Abstract
Relatamos uma nova adaptação do ensaio de migração celular radial monocamada, relatada pela primeira vez para medir a migração radial das células tumorais aderentes em proteínas de matriz extracelular, para medir a motilidade das células imunitárias fluorescentemente marcado, humano ou não-aderente efectoras de murino. Esta técnica utiliza um colector de aço inoxidável e 10 bem corrediça de Teflon para focalmente depositar as células T não-aderentes preparadas em poços quer com monocamadas confluentes de células de tumor ou proteínas da matriz extracelular. Microscopia de fluorescência de luz e / ou multi-canal é usado para rastrear o movimento eo comportamento das células efetoras ao longo do tempo. Corantes fluorescentes e / ou vectores virais que codificam transgenes fluorescentes são usados para marcar diferencialmente os tipos de células para a imagiologia. Este método é distinta da de tipo semelhante em ensaios in vitro que rastreiam migração horizontal ou vertical / invasão utilizando câmaras de slides, agar ou transwell placas. O ensaio permite que os dados detalhados de imagem para be coletados com diferentes tipos de células que se distinguem por marcadores fluorescentes específicos; mesmo subpopulações específicas de células (isto é, transduzidas / nontransduced) pode ser monitorizado. Superfície parcelas intensidade de fluorescência são gerados usando canais de fluorescência específicas que correspondem ao tipo de célula de migração. Isto permite uma melhor visualização da mobilidade celular imune não-aderente em momentos específicos. É possível a obtenção de provas de outras funções das células efectoras, tais como citotoxicidade ou a transferência de vectores virais a partir de células de efector para alvo, bem como. Assim, o método permite que os investigadores microscopicamente documentar célula-a-célula interacções de diferencialmente marcado, não-aderente com células aderentes de vários tipos. Tais informações podem ser especialmente relevante na avaliação dos tipos de células do sistema imunológico biologicamente manipulados ou ativados, onde a prova visual de funcionalidade é desejados com células-alvo tumor antes de sua utilização para a terapia do câncer.
Introduction
O ensaio de migração celular radial monocamada foi originalmente desenvolvido para medir as propriedades infiltrativas de células tumorais aderentes 1-4 em lâminas revestidas com matriz extracelular (ECM) 5-7 proteínas ou com componentes de ECM individuais, tais como fibronectina ou laminina 1,2. A técnica de semeadura envolvida uma única suspensão celular de células de tumor no centro de poços, utilizando um colector de células de sedimentação aço inoxidável (CSM). Após a sedimentação, as células tumorais se aderir ao fundo do poço e a mudança no diâmetro da população inicial de células ao longo do tempo foi usada para estabelecer uma taxa de motilidade horizontal. O ensaio de migração celular Radial Monolayer proporcionaram uma vantagem visual sobre outros métodos existentes que empregavam transwell placas de ensaio in vitro os recursos migratórios de células; estes ensaios não são propícias à geração de imagens 8. Como assim, ele também forneceu uma grande quantidade de liberdade na escolha do timepointé quando a migração é avaliada, sem limite do número de pontos no tempo um pesquisador pode optar por imagem após a sedimentação.
Porque a capacidade de migrar é uma funcionalidade importante para as células não aderentes, em especial na área da imunoterapia ou onde eles podem ser utilizados como veículos de administração para os vectores virais, nós adaptamos o uso do MCS para avaliar a migração de células não-aderentes tipos sobre monocamadas de células de tumor, além das proteínas de ECM. O benefício adicional de microscopicamente visualizando a migração de células não-aderentes em monocamadas de células tumorais viáveis, em ECM complexo isolado a partir do tumor, ou sobre os componentes da ECM individuais torna este ensaio versátil. Os ensaios que utilizam poços revestidos com uma única proteína extracelular não refletem exatamente o substrato tecido ECM ou tumor das células que migram através in vivo.
