale vektorer.
- Autoklaver cellen sedimentation manifolden i en autoklav pose som beskrevet i 1.2 ovenfor.
- Fjern fugtigt kammer indeholder Teflon coatede slides fra inkubatoren og plads i biologisk sikkerhedsskab.
- Vask brøndene med 1x PBS ved pipettering op og ned, tilsæt derefter 45 pi af komplet medium indeholdende mindst 10% serum.
- Fjern manifolden fra sterilisering kuvert og forsigtigt glide ind over brøndene, indtil "krog« i slutningen af manifolden rører bunden af slæden (figur 1B).
- Kontroller, at dyrkningsmediet er synlig i hver af kanalerne. Hvis ingen ses, tag manifolden og tilføje mere medium til den tilsvarende godt, derefter erstatte og tjek igen.
- Gentag trin 2.5 for hver channel af manifolden, eller så mange brønde som ønsket.
- Tæl ikke-adhærente celler og resuspender på ikke mindre end 1,0-2,0 x 10 5 / pl. Draw up 1 pi celler og langsomt pipetteres dem ind i kanalen (figur 1C). Gør dette for hver brønd ønsket.
- Lad hele cellen loaded apparat, dvs manifold og slide, inde i bio-hætte til 20-30 minutter for at tillade cellerne i kanalen til sig.
- Fjern manifolden ved at trykke begge ender og forsigtigt at løfte det lige op fra slæden, således at den ikke forstyrrer cellerne fokalt podet i centrum af brøndene (figur 1D).
- Undersøg hver brønd for at sikre, at de ikke-adhærente celler med succes er blevet podet i centrum af brønden opholder sig inden for omkredsen af manifolden kanal. De ikke-adhærerende celler vil ideelt let klæbe til monolaget eller ECM og til hinanden, således forsigtigt at bevæge slæden rundt vil ikke forårsage cellen pellet at dispergere. Du må ikke mase diaset.
3. Fluorescens mikroskopi
- Med passende eksperimentelt udstyr, udføre billedbehandling efter bundfældning er bekræftet. Ideelt bruge et mikroskop, der er udstyret med en CO 2 og fugtighedskammer. Billede med lav effekt, dvs. 4X eller 10X, at give mulighed for flere billeder, der skal tages hensyn til et større område, så hele den godt kan ses.
- Anskaf digitale billeder ved hjælp af billedoptagelse software. Udfør brightfield og / eller multi-kanal fluorescens billeddannelse.
- Hvis det ønskes, nedsat en time-lapse at optage billeder i forskellige kanaler i et givet område, eller holde dias befugtet og i en 37 ° C / 5% CO2 inkubator og manuelt tage ud til billedet på tidspunkter ønskede (figur 1E & F, anbefales til længere tidspunkter).
4. Analyse og Display
- Brug billedredigeringsprogram, flette lys og fluorescent billeder i et lag så flere celletyper og markører kan ses i det samme billede. Træk og slip billedfilerne for hver enkelt farve i programmet, og når du bliver bedt, skal du vælge "Tilføj Layer 'muligheden for at oprette en billedfil med flere lag.
- Ved højere forstørrelse, tage, justere og sy sammen billeder på godt digitalt. Juster filer ved at kigge på konserverede regioner mellem to billeder og overlejre et billede oven på det andet, indtil et komplet billede genereres.
- Tilføj micron barer til billeder under erhvervelse ved hjælp af capture software til at bestemme afstanden individuelle celler har migreret.
- For at bestemme celle migration på forskellige tidspunkter, gør overfladen intensitet fluorescens kort med billedsoftware, dvs. ImageJ, at kvantificere fluorescerende T-celle sammenlægning eller spredt over tid.
- For at generere overflade plots, tage en lagdelt billede genereret i trin 4.1 og under Lag vinduetfjerne markeringen alle lag undtagen dem, der svarer til den ønskede kanal. For eksempel, hvis en overflade plot ønskes at visualisere EMD ekspression kun de grønne lag svarer til filtret anvendt til denne markør være synlige.
