Abstract
우리는 먼저 형광 표지 된, 비 - 부착 인간 또는 뮤린 효과기 면역 세포의 운동성을 측정하기 위해, 세포 외 기질 단백질에 부착 된 종양 세포의 반경 방향 이동을 측정하는 것으로보고, 방사형 단층 세포 이동 분석법 신규 적응을보고한다. 이 기술은 스테인리스 매니 폴드 10 웰 테플론 슬라이드 국소 적 융합 성 종양 세포 단층 또는 세포 외 기질 단백질로 제조 중 웰로 미부착 된 T 세포를 증착하기 위해 사용한다. 광 및 / 또는 다 채널 형광 현미경은 시간이 지남에 이펙터 세포의 이동 및 동작을 추적하는 데 사용된다. 형광 염료 및 / 또는 형광 유전자에 대한 코드가 차등 이미징 세포 유형에 라벨을 사용하는 바이러스 벡터. 이 방법은 슬라이드 챔버, 한천 또는 트랜스 웰 플레이트를 이용하여 수평 또는 수직 마이그레이션 / 침략을 추적 체외 분석에서 비슷한 유형 구별된다. 분석은 상세한 영상 데이터가 ㄱ 할 수 있습니다특정 형광 마커에 의해 구별 다른 종류의 세포로 수집 된 전자; 세포의 경우에도 특정 하위 집단 (즉, nontransduced / 형질)을 모니터링 할 수 있습니다. 표면 강도 형광 플롯 이주 셀 타입에 대응하는 특정 형광 채널을 이용하여 생성된다. 이것은 특정 시간에 비 부착 면역 세포 이동의 더 나은 시각화 할 수 있습니다. 그것은뿐만 아니라, 세포를 대상으로 같은 세포 독성 또는 이펙터에서 바이러스 벡터의 전송과 같은 다른 이펙터 세포 기능의 증거를 수집 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 연구자들이 다양한 유형의 미시적 부착 세포 차분 적 표지 된, 비 - 부착의 세포 간 상호 작용을 기록 할 수있다. 이러한 정보는 기능의 시각적 증거가 암 치료를위한 이들의 사용 전에 종양 표적 세포에 요구되는 생물학적 활성 또는 조작 면역 세포 유형의 평가에 특히 적합 할 수있다.
Introduction
방사형 단층 세포 이동 분석은 원래 세포 외 기질 (ECM) 단백질 5-7 또는 피브로넥틴 또는 라미닌 1,2- 개별 ECM 성분으로 코팅 된 슬라이드 부착 성 종양 세포의 1-4 침윤성 특성을 측정하기 위해 개발되었다. 기술은 스테인레스 스틸 셀 침강 매니 폴드 (CSM)을 사용하여 웰의 중심에 종양 세포의 단일 세포 현탁액을 시딩 관여. 침전 후, 종양 세포는 수평 운동의 속도를 설정하는 데 사용 된 시간과 웰 위에 초기 세포 집단의 직경 변화의 하단에 부착된다. 방사형 단층 세포 이동 분석은 세포의 체외 철새 능력을 분석하는 트랜스 웰 플레이트를 채용 기존의 방법에 비해 시각적 인 장점을 제공; 이러한 분석은 촬상 8 비 이바지. 뿐만 아니라, 또한 평가시기를 선택하는 자유도 다량 구비마이그레이션, 평가된다 시점들의 수에 제한이없는 연구자가 침전 후 이미지를 선택할 수있을 때에요.
이동하는 능력이 특히 그들은 바이러스 벡터에 대한 전달 비히클로서 사용될 수있다 면역 또는 여기서의 영역에서, 비 - 부착 세포에 중요한 기능을하기 때문에, 우리는 미부착 된 세포의 이동을 평가하기 CSM의 사용을 채택 종양 세포 단층상의 종류, ECM 단백질 이외에. 현미경, 또는 개별 ECM 구성 요소에 종양에서 고립 복잡한 ECM에, 가능한 종양 세포 단일 층에 비 부착 세포의 이동을 시각화의 추가 혜택이 분석은 다양한 있습니다. 하나의 세포 외 단백질로 코팅 우물을 사용하는 분석은 정확하게 세포가 생체 내에서를 통해 마이그레이션 것 ECM 조직 기판 또는 종양을 반영하지 않습니다.