Aqui, usamos alorreativas linfócitos T citotóxicos (alloCTL), sensibilizados a major histocompcomplexo atibility (MHC) proteínas utilizando reacções unidireccional mista de linfócitos de células de tumor (MLTR) ou reacções de linfócitos mistos (MLR) 9, como o nosso tipo de células não-aderentes representativo. Testamos células de origem humana e murina. Quando a migração foi medida em monocamadas de tumor, as células tumorais utilizadas foram alvos ou parcialmente relevantes, exibindo algumas das mesmas proteínas MHC encontrados na população de células usadas para sensibilizar as efetoras, ou alvos totalmente pertinentes, com um conjunto completo de moléculas MHC que o efetores foram sensibilizados no sentido. Em algumas experiências, foi utilizado CellTracker fluorescente vermelha CMPTX ou corante proliferação celular eFluor 670 para diferenciar entre células efectoras e alvo. Utilizou-se também a transdução com vectores virais para codificação de proteínas fluorescentes como uma forma adicional de visualizar as células. Para certos ensaios, nós transduced o alloCTL com vetores retrovirais replicantes (RRV) que codificam para o verde esmeralda (EMD) proteína fluorescente 10,11; para others, as células tumorais foram transduzidas com vectores lentivirais que codificam para mStrawberry.
O alloCTL foram semeadas por meio de um canal do colector para o centro de qualquer monocamadas de células tumorais ou de ECM colhidas a partir de monocamadas de células de tumor. Interacções de células aderentes e não aderentes foram visualizadas por luz e / ou por microscopia de fluorescência ao longo do tempo. Perturbação na monocamada de células tumorais em baixa potência, ou tumorais células com núcleos fragmentados em alta potência foram indicadores de lesão celular por lise e apoptose, respectivamente. Nós digitalmente criados mapas de intensidade fluorescente superfície que mostram a migração de células fluorescentes T não aderentes sobre as culturas em monocamada. Observamos, também, a citotoxicidade engendrado para a monocamada de células de glioma aderente após a formação do cluster do alloCTL não aderente sobreposta. Assim, foi observada a transdução horizontal de RRV-EMD do alloCTL à monocamada de glioma.
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Protocol
1. Deslize Preparação
- Insira os slides Manifold sedimentação celular em bolsas de esterilização e selar com fita crepe. Vire o lado revestido de Teflon da corrediça do lado do papel a da bolsa para evitar depósitos de plástico nos poços.
- Bolsas de autoclave durante 15 min a 121 ° C.
- Remover slide da bolsa de esterilização dentro de uma cabine de segurança biológica e coloque em um estéril 150 x 15 mm estéril placa de Petri. Até quatro lâminas pode caber por prato. Coloque um 35 x 10 mm placa de Petri ao lado dos slides. Adicionar 2-3 ml de H 2 O estéril para proporcionar humidificação.
- Lâminas pré-revestimento com poli-D-lisina a 100 mg / ml usando um volume suficiente para cobrir a totalidade bem. Depois de uma hora, à temperatura ambiente, aspirar a solução e lavar a superfície do poço duas vezes por pipetagem de 1x PBS sobre a superfície dos poços.
- Opcionalmente, adiciona fibronectina ou outros componentes da matriz extracelular para assegurar uma maior aderência das células do tumor. Adicionar fibronectina a 5 jig / ml em volumes suficientes that os poços não seca dentro de um curto período de tempo à temperatura ambiente.
- Após 1 hora, aspirar a solução de sobra e lavar duas vezes por pipetagem cima e para baixo com 1x PBS.
- Manter PBS aos poços até tumor está pronto para a galvanização. Uso desliza no mesmo dia.
- Colheita de um balão confluente do tipo de células de tumor aderentes desejado. Contagem de células viáveis usando corante Trypan Blue exclusão por microscopia de luz e ressuspender em 5 x 10 6 células / ml em meio de crescimento, por exemplo adequadamente tamponada, meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS), L glutamina e piruvato de sódio.
- Se imagiologia de fluorescência da população de células aderentes se desejado, rotular a população de células aderentes com um corante fluorescente ou um corante vital proliferação de células, seguindo os protocolos fornecidos pelo fabricante.
- Suavemente pipeta 10 ul de meio completo em cada cavidade da lâmina, tendo o cuidado de evitar a criação de bolhas na microcavidadels, pois estes podem impedir a adesão de células tumorais uniforme.
- Adicionar 2,5-5,0 x 10 4 células (5-10 ul de suspensão de células) para o meio em cada poço (Figura 1A). Ajustar o número óptimo dependendo do tipo de célula de tumor e o número de dias de crescimento desejados. Células tumorais maiores ou com células em crescimento rápido pode exigir menor quantidade de células inicialmente. Traga bem volume de até 40 mL, adicionando médio e pipeta cima e para baixo para assegurar uma distribuição uniforme das células.