- Glat billede og gemme det i et filformat anerkendt (f.eks .png) og indlæse billedet i programmet. For at generere overfladen plot, ændre billedet typen til 8-bit, ændre lysstyrken / kontrast efter behov for at reducere baggrunden, og vælg 'Analyze / Surface Plot' muligheden. Billederne i figur 5 blev genereret ved at kontrollere den "Shade", "Draw Axis ',' One Polygon Per Line«, og »Smooth 'afkrydsningsfelter.
- Alternativt kan du tage målinger ved hjælp af radius eller diameter fra den fokale celle depositum ved nul og sammenlign cellerne på det yderste punkt på forskellige tidspunkter. Diameteren af Teflon brønde er 6,0 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virale vektorer, der koder for fluorescerende proteiner, kan anvendes i tillæg til eller i stedet for, fluorescerende farvestof. Viral transduktion bør udføres forud for motilitet assay. Både adhærente og ikke-adhærente celletyper kan være differentielt mærket. Protokollen for transduktion vil afhænge af den type af vektor anvendes. Her vi transducerede den alloCTL i figur 3, 5 og 6 med RRV-EMD mindst to dage i forvejen af analysen under anvendelse af protokollen beskrevet 12. Vi har også anvendt en lentiviral vektor, CMV-Strawberry-IRES-FLUC2, at transducere tumorceller at udtrykke mStrawberry rødt fluorescerende protein (Figur 4). Denne transduktion blev opnået ved tilsætning af vektoren til kolben af celler i 48 timer, på hvilket tidspunkt blev frisk medium tilsat. Efter at cellerne til at restituere i to dage begrænsende fortynding blev udført for at generere en population af 100% transducerede celler.
(figur 3 og 5). Fluorescensmikroskopi viser celler, som oprindelig podet i centrum af brønden, migrere væk fra centrum over tid. Dannelsen af alloCTL aggregater efter 4 timer (figur 3, hvide pile) sandsynligvis afspejler autokrine vækstmønstre udstillet af aktiveret, IL-2-producerende T-cellepopulationer 13.
I et andet eksperiment blev murine effektor alloCTL fremstillet af envejs-MLR hjælp haplotype H-2d Balb / c-responder-splenocytter og haplotype H-2b / k stimulator splenocytter fra B6C3F1 mus, stammen, som TU-2449 gliom er syngene. Umiddelbart før podning gennem kanalen than manifold på tumor cellemonolaget, blev alloCTL farvet med eFluor 670. alloCTL (lilla celler) blev podet i centrum af etablerede monolag af TU-2449 gliomceller (rød), som var 100% transduceret med CMV-halm IRES-FLUC2 virusvektor, og udpladet på brønde dagen før assay. Figur 4A og B viser mikroskopiske billeder taget i samme kvadrant af samme brønd ved 1 og 48 h. Figur 4C og D blev dannet ved anvendelse ImageJ at konvertere digitaliseret lilla fluorescens intensiteter til kvantitative overflade plots, der vises i tredimensionale format.
Endelig blev humane alloCTL lavet med inaktiveret stimulatorceller menneskelige hjerne-tropiske celler afledt fra metastatisk brysttumor cellelinie MDA-MB-231BR af MLTR. Figur 6 viser lys og fluorescens mikroskopi billeder over tid af ikke-klæbende CMPTX-mærket alloCTL, delvist transduceret med RRV-EMD, migrerer på ECM-proteiner udvundet from disse tumorceller. I (A) lysfelt mikrofotografiet viser fokal placering af alloCTL umiddelbart efter sedimentering. I (B og F) lyse felt viser mikrofotografierne, ved 4 og 8 timer, henholdsvis alloCTL radialt migrerer på ECM. Den alloCTL tæthed aftager med afstanden fra centrum af brønden (midten af godt, er øverste venstre hjørne af feltet i BI). Paneler (C og G) viser hele alloCTL præparat farvet med CMTPX (D og H) viser delvis transduktion af alloCTL med RRV-EMD som angivet ved et lille antal EMD + T-celler, og (E og I) viser de sammenlagte billeder af RRV-EMD transducerede alloCTL migrerer på ECM sammen med utransducerede alloCTL.