여기서 우리는 주요 histocomp 민감 alloreactive 세포 독성 T 림프구 (alloCTL)를 사용우리의 대표적인 비 - 부착 세포 유형으로, 단방향 혼합 림프구 종양 세포 반응 (MLTR) 또는 혼합 림프구 반응 (MLR)을 사용하여 구 atibility 복합체 (MHC) 단백질. 우리는 모두 인간과 쥐 기원의 세포를 시험했다. 마이그레이션 종양 단층을 측정 한 결과, 고용 종양 세포가 부분적으로 관련 대상 MHC 분자의 전체 세트와 이펙터, 또는 완전히 관련 목표를 감작하는 데 사용되는 세포 집단에서 발견 동일한 MHC 단백질의 일부를 표시되었는지 이펙터를 향해 민감했다. 일부 실험에서, 우리는 이펙터와 대상 세포를 구분하는 형광 CellTracker 레드 CMPTX 또는 세포 증식 염료 eFluor (670)을 사용했다. 또한 세포를 시각화하는 추가적인 방법으로 형광 단백질 바이러스 벡터로 형질 도입 인코딩을 사용했다. 특정 분석을 위해, 우리는 에메랄드 그린 (EMD) 형광 단백질 (10, 11)을 코딩하는 레트로 바이러스 복제 벡터 (RRV)로 alloCTL를 형질 도입; OTH에 대한ERS 종양 세포 mStrawberry 코딩하는 렌티 바이러스 벡터로 형질 도입 하였다.
alloCTL 종양 세포 단층에서 수확 종양 세포 단층 또는 ECM 하나의 중심으로 매니 폴드의 채널을 통해 접종 하였다. 점착성 및 비 점착성 세포 상호 작용에 의해 빛 및 / 또는 시간에 따른 형광 현미경에 의해 가시화 하였다. 고전력 파편과 핵 저전력 종양 세포 단일 층 붕괴, 또는 종양 세포는 각각 분해 및 아폽토시스에 의한 세포 손상의 지표였다. 우리는 디지털 단층 배양 위에 미부착 된 형광 T 세포의 이동을 나타내는 표면 형광 세기 맵을 생성. 우리는 또한 세포 독성이 포개어 미부착 alloCTL의 클러스터 형성 후 부착 신경 교종 세포 단층에 생기게 언급. 뿐만 아니라, 신경 교종 단층에 alloCTL에서 RRV-EMD의 수평 전달이 관찰되었다.
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Protocol
1. 슬라이드 준비
- 멸균 파우치에 휴대 침전 매니 폴드 슬라이드를 삽입하고 오토 클레이브 테이프로 밀봉. 봉지의 종이 측 플라스틱 웰에 침착을 방지하기 위해 슬라이드 테프론 코팅면에 직면한다.
- 121 ℃에서 15 분간 멸균 파우치.
- 멸균 150 X 15mm 멸균 페트리 접시에 바이오 안전성 캐비닛과 장소 내부 살균 주머니에서 슬라이드를 제거합니다. 네 개의 슬라이드까지 접시 당에 맞게 할 수 있습니다. 슬라이드 옆에 35 X 10mm 페트리 접시를 놓습니다. 가습을 제공하기 위해 멸균 H 2 O의 2-3 ML을 추가합니다.
- 물론 전체를 커버하기에 충분한 양을 사용하여 100 ㎍ / ㎖의에 폴리 D 리신으로 미리 코팅 슬라이드. RT 이상의 시간 후, 용액을 흡인하고, 웰의 표면 위에 1X PBS 피펫 팅하여 잘 배의 표면을 헹군다.
- 선택적으로, 더 강한 종양 세포 부착을 위해 피브로넥틴 또는 다른 ECM 성분을 추가한다. 충분한 볼륨 그쪽에서 5 ㎍ / ㎖의에서 피브로넥틴 추가웰 T RT에서 단시간 내에 건조하지 않습니다.
- 1 시간 후, 남아있는 솔루션을 대기음 1X PBS와 피펫 팅에 의해 아래로 두 번 씻는다.
- 종양이 도금을위한 준비가 될 때까지 우물에 PBS를 유지합니다. 사용 당일 슬라이드.
- 원하는 점착성 종양 세포 유형의 융합 플라스크 수확. 적절히 완충 성장 매체 - 예를 들어 5 × 106 세포 / ml의 광 현미경 resuspend에 의해 트립 판 블루 염색 배제를 사용하여 생존 세포를 세어, 둘 베코 최소 필수 배지, 10 % 소 태아 혈청 (DMEM) (FBS), L- 글루타민 및 피루브산 나트륨.
- 부착 성 세포 집단의 형광 영상을 원하는 경우, 중요한 형광 염료 또는 제조사에 의해 제공된 프로토콜에 따라 세포 증식 염료 부착 세포 집단 레이블.
- 부드럽게 아에 거품을 만들지 않도록하기 위해 슬라이드 돌보는의 각 웰에 전체 매체의 10 μl를 피펫LS, 다음과 같이 균일 한 종양 세포의 부착을 방지 할 수 있습니다.
- 각 웰 (그림 1A)의 매체에 2.5-5.0 × 10 4 세포 (세포 현탁액의 5 ~ 10 μL)를 추가합니다. 종양 세포 유형의 성장 및 바람직한 일 수에 따라 최적의 수를 조정한다. 큰 종양 세포 또는 빠르게 성장하는 세포는 처음에는 적은 수의 세포를 필요로 할 수있다. 세포의 균일 한 분포를 확인하기 위해 위 아래로 중간 피펫을 추가하여 40 μL까지 잘 볼륨을 가져와.