- Depois de todas as cavidades são semeadas, permitir que as células tumorais a aderir à TA, em seguida, colocar a tampa na de 150 x 15 mm numa caixa de Petri e cuidadosamente mover o prato para uma incubadora humidificada a 37 ° C / 5% de CO 2 durante pelo menos 24 horas.
- Alterar o meio de cultura diária. Pipetagem cuidadosa de uma porção do meio gasto a partir da monocamada e substitua com meio completo fresco.
NOTA: Por causa da evaporação, mais volume terá de ser adicionado do que foi retirado. Wells estará pronto para o ensaio quando um mesmo, conflefluente camada de células está presente. Este é tipicamente de 1-3 dias após a sementeira inicial. - Lavar monocamada suavemente uma vez com PBS como descrito no passo 1.4 e prosseguir para a etapa 2, se monocamadas são desejados, ou para o passo 1.13 abaixo para extrair proteínas da MEC da monocamada.
- Adicione uma solução de 0,5% de Triton-X (v / v) em meio completo e adicionar 30 ul a cada poço. Deixe monocamada digerir na capa durante 2 min, em seguida, lavar duas vezes com meio completo por pipetagem como descrito acima.
NOTA: A camada de ECM podem ser visíveis por microscopia de luz (Figura 2). Use os slides imediatamente, ou manter-se em meio completo no umidificado incubadora de CO 2 por 1-2 dias. Não permitir que os poços para secar.
2. A sedimentação de células T não aderentes Onto Deslize
- Se imagiologia de fluorescência da população de células não aderentes for desejado, rotular as populações de células não aderentes com um corante fluorescente vitais, tais como CFSE, Cell Rastreio Vermelho CMPTX, ou eFluor670, seguindo os protocolos fornecidos pelo fabricante, pelo menos, 1 hora antes do ensaio. Alternativamente, manipular as células para expressar proteínas fluorescentes codificados por vectores virais.
- Autoclave o colector de sedimentação de células numa bolsa de autoclave tal como descrito no ponto 1.2 acima.
- Retire a câmara úmida contendo lâminas revestidas de Teflon da incubadora e lugar na cabine de segurança biológica.
- Lave os poços com PBS 1x por pipetagem cima e para baixo, em seguida, adicione 45 mL de meio completo, contendo pelo menos 10% de soro.
- Remover o colector do envelope de esterilização e cuidadosamente deslizar ao longo dos poços até o 'gancho' no final do colector toca o fundo da corrediça (Figura 1B).
- Certifique-se de que o meio de cultura é visível em cada um dos canais. Se nenhum for visto, tirar o colector e adicionar mais meio para o correspondente bem, em seguida, substituir e verificar novamente.
- Repita o passo 2,5 para cada channel do colector, ou para o maior número de poços, como desejado.
- Contagem de células não-aderentes e ressuspender em não menos do que 1,0-2,0 x 10 5 / ul. Desenha-se 1 ml de células e pipeta-los lentamente no interior do canal (Figura 1C). Faça isso para cada bem desejar.
- Deixar todo o aparelho carregado de células, isto é, o colector e corrediça, no interior da bio-capuz durante 20-30 minutos para permitir que as células do canal para assentar.
- Remover o colector tocando ambas as extremidades e suavemente levantando-o da lâmina de modo a não perturbar as células semeadas focal no centro das cavidades (Figura 1D).
- Inspeccionar cada poço para assegurar que as células não aderentes foram semeados com sucesso no centro do poço ficar dentro da circunferência do canal colector. As células não aderentes irá aderir idealmente ligeiramente à monocamada ou ECM e uns com os outros, por conseguinte, se mover ligeiramente as lâminas em torno não fará com que a célula Pellet para dispersar. Não disputam o slide.
3. Microscopia de Fluorescência
- Com um equipamento experimental adequado, realizar a imagem após a sedimentação é confirmado. Idealmente, usar um microscópio que está equipado com uma câmara de CO2 e humidade. Imagem com baixa potência, ou seja, 4X ou 10X, para permitir imagens múltiplas para ser tomado de uma área maior, de modo que a totalidade do bem pode ser visto.
- Aquisição de imagens digitais usando software de captura de imagem. Realizar campo claro e / ou multi-canal de imagens por fluorescência.