Figur 2. Tumor cellemonolag og ECM udpladet på CSM slide brønde. Mikrofotografier af slide brønde fremstilletmed (A) konfluent U-87 mg glioma cellemonolagene, eller (B) ECM-proteiner ekstraheret fra sammenflydende U-87 mg farvet med Coomassie blå farvestof. Bar = 200 um. Klik her for en større version af dette tal.
Figur 3. Migration og cytotoksicitet af RRV-EMD transducerede lymfocytter i centrum og forkanten af celle depositum over tid. Fluorescerende mikrofotografier taget på forskellige tidspunkter på forkant og i centrum af alloCTL-RRV-EMD efter sedimentering på et monolag af adhærerende U-87 mg gliomaceller. Effector alloCTL seedet som enkelte celler, danner sfæriske klynger inden 4 timer (hvide pile) for placering. Single fluorescens-mærket CTL har migreret fra centrum af brønden ens tiden skrider frem. Efter 24 timer tom celle pletter i vedhæftende monolag er synlige formentlig skyldes alloCTL cytolyse af tumoren målceller (se område inden streger). Bar = 200 um. Klik her for en større version af dette tal.
Figur 4. Radial migration af murine alloCTL farvet med eFluor 670 på mStrawberry-mærkede gliomceller vist ved 1 og 48 h. Fluorescerende mikrofotografier af en kvadrant af samme brønd ved (A) 1 time og (B) 48 timer efter sedimentation af fluorescens -mærket ikke-klæbende alloCTL på et monolag af TU-2449 gliomaceller. I energibesparende mikrofotografier afspejler det område, der er indeholdt i én kvadrant af CSM godt (radius 3 mm). Ved høj effekt (A og B, mellemværker) alloCTL (hvide pile) er vist i nærheden af eller forbundet med individuelle tumorceller; man har en sønderdelt udseende med fragmenterede kerner og apoptotisk. (C og D) respektive overflade intensitet fluorescens kort opnået under anvendelse ImageJ software viser pixelværdier af det digitaliserede lilla fluorescerende billeder i tredimensional grafisk form og anbragt på et gitter, der repræsenterer godt radius 3 mm. Bar = 500 um. Klik her for en større version af dette tal.
Figur 5. Migration af alloCTL og horisontal spredning af RRV-EMD fra transduceret alloCTL til tumorceller. Fluorescerende mikrofotografier serielt syet sammen til at dække radius af brønden ved hjælp billedredigeringsprogram. Migration af RRV-EMD transduceredealloCTL (hvide pile) er vist på et monolag af U-87 mg tumorceller ved 0 og 72 timer efter sedimentering. RRV-EMD transduktion af tumorceller i monolaget fremgår også ved 72 timer efter tilsætning af EMD-transducerede alloCTL, hvilket indikerer, at horisontal overførsel af infektiøse RRV fra lymfocytter til tumorceller har fundet sted (hvid boks, og indsat). Bar = 200 um. Klik her for en større version af dette tal.
Figur 6. Radial migration af alloCTL transduceret med RRV-EMD og farvet med CellTracker Red CMTPX. Celler blev sedimenteret på ECM ekstrakter afledt fra MDA-MB-231BR celler. Migration af alloCTL blev afbildet af lysfelt lysmikroskopi ved 0, 4 og 8 timer (A, B, F kolonne 1, henholdsvis). Fluoreduft billeder af CMPTX (rød) mærket alloCTL (C, G, kolonne 2), RRV-EMD (grøn) transduceret alloCTL (D, H, kolonne 3), og de fusionerede billeder (E, I, kolonne 4) er vist ved 4 og 8 timer. Bars = 200 um; Bar vist i B finder anvendelse på billeder CI. Klik her for en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumorceller i en enkelt cellesuspension blev pipetteret i brønde i en Teflon-maskeret objektglas. Cellerne fik lov at klæbe og derefter dannede monolag i en befugtet 5% CO2, 37 ° C inkubator (figur 1A). Etablerede monolag eller ECM proteiner fra monolaget kunne høstes til disse assays (Figur 1B). T-lymfocytter mærket med vitale fluorescerende farvestoffer eller transduceret med vektorer, der koder for EMD blev podet i centrum af brønden ved hjælp af en CSM. Evnen af ikke-adhærente effektor-T-lymfocytter til at migrere på monolag eller ECM-proteiner over tid blev derefter evalueret og kvantificeret