- 모든 웰은 시딩 한 후, 종양 세포는 그 후, 실온에서 접착 배치 뚜껑을 150 X 15mm 페트리 접시에 조심스럽게 최소 24 시간 동안 37 ℃ / 5 % CO 2 가습 인큐베이터 접시를 이동할 수있다.
- 매일 문화 매체를 변경합니다. 조심스럽게 단층에서 소비 된 매체의 일부를 피펫 신선한 완전 배지로 교체합니다.
참고 : 증발하기 때문에, 더 볼륨을 꺼내어보다 추가해야합니다. 웰스 분석을위한 준비가되어있을 때조차, confl세포의 uent 층이 존재한다. 이 1~3일 초기 시딩 후 일반적이다. - 단계 1.4에서 설명하고 단일 층이 요구되는 경우 2 단계로 진행, 또는 단일 층에서 ECM 단백질을 추출 아래 1.13 단계 중 하나로 PBS로 가볍게 한 번 단층을 씻으십시오.
- 완전 배지에서 0.5 % 트리톤 X (v / v)의 솔루션을 확인하고 각 웰에 30 μl를 추가합니다. 단분자막이어서, 2 분 동안 후드 다이제스트 전술 한 바와 같이 피펫 팅 완전 배지로 두 번 세척하자.
참고 : ECM 층은 광학 현미경 (그림 2)로 표시 될 수 있습니다. 바로 슬라이드를 사용하거나 1-2일의 가습 CO 2 배양기에서 완전한 매체에 보관하십시오. 우물이 건조 할 수 없습니다.
슬라이드에 미부착 된 T 세포의 침강 2.
- 미부착 된 세포 집단의 형광 이미징이 요구되는 경우, 이러한 CFSE, 셀 트랙커 레드 CMPTX 또는 eFluor 같은 중요한 형광 염료 미부착 된 세포 집단을, 레이블분석에 앞서 제조에서 1 시간 이상에 의해 제공된 프로토콜에 따라 670. 대안으로, 바이러스 벡터에 의해 코딩되는 형광 단백질을 발현하는 세포를 조작.
- 상기 1.2에 기재된 바와 같이 오토 클레이브 파우치 셀 침강 매니 폴드를 압력솥.
- 생물 안전 캐비닛의 보육과 장소에서 테프론 코팅 된 슬라이드를 포함하는 가습 실을 제거합니다.
- 피펫 팅에 의해 1X PBS로 우물을 세척하고 아래로, 다음 10 % 이상 혈청을 포함하는 완전한 매체의 45 μl를 추가합니다.
- 살균 봉투로부터 매니 폴드를 조심스럽게 제거하고 슬라이드 (도 1b)의 바닥에 닿을 매니 폴드의 끝에 '후크'까지 웰 위에 미끄러.
- 배지는 각 채널에서 볼 수 있는지 확인하십시오. 아무 것도 볼 수없는 경우, 매니 폴드를 벗고 잘 대응에 더 많은 매체를 추가 한 다음 교체하고 다시 확인합니다.
- 각 짱 단계를 반복 2.5에 채널 매니 폴드의, 또는 많은 우물을 위해 원하는대로.
- 아니 이하 / 5 10 × 1.0 ~ 2.0보다 μL에서 비 부착 세포에 resuspend를 계산합니다. 세포의 1 μl를 작성하여 천천히 채널 (그림 1C)로 피펫. 물론 원하는 각각에 대해이 작업을 수행합니다.
- 채널의 세포가 정착 할 수 있도록 20 ~ 30 분 동안 바이오 후드 안쪽 즉, 매니 폴드와 슬라이드 전체 셀로드 장치를, 두십시오.
- 국소 적 우물 (그림 1D)의 중심에 놓는 세포를 방해하지 않도록 슬라이드에서 바로 들어 올려 부드럽게 양쪽 끝을 터치에 의해 매니 폴드를 제거합니다.
- 비 접착 세포가 성공적으로 잘 매니 폴드 채널의 원주 내에 머무르는 중심 시딩 된되도록 각 웰을 검사한다. 비 - 부착 세포는 이상적으로 약간 부드럽게 따라서 셀 PELLE 발생하지 않습니다 주위 슬라이드 이동, 단층 또는 ECM으로 서로 부착된다t은 분산합니다. 슬라이드를 밀다하지 마십시오.
3. 형광 현미경
- 침강 확인 후 적절한 실험 장비, 영상을 수행합니다. 이상적으로, CO 2 및 습도 챔버가 장착되어 현미경을 사용합니다. 웰의 전체가 볼 수 있도록 여러 개의 이미지를 허용하는 낮은 전력, 즉 4X 또는 10X, 이미지에 더 큰 영역으로 채취한다.
- 촬상 소프트웨어를 이용하여 디지털 이미지를 획득. 명 시야 및 / 또는 다 채널 형광 이미징을 수행한다.