med lys og fluorescensmikroskopi. Her har vi evalueret migration og cytotoksicitet af ikke-klæbende effektor alloCTL på et monolag af delvis relevant target U-87 mg gliomceller (figur 3 og 5). Disse målceller, kun udviser nogle af humant leukocyt antigen(HLA) molekyler (HLA-A2, B44) findes på de oprindelige stimulatorer, blev anvendt til at reducere potent lytisk aktivitet, der ville blive vist af alloCTL de relevante 13-06 mg målceller (HLA-A1,2 og B44 , 57). Vi observerede også mobiliteten af alloCTL på ECM høstet fra et monolag af MDA-MB-231BR brysttumorceller (figur 6). Den alloCTL blev genereret ved envejs MLTR ifølge fremgangsmåder tidligere offentliggjorte 9. Effector alloCTL høstedes 4-5 dage efter envejs MLTR og transduceret med RRV-GS4-EMD (figur 3 og 5) eller RRV-ACE-EMD (figur 6) 10,11. Højere transduktion niveauer blev opnået med GS4 vektor anvender en gibbonabeleukæmivirus kuvert end med amfotrope ACE vektor. Brug af denne radial migration assay, bemærkede vi, at både transducerede og nontransduced fluorescens-mærket alloCTL havde vandrende kapacitet. Vi viser også, at de bevarer deres evne til at blive CYTotoxic efter undergår manipulationer for RRV transduktion.
Evnen af murine alloCTL at migrere blev også vurderet (figur 4). alloCTL sensibiliseret til haplotype H-2b / k vises af TU-2449-celler blev farvet med eFluor 670 (lilla) og en migration assay blev udført under anvendelse af TU-2449 transduceret med CMV-Straw-IRES-FLUC2 (rød). Når du bruger fuldt relevant mål, blev et lavere antal alloCTL effektorceller podet at forhindre hurtig lyse af tumorcellens mål. Brug 1 time som en basislinie, er T-celler overvejende lokaliseret ved høj densitet i centrum af brønden som en enkelt cellesuspension. De 48 timers micrographs viser omfattende migration af T-celler mod kanten af brønden og klyngedannelse af alloCTL er indlysende med ødelæggelse af tumorcellerne på stedet for deres oprindelige indskud. Proliferation af TU-2449 celler fremgår som mStrawberry mærkede celler øges i tæthed i brønden. Dette er bedre ses i overfladenfluorescens plot, der er genereret til at visualisere fordelingen af lilla celler i brøndene (figur 4, nederste panel). AlloCTL mobilitet er meget mere tydelig i brønden på 48 timer i forhold til 1 time baseline. Svarende til hvad der blev set i analyserne med humane alloCTL og gliomceller, en clearing af tumorcellerne rundt i området af det oprindelige indskud af effektorer er mærkbar på 48 timer, hvilket tyder på lyse af tumor målceller.
Et afgørende skridt i denne analyse er væksten af sunde monolag og efterfølgende høst af 'skelet' ECM. Podning af tumorcellerne ved 2,5-5,0 x 10 4 celler per brønd, ifølge trin 1.9 ovenfor, normalt resulteret i en nogenlunde selv monolag for tumor celletyper vi bruges. Vi fandt det afgørende at tillade tumorcellerne at klæbe ved stuetemperatur, ellers konvektion, der forekommer ved 37 ° C vil skubbe cellerne ind mod midten af brøndene. Samt, pre-coating af brøndene with poly-D-lysin og / eller en ECM protein, såsom fibronectin eller collagen kan i høj grad øge succesrate. Derudover havde vi en bedre succes med disse assays under anvendelse af monolag-afledte "skelet" ECM end med individuelle ECM komponenter (dvs.., Fibronectin, kollagen), som viste sig langt mindre pålidelige. Det er vigtigt at eksperimentere med antallet af ikke-adhærente celler at deponere gennem sedimentation manifold så godt, og hvis anvendelse af en ren celletype, kan man teoretisk kunne definere en motilitet koefficient med dette assay. Fordi brønden volumen er lille og nogle fordampning af medium finder sted, skal genopfyldes dagligt med frisk medium monolaget. Udskiftning af medier forhindrer også ophobning af toksiske lactat som cellerne vokser og kløft. Manglende dyrke en sund monolag kan resultere i at kaste af monolaget eller ECM fra brøndens overflade.