- 원하는 경우, 특정 영역에 서로 다른 채널의 이미지를 촬영하거나, 또는 가습 슬라이드를 유지하고 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에서 수동으로 (원하는 시점에서 이미지에 그림을 취할 시간 경과를 설정 더 이상 시간 지점에 권장 1E & F).
4. 분석 및 디스플레이
- 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 광 및 FL 병합그래서 하나의 층에 여러 종류의 세포 및 마크로 uorescent 이미지는 동일한 이미지를 볼 수있다. 드래그 앤 각 개별 프로그램에 색상과 메시지가 표시되면, 여러 레이어와 이미지 파일을 만들 수있는 '레이어를 추가'옵션을 선택에 대한 이미지 파일을 삭제합니다.
- 높은 배율에서 취할 정렬하고 디지털 함께 잘에서 이미지 만들기. 두 이미지 사이의 보존 된 지역보고 완전한 그림이 생성 될 때까지 다른 상단에 하나의 이미지를 오버레이하여 파일을 맞 춥니 다.
- 각각의 세포가 마이그레이션 한 거리를 결정 캡처 소프트웨어를 사용하여 수집하는 동안 이미지 미크론 막대를 추가합니다.
- 다양한 시간에 세포 이동을 결정 형광 T 세포 응집 또는 시간에 걸쳐 정량화, 즉 이미지 소프트웨어, ImageJ에 의해 표면 강도 형광을지도한다.
- 표면 플롯을 생성하는 단계 4.1 및 레이어 창에서 생성 된 레이어 이미지를 촬영하기 위해,원하는 채널에 해당하는 제외한 모든 레이어를 선택 취소합니다. 표면 그림이 EMD 발현을 시각화하고자하는 경우, 예를 들어,이 마커에 사용될 필터에 대응하는 전용 "녹색"층을 보여야한다.
- 이미지를 평평하게하고 프로그램으로 이미지를 (예를 들어, .png를) 인식 할 수있는 파일 형식으로 저장 및로드합니다. 표면 플롯을 생성하기 위해, 8 비트에 이미지 형식을 변경 배경을 줄이기 위해 필요에 따라 밝기 / 명암을 변경하고 '/ 표면 플롯 분석'옵션을 선택합니다. 그림 5의 이미지는 '그늘', '축 그리기', '하나의 다각형 당 선'과 '부드러운'체크 박스를 선택하여 생성되었다.
- 대안 적으로, 시간 제로 초점 셀로부터 입금 반경 또는 직경을 측정 할 그리고 상이한 시간 시점에서 최 세포에 비교한다. 테프론 웰의 직경은 6.0 mm이다.
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Representative Results
형광 단백질 코딩하는 바이러스 벡터는, 또는 그 대신에 형광 염료의에 더하여 사용될 수있다. 바이러스 형질 도입은 운동성 분석에 앞서 수행되어야한다. 두 점착성 및 비 점착성 세포 유형 차등하게 표지 될 수있다. 전달을위한 프로토콜을 이용할 벡터의 종류에 따라 달라질 것이다. 여기서, 우리는 (12)을 설명하는 프로토콜을 사용하는 분석에 앞서도 RRV EMD-3, 5, 6, 적어도 이틀 alloCTL를 형질 도입. 또한 mStrawberry 적색 형광 단백질 (도 4)을 표현하는 종양 세포를 형질 도입하기 위해, 렌티 바이러스 벡터, CMV-IRES-딸기 FLUC2을 사용했다. 이 형질 도입 지점은, 신선한 배지를 첨가 한 48 시간 동안 세포를 플라스크에 벡터를 가산함으로써 달성 하였다. 제한 희석, 세포 이틀 동안 회복시킨 후 100 % 형질 도입 된 세포 집단을 생성하기 위해 수행 하였다.
(도 3 및도 5). 형광 현미경 처음 웰의 중앙에 놓는 세포, 시간이 지남에 따라 중심으로부터 멀리 이동 나타낸다. alloCTL의 형성은 4 시간 (도 3에 흰색 화살표) 활성화 T 세포의 집단 (13) IL-2 생성에 의해 나타나는자가 분비 성장 패턴의 가능성이 반사 된 후 합산.
또 다른 실험에서, 쥐의 이펙터 alloCTL은 B6C3F1 마우스에서 일배 체형 H-2D의 Balb / C 응답자 비장 세포 및 일배 체형의 H-2B / K 자극 비장 세포를 이용하여 편도 MLR하여 TU-2449 신경 교종은 동계되는 부담을 만들었다. 즉시 t의 채널을 통해 파종 전에그 종양 세포 단층 상에 매니 폴드 alloCTL가 eFluor 670 alloCTL (퍼플 세포)으로 염색 하였다 100 %가 CMV-Straw- 형질이었다 TU-2449 신경 교종 세포 (적색)의 확립 된 단층의 중심으로 시딩 하였다 IRES-FLUC2 바이러스 벡터, 우물에 도금 그림 4C와 D가 디지털화 보라색 형광을 변환 ImageJ에를 사용하여 생성되기 전에 분석. 일 및 48 시간에 같은 잘 같은 사분면의 촬영. 그림 4A 및 B 쇼 현미경 이미지 일 입체 형식으로 표시됩니다 양적 표면 플롯에 강도.
마지막으로, 인간 alloCTL는 MLTR 의해 전이성 유방암 세포주 MDA-MB-231BR 유래의 불활 자극기 인간 뇌 트로픽 세포로 만들었다. 부분적 미부착 CMPTX - 표지 alloCTL의 시간에 대한 빛과 형광 현미경 이미지를 도시 도표 6 , RRV-EMD 형질 f를 추출 ECM 단백질에 마이그레이션그 종양 세포를 ROM. (A)에서 밝은 필드 현미경 즉시 침전 후 alloCTL의 초점 위치를 보여줍니다. (B 및 F)에 명 시야 현미경은 4 및 8 시간에, 각각이 반경 방향 alloCTL ECM에 마이그레이션 나타낸다. alloCTL 밀도가 잘의 중심으로부터의 거리에 따라 감소 (잘 센터는 BI 필드의 왼쪽 상단 모서리입니다). 패널 (C와 G) 쇼 CMTPX 염색 전체 alloCTL 준비 (D 및 H)이 (E 및 I) EMD + T 세포의 작은 숫자로 표시된 바와 같이 RRV-EMD와 alloCTL의 부분적인 전달을 보여주고, RRV-EMD의 병합 된 이미지를 표시는 alloCTL를 형질 도입 untransduced alloCTL와 함께 ECM에 마이그레이션.
도 2. 종양 세포 단층 및 ECM은 CSM 슬라이드 웰에 플레이 팅. 슬라이드 우물의 현미경 사진을 준비쿠마시 블루 염색으로 염색 합류 U-87MG로부터 추출 (A)의 합류 U-87MG 교종 세포 단층, 또는 (B)와 ECM 단백질. 바 = 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 마이그레이션 및 중앙 RRV-EMD 형질 림프구의 세포 독성과 시간이 지남에 따라 세포 예금의 첨단. 선단에 부착하는 U-87MG 교종 세포의 단층에 침강 다음 alloCTL-RRV-EMD의 중심에 다양한 시간에 촬영 한 형광 현미경 사진. 하나의 세포가, 배치의 4 시간 (흰색 화살표) 내에서 구형 클러스터를 형성로 이펙터 alloCTL 시드. 단일 형광 표지 된 CTL은 웰의 중심으로부터 이주의 시간이 진행된다. 24 시간 후, 부착 세포 단층에 빈 패치 아마도 종양 표적 세포의 세포 용해를 alloCTL (대시 내의 영역을 참조)에 의한 표시이다. 바 = 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 1 및 48 시간에서 도시 mStrawberry 표지 된 신경 교종 세포에 eFluor 670 물들 뮤린 alloCTL 그림 4. 방사형 이주. (A), 1 시간 및 (B) 형광 물질의 침강 이후에 48 시간의 동일한 웰의 사분면의 형광 현미경 사진 TU-2449 신경 교종 세포의 단일 층 상에 비 점착성을 alloCTL - 표지. 저전력 현미경 사진은 하나의 사분면 CSM 웰 (반경 3mm) 내에 포함 된 영역을 반영한다. 높은 전력 (A와 B 세트)여보세요에서CTL (흰색 화살표)에 근접에 표시 또는 개별 종양 세포와 관련된; 하나는 단편화 된 핵으로 분해 된 모습을 가지며 사멸이다. (C 및 D) 각각의 표면 강도 형광 맵 입체 도형에서 디지털화 보라색 형광 화상의 화소 값을 도시 ImageJ에 소프트웨어를 이용하여 획득하고 잘 반경을 나타내는 격자에 배치 3mm의. 바 = 500 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
alloCTL 및 종양 세포에 형질 도입 alloCTL에서 RRV-EMD의 수평 확산 그림 5. 마이그레이션. 형광 현미경 직렬 잘 사용하는 이미지 편집 소프트웨어의 반경을 충당하기 위해 함께 물렸다. RRV-EMD의 마이그레이션 형질alloCTL (흰색 화살표)가 침강 0 다음 72 시간을 연속적으로 U-87MG 종양 세포의 단층에 도시된다. 단층에서 종양 세포의 RRV-EMD 전달은 종양 세포 림프구에서 감염성 RRV 가로 송신 (흰색 상자 및 인셋)에 발생했음을 나타내는 EMD 형질 alloCTL 첨가 한 다음 72 시간에서도 명백하다. 바 = 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