Coomassie blåfarvede ECM-proteiner afledt fra U-87 mg glioma cell line ifølge trin 1.13 ovenfor er vist som et visuelt eksempel på den klæbende substratlag efterladt efter fordøjelse med Triton X-100 (figur 1B). ECM produktion fra et brystcarcinom cellelinie MDA-MB-231BR celler ofte var pletvis og tynde, hvilket resulterer i et ECM lag, der var mere dårligt vedhæftende og undertiden løftet fra slæden under assayet. ECM protein tilslutning til dias forbedret, når tumorceller blev opretholdt som sammenflydende monolag i 1-2 dage før fordøjelse. Gennem hele processen, vedligeholdelse af Teflon tætning omkring brønden var også vigtigt. Holde volumen lav og minimere eksponering af Teflon til Triton-X100-opløsning afbødes skade integriteten af Teflon tætning.
En tilpasning af denne protokol kan være brug af en tredimensional ekstracellulær matrix høstet fra dele af oktober indlejret tumorvæv 14. Det bør imidlertid bemærkes, at afstanden fra den flade BottOMED godt til slide overfladen er kun 1 mm; således kan afsnit overstiger dette tykkelse blive forstyrret af manifold placering. Desuden ville en fremgangsmåde skal udformes for at gøre en lille borehul i vævet til at acceptere dråben medium indeholdende de ikke-adhærente celler.
Fremstilling af en veldispergeret enkelt cellesuspension af effektor-T-lymfocytter i forvejen sedimentation var også nødvendigt. Skånsom tituration af de ikke-klæbende T-celler til at sprede aggregater til en enkelt celle suspension var et vigtigt skridt til højre, før du lægger det alloCTL ind i kanalerne i CSM. Anvendelse af ikke-enzymatiske celledissociering buffere bør anvendes om nødvendigt. Endvidere bør tætheden af effektor-lymfocytter være omkring 1,0-2,0 x 10 5 celler / pi til sedimentering som beskrevet i trin 2.8 ovenfor. Lave celleantal kan resultere i ingen sedimentering, mens højere celletal kan forårsage en stor indbetaling, der er let at forstyrre ved flytning afglide. Det anbefales også, at koncentrationen serum i mediet være mindst 10% for at skabe tilstrækkelig overfladespænding positive menisk, der reducerer risikoen for afsmitning.
En omvendt lysmikroskop med fluorescens billeddannelse kapaciteter og en 4x eller 10x mål er optimal for denne analyse. De tidspunkter for billeddannelse kan bestemmes efter individuelle eksperimentelle undersøgelser og celletyper. Den ikke-klæbende CTL navnlig migrere fra centrum af sedimentation mod kanten af brønden hurtigere på ECM-proteiner (4-8 time) end over et cellemonolag (12-72 timer). Delvist MHC relevante målceller var at foretrække frem for de relevante mål for vores alloCTL assay at fremme visualisering af motilitet og reducere cellemedieret cytolyse af monolag før betydelig migration kan forekomme; anvendelse af en lav effektor til målforhold også forsinker lysis. Anvendelsen af delvis matchede mål giver mulighed for bedre visualisering af RRVtransmission til tumorcellerne så godt.
Anvendelse af et inverteret mikroskop giver flere fordele i forhold til en opretstående anvendelsesområde. En omvendt sigte giver mulighed for billeddannelse gennem befugtet kammer, så glider ikke behøver at blive forstyrret og samtidig opretholde et sterilt miljø for cellerne. Også billeddannelse gennem kammeret giver en barriere mellem prøven og teknikeren, der giver mulighed for tilslutning til biosikkerhed niveau II (BSL II) retningslinjer, når du arbejder med human-afledt væv 15.
Hvis du bruger en opretstående anvendelsesområde, den højeste forstørrelse opnås uden at forstyrre den positive menisk af brønden er 20x. Desværre, brug af et dækglas eller optik kit tilbehør til cellen sedimentation manifold, kan ikke anbefales, da den forstyrrelse af menisken typisk resulterer i spredning af de aflejrede ikke-klæbende celler i hele godt. Imaging over lange perioder kan kræve forsigtig tilsætning af withIUM til hver brønd for at erstatte det tabte til fordampning, selv om dette er mere tilbøjelige til at være påkrævet under tidsforskudt billeddannelse.
Denne protokol er forskellig fra metoder, der måler vandret cellemigration af adhærente celler i Zigmond Chambers 16,17 ville design, som ikke giver mulighed for visualisering af ikke-klæbende cellemigration. Andre assays, der evaluerer horisontal migrering til et kemotaktisk gradient gennem et substrat, såsom agar anvendes generelt til at studere migration af én celletype 18-20. Anvendelse af CSM giver flere fordele til disse metoder samt metoder, der måler lodret migration / invasion af dyrkede celler, såsom i Boyden kamre eller Matrigel Transwell plader. Først celle-celle-kontakt giver mulighed for en bestemmelse af target-effektor celle interaktion og skade ved effektorceller. Den cytolytiske evne alloCTL-RRV-EMD oprindeligt stimuleret af envejs MLTR med stimulator 13-06 mg tumorceller til partiallierede MHC-matchede U-87 mg cellelinie er tydeligt i centrum af monolaget efter 24 og 72 timer efter sedimentation (figurerne 3 og 5, stiplede linjer). Samt nedbrydningen af TU-2449-celler ved murine alloCTL er synlig ved 48 timer efter sedimentering (figur 4). Monolaget udslettet i centrum af alloCTL deponering, men forekommer mere langsomt i resten af monolaget, enten på grund af overlapningen HLA ekspression af 13-06-MG og U-87 mg i assays med humane celler 21 eller lav begyndende antal effektorceller for murine gliom. Også den effektor til target densitet reduceres effektor alloCTL migrere væk fra sedimentation site. Ud over migration og cytolyse, kan denne protokol bruges til at visualisere overførsel af virus koder fluorescerende proteiner. Her er indlysende overførsel af RRV koder for EMD fra alloCTL til tumorcellerne efter 72 timer (figur 5, indsat).
En begrænsning af denne model er, at migration kun kan vurderes in vitro, som ikke kan være virkelig reflekterende af in vivo migration. En anden begrænsning er, at chemokin / chemokin receptor gradienter ikke kan etableres ved hjælp af modellen. Mens kan stadig forekomme interaktioner mellem immunceller med ECM eller individuelle tumorceller og afhænge af, hvad de celler udskiller eller udtrykker, dette motilitet røvay ville ikke svare på spørgsmål om, hvorvidt de ikke-klæbende celler vil vandre specifikt til eller væk fra isolerede faktorer.
En fordel ved dette assay er evnen til at bestemme, om en population af ikke-adhærente celler opretholde vandrende funktionalitet hvis lymfocytterne har eller ikke er blevet transduceret. I vores eksempel, den transducerede subpopulation er synlig gennem EMD proteinekspression, og det er klart, at vandrende funktionalitet opretholdes i denne subpopulation. En bredere anvendelse kunne være at afprøve virkningerne af forskellige koncentrationer af midler eller lægemidler, der kan påvirke ikke-klæbende immuncellemigrering. Også, kan andre hæmatopoietiske celler testes for mobilitet på forskellige substrater eller adhærente celler afledt fra normalt væv. Endelig, selv om det ikke er gjort her, såning en kombination af adhærente celletyper, dvs. stromale celler eller dendritiske celler med tumor, kan tilvejebringe analyser reflekterende af mere komplekse in vivo miljøer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Delvist understøttet af NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Grant Number UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, og Joan S. Holmes Memorial Research Fund. MJH og GCO modtaget støttet fra Joan S. Holmes Memorial Postdoc Fellowship på UCLA. CSM-enheden blev opnået fra Creative videnskabelige metoder: www.creative-sci.com. Lentivirusvektoren blev modtaget fra UCLA Vector Core, som støttes af CURE / P30 DK041301.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μl Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μl Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
- Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
- Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
- Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. Determinants of human astrocytoma migration. Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).
- Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
- Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
- Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
- Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
- Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
- Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
- Prevention, C. fD. C. a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5 edn, Health and Human Services. (2009).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
- Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
- Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).