alloCTL 그림 6. 방사형 마이그레이션 RRV-EMD 형질과 CellTracker 레드 CMTPX로 염색. 세포는 MDA-MB-231BR 세포 유래의 추출물 ECM에 침강 하였다. alloCTL의 마이그레이션이 0, 4 및 8 시간에 시야 광학 현미경에 의해 촬영 된 (A, B, F를 각각 열 1). FluoreCMPTX (빨간색)의 향기 이미지 alloCTL (C, G, 2 열) 표시, RRV-EMD (녹색) alloCTL (D, H, 3 열) 및 병합 된 이미지 (E, I는, 열 4) 아르는 형질 4, 8 시간에 표시. 바는 200 μm의 =; 바 이미지의 CI에 적용 B에 표시된. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
단일 세포 현탁액 중의 종양 세포는 테프론 마스크 슬라이드의 웰에 피펫 팅 하였다. 세포가 접착 가능하고 가습 된 5 % CO 2, 37 ℃ 배양기 (도 1a)에 단분자층을 형성 하였다. 단일 층에서 파생 설립 된 단일 층 또는 ECM 단백질은 이러한 분석 (그림 1B) 수확 할 수있다. EMD를 코딩하는 벡터로 중요한 형광 염료로 표지 또는 형질 이펙터 T 림프구 웰을 사용 CSM의 중심으로 시딩 하였다. 시간에 따른 단층 또는 ECM 단백질에 마이그레이션하는 미부착 된 효과기 T 림프구의 능력을 평가하고 그 다음 빛과 형광 현미경으로 정량 하였다. 여기서는 부분적으로 중요한 표적 U-87MG 교종 세포의 단층에 미부착 alloCTL 이펙터의 이동 및 세포 독성을 평가 하였다 (도 3 및도 5). 오직 인간 백혈구 항원의 일부를 표시하는이 표적 세포,원래 자극에서 볼 (HLA) 분자 (HLA-A2, B44)은, 관련 13-06-MG의 표적 세포 (HLA-B44에 A1,2과 alloCTL 의해 표시되는 유력한 용균 활성을 줄이기 위해 사용되었다 , 57). 또한 MDA-MB-231BR 유방 종양 세포의 단층 (도 6)에서 수확 된 ECM에 alloCTL의 이동성을 관찰했다. alloCTL 이전 9 게시 된 방법에 따라 단방향 MLTR에 의해 생성되었다. 이펙터 alloCTL 단방향 MLTR 후 4~5일 수확 (그림 3과 5) 또는 RRV-ACE-EMD (그림 6) 10, 11 RRV-GS4-EMD 형질 도입되었다. 높은 전달 수준은 amphotropic ACE 벡터보다 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 봉투를 사용 GS4 벡터를 달성했다. 이 방사형 마이그레이션 분석을 사용하여, 우리는 모두가 형질 도입과 형광 표지 alloCTL는 철새 용량을했다 nontransduced 지적했다. 또한 그들이 CYT 할 수있는 능력을 보유 함을 입증RRV 전달에 대한 조작을받은 후 otoxic.
쥐 alloCTL의 능력은 또한 (그림 4)을 평가 하였다 마이그레이션하려면. alloCTL TU-2449 세포에 의해 표시 일배 체형 H-2B / K 민감는 (보라색) eFluor (670)로 염색하고 마이그레이션 분석은 CMV-짚 IRES-FLUC2 (빨간색)으로 형질 TU-2449을 사용하여 수행 하였다. 완전히 관련 타겟을 사용하는 경우, alloCTL 이펙터 세포의 낮은 숫자는 종양 세포 표적의 신속한 용해를 방지하기 위해 시딩 하였다. 기준으로 1 시간을 사용하여, T 세포는 주로 단일 세포 현탁액 웰의 중심에 고밀도로 지역화. 48 시간 현미경 사진 초기 기탁 부위에서 종양 세포의 파괴 명백하다 웰 alloCTL 클러스터링의 외연을 향하여 T 세포의 광범위한 이동을 보여준다. TU-2449 세포의 증식 레이블 세포가 잘 통해 밀도 증가 mStrawberry로 입증된다. 이것은 더 나은 표면에서 볼 수있다우물에서 보라색 세포 (그림 4, 하단 패널)의 분포를 시각화하기 위해 생성 된 형광 플롯. AlloCTL 이동성이 훨씬 더 분명 1 시간 기준에 비해 48 시간에서 잘입니다. 인간 alloCTL 및 신경 교종 세포를 이용한 분석에서 관찰되었다 것과 유사한, 이펙터 초기 예금 영역 주위 종양 세포의 간극은 종양 표적 세포의 용해를 제안, 48 시간에서 주목할 만하다.
이 분석에서 중요한 단계 건강 단층과 '골격'ECM 이후 수확의 성장이다. 2.5에서의 종양 세포의 파종 - 1.9 상기 단계에있어서, 웰 당 5.0 × 104 세포는 일반적으로 우리가 사용하는 종양 세포 유형에도 대략 단분자층 결과. 우리는, 종양 세포는 실온에서 접착 할 수 있도록하는 것이 중요 웰의 중심을 향해 밀어 버린다 세포의 37 ° C에서 발생 달리 대류 알았다. 우물 위스콘신의뿐만 아니라, 사전 코팅제 폴리 D 라이신 및 / 또는 크게 성공률을 높일 수 콜라겐이나 피브로넥틴 등의 ECM 단백질. 또한, 우리는 훨씬 더 신뢰할 수있는 입증 개별 ECM 구성 요소 (예 :., 피브로넥틴, 콜라겐)보다 단층 파생 된 '골격'ECM을 사용하여 이러한 분석과 더 나은 성공을 거두었 다. 그것뿐만 아니라 침강 매니 폴드를 통해 증착하기 위해 비 부착 성 세포의 수를 실험하는 것이 중요하고, 순수한 세포 유형을 사용하는 경우, 하나의 이론적이 분석과 운동성 계수를 정의 할 수있을 것이다. 또한 볼륨이 작고, 매체의 일부를 증발이 발생하기 때문에, 단층 신선한 배지로 매일 보충 할 필요가있다. 미디어 교체는 독성 젖산의 축적 세포가 성장과 분열을 방지 할 수 있습니다. 건강한 단층을 배양하지 않으면 잘 표면에서 단일 층 또는 ECM 흘림이 발생할 수 있습니다.
U-87MG 신경 교종 세포 리에서 유래 코마 푸른 스테인드 ECM 단백질NE 상술 트리톤 X-100 (도 1b)로 소화 한 후 남겨진 접착 기재 층의 시각적 예로서 도시 1.13 단계에있어서. 유방암 세포주에서 생산 ECM, MDA-MB-231BR 세포는 종종 불완전하게 접착하고 때로는 분석 중에 슬라이드로부터 들렸다 ECM 층의 결과와 고르지 얇았다. 종양 세포가 소화하기 전에 1~2일 위해 합류 단층으로 유지 될 때 슬라이드에 ECM 단백질 준수 향상. 과정을 통해 잘 주변 테프론 씰의 유지 보수도 중요했다. 낮은 볼륨을 유지하고 트리톤 X100 용액을 테프론 노출을 최소화하는 테플론 시일의 무결성의 손상을 완화.
이 프로토콜의 한 적응 간섭 단층 포함 된 종양 조직 (14)의 섹션에서 수확 삼차원 세포 외 기질의 사용 될 수 있습니다. 그러나, 유의할 점 평면으로부터 거리 BOTT슬라이드면에 잘의 Omed은 1mm이고; 따라서,이 두께를 초과하는 부분은 매니 폴드 배치에 의해 중단 될 수 있습니다. 또한, 방법은 비 - 부착 세포를 함유하는 배지의 액 적을 수용하는 조직에 약간의 버 홀을 만들기위한 고안 될 필요가있다.
침전 미리 효과기 T 림프구 잘 분산 단일 세포 현탁액의 제조는 필수적이었다. 단일 세포 현탁액 응집체를 분산시키기 미부착 T 세포의 부드러운 tituration 바로 CSM의 채널로 alloCTL 넣기 전에 필수적인 단계이다. 필요한 경우, 비 - 효소 세포 분리 버퍼의 사용이 채용되어야한다. 위의 단계 2.8에 기재된 바와 같이, 침전조가 2.0 × 105 세포 / μL - 또한, 효과기 림프구의 밀도는 약 1.0이어야한다. 높은 휴대 번호를 이동할 때 방해가 용이 한 큰 보증금을 일으킬 수있는 반면 낮은 세포 수는없는 침전이 발생할 수 있습니다밀어 넣습니다. 또한 매체에있어서 혈청 농도가 유출의 가능성을 줄여 충분한 양의 메 니스 커스의 표면 장력을 제공하도록 적어도 10 % 인 것이 권장된다.
형광 이미징 기능과 4 배 또는 10 배 목표와 거꾸로 광학 현미경은이 분석에 최적입니다. 이미징을위한 시점은 개별 실험 문의 및 세포 종류에 따라 결정될 수있다. 특히 비 - 부착 세포는 CTL 단층 (12-72 시간)보다 위에 ECM 단백질 (4-8 시간)에 대한 신속 웰의 방향으로 향하여 침강의 중심으로부터 이동한다. 부분적으로 MHC 관련 표적 세포는 운동의 시각화를 격려하고 중요한 마이그레이션이 발생하기 전에 단일 층의 세포 매개 세포 장애를 줄이기 위해 우리의 alloCTL 분석을위한 관련 목표에 바람직했다; 비는 또한 용해 속도가 느려 대상으로 낮은 이펙터의 사용합니다. 부분적 매칭 대상의 사용은 더 나은 시각화 RRV 허용뿐만 아니라 종양 세포로의 전송.
도립 현미경의 사용은 직립 범위 위에 여러 장점을 제공한다. 슬라이드는 세포 멸균 환경을 유지하면서, 방해하지 않도록 반전 범위 가습 챔버를 통해 촬상을 허용한다. 또한, 챔버를 통해 이미징은 인간 유래 조직 15로 작업 할 때 바이오 안전성 레벨 II (BSL II) 가이드 라인을 준수 허용, 시편와 기술자 사이에 장벽을 제공합니다.
수직 범위를 사용하는 경우, 우물 정 메 니스 커스를 방해하지 않고 달성 할 수있는 최대 배율은 20 배이다. 메 니스 커스의 중단은 일반적으로 잘 걸쳐 침전 된 비 부착 세포의 확산을 초래 불행하게도, 커버 슬립, 또는 셀 침강 매니 폴드에 광학 키트 액세서리의 사용은 권장되지 않습니다. 오랜 기간 동안 영상은 의대의주의 또한 필요할 수 있습니다이 시간 경과 이미징 동안 필요한 될 가능성이 있지만, 그 증발 손실 교체 각 웰에 IUM.
이 프로토콜은 Zigmond 챔버 (16, 17)에 부착 세포 가로 세포 이동을 측정하는 방법과 구별되는, 설계는 미부착 된 세포 이동의 시각화를 허용하지 않을 것이다. 한천 등의 기판을 통해 화성 구배 방향으로 수평 이동을 평가하는 다른 분석은 일반적으로 하나의 세포 유형 18 ~ 20의 이동을 연구하는 데 사용됩니다. CSM의 사용은 여러 이러한 방법에 대한 장점뿐만 아니라 보이든 챔버 또는 마트 리겔 트랜스 웰 플레이트에서 배양 한 세포의 수직 이동 / 침략을 측정하는 방법을 제공합니다. 첫째, 세포 - 세포 접촉 이펙터 세포에 의한 대상 이펙터 세포 상호 작용과 부상의 결정 수 있습니다. 처음에 파트 1 자극기 13-06-MG 종양 세포 단방향 MLTR 자극 alloCTL-RRV-EMD의 세포 용해 능력아군 MHC 정합 U-87MG 세포주 침강 다음 24 및 72 시간에 단층의 중심에 분명하다 (도 3 및도 5에서, 점선). 뿐만 아니라, 쥐 alloCTL에 의해 TU-2449 세포의 저하는 48 시간 후 - 침전 (그림 4)에서 볼 수 있습니다. 단층은 alloCTL 예금의 중심에 말소,하지만 인간의 세포 (21) 또는 저와 분석에서 13-06-MG와 U-87MG의 HLA 식에 오버랩를 때문에, 단일 층의 나머지 부분에 걸쳐 서서히 발생합니다 뮤린 신경 교종에 대한 이펙터 세포 수를 시작. 이펙터 멀리 침전 사이트에서 마이그레이션 alloCTL으로 또한, 밀도를 대상으로 이펙터이 감소된다. 마이그레이션 및 세포 용해에 더하여,이 프로토콜은 바이러스 인코딩 형광 단백질의 전달을 시각화하기 위해 사용될 수있다. 여기서, 종양 세포에 대한 alloCTL에서 EMD RRV 부호화 전송은 72 시간 (도 5, 인셋) 후에 명백하다.
이 모델의 한계는 마이그레이션은 생체 내 이동의 진정한 반사되지 않을 수 있습니다 체외에서 평가 될 수 있다는 것이다. 또 다른 제한은 케모카인 / 케모카인 수용체 구배 모델을 사용하여 확립 될 수 없다는 것이다. ECM 또는 개별 종양 세포와 면역 세포의 상호 작용은 여전히 발생하고 따라 그 세포가 분비 무엇이나,이 운동의 엉덩이를 표현할 수 있지만님이 비 부착 세포가 떨어져 고립 된 요소에서 특별히 마이그레이션 또는 여부에 대한 질문에 대답하지 않을 것이다.
이 분석의 장점은 림프구하거나 형질 도입되지 않은 경우 비 부착 세포의 인구가 철새 기능을 유지하는지 확인하는 기능입니다. 이 예에서, 형질 아군 EMD 단백질 발현을 통해 표시이며, 이동성 기능이 모집단에서 유지 분명하다. 넓은 애플리케이션은 미부착 된 면역 세포의 이동에 영향을 줄 수있는 제제 또는 약물의 다양한 농도의 효과를 테스트 할 수 있습니다. 또한, 다른 조혈 세포는 다양한 기판 또는 정상 조직에서 파생 된 부착 세포의 이동성을 테스트 할 수 있습니다. 이를 제공 할 수있다, 즉, 부착 성 세포 유형, 간질 세포 또는 종양 세포의 수지상 조합 시드, 여기 수행되지 않는다 마지막으로, 생체 내 환경에서의 반사보다 복잡한 분석.
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Acknowledgments
NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI 허가 번호 UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, 그리고 조안 S. 홈즈 기념 연구 기금에 의해 부분적으로 지원됩니다. MJH와 GCO는 UCLA에서 조안 S. 홈즈 기념 박사후 원정대에서 지원 받았다. CSM 장치는 창조적 인 과학적인 방법에서 얻은 : www.creative-sci.com. 렌티 바이러스 벡터는 CURE / P30의 DK041301 지원하는 UCLA 벡터 코어에서 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μl Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μl Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
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