- Se desejar, configure um lapso de tempo para gravar imagens em diferentes canais sobre uma determinada área, ou manter o slide umidificado e em uma temperatura de 37 ° C / 5% de CO2 e manualmente tirar a imagem nos momentos desejados (Figura 1E & F, recomendado para pontos de tempo mais longos).
4. Análise e Visualização
- Usando software de edição de imagem, luz e fl mesclaruorescent imagens em uma camada de modo a vários tipos de células e de marcadores pode ser visto na mesma imagem. Arraste e solte os arquivos de imagem para cada cor individual para o programa e, quando solicitado, selecione a opção "Add Layer" para criar um arquivo de imagem com várias camadas.
- Na maior ampliação, tome, alinhar e costurar as imagens de todo o bem digitalmente. Alinhar arquivos por olhando para regiões conservadas entre as duas imagens e sobrepondo uma imagem em cima da outra, até que um quadro completo é gerado.
- Adicionar bares mícron de imagens durante a aquisição utilizando o software de captura para determinar a distância células individuais têm migrado.
- Para determinar a migração de células em vários momentos, fazer mapas de intensidade de fluorescência superfície com software de imagem, ou seja, ImageJ, para quantificar a agregação de células T fluorescente ou espalhar ao longo do tempo.
- Para gerar terrenos de superfície, dê uma imagem em camadas gerado na etapa 4.1 e sob a janela Layers,desmarque todas as camadas, exceto aqueles correspondentes ao canal desejado. Por exemplo, se uma parcela de superfície é desejada para visualizar a expressão de EMD, apenas as camadas "verdes" correspondentes ao filtro usado para este marcador deve ser visível.
- Achatar a imagem e salvá-lo em um formato de arquivo reconhecido (por exemplo, .png) e carregar a imagem no programa. Para gerar a plotagem de superfície, altere o tipo de imagem para 8 bits, alterar o brilho / contraste conforme necessário para reduzir o fundo, e selecione a opção "Analisar / Surface Plot '. As imagens na Figura 5 foram geradas, verificando o "Sombra", "Desenhe Axis ',' One Polygon Per Line ', e caixas de seleção' Smooth '.
- Em alternativa, tomar medidas utilizando o raio ou o diâmetro do depósito celular focal no tempo zero e comparar com as células no ponto mais externo em momentos diferentes. O diâmetro do Teflon poços é de 6,0 mm.
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Representative Results
Os vectores virais que codificam para as proteínas fluorescentes pode ser utilizada em adição a, ou em vez de, corante fluorescente. Transdução virai deve ser executada antes do ensaio de motilidade. Ambos os tipos de células aderentes e não aderentes podem ser diferencialmente marcado. O protocolo para a transdução vai depender do tipo de vector utilizado. Aqui, nós transduced o alloCTL nas Figuras 3, 5 e 6 com RRV-EMD, pelo menos, dois dias antes do ensaio utilizando o protocolo descrito 12. Utilizou-se também um vector lentiviral, CMV-morango-IRES-FLUC2, para transduzir as células tumorais para expressar a proteína fluorescente vermelha mStrawberry (Figura 4). Este transdução foi realizada por adição do vector para o balão de células durante 48 horas, altura em que foi adicionado meio fresco. Depois de permitir que as células recuperar durante dois dias, a diluição limitante foi realizada para gerar uma população de 100% de células transduzidas.
(Figuras 3 e 5) A microscopia de fluorescência. mostra células inicialmente semeadas, no centro do poço, migram para longe do centro ao longo do tempo. A formação de agregados alloCTL após 4 horas (Figura 3, as setas brancas) é provável reflectora de padrões de crescimento autócrinos exibidos pelos activado, IL-2, a produção de populações de células T 13.
Em uma outra experiência, efectora murino alloCTL foram feitos por um modo de MLR utilizando haplotipo H-2d BALB / c esplenócitos respondedoras e estimuladoras esplenócitos haplotipo H-2b / k a partir de ratinhos B6C3F1, a tensão à qual o glioma TU-2449 é singénico. Imediatamente antes da semeadura através do canal de tele colector sobre a monocamada de células de tumor, o alloCTL foram coradas com eFluor 670. O alloCTL (células roxo) foram semeadas no centro de monocamadas de células de glioma estabelecidos TU-2449 (vermelho) que eram 100% transduzidas com o CMV-Straw- IRES-FLUC2 vector viral, e plaqueadas em poços um dia antes do ensaio. A Figura 4A e B mostram imagens microscópicas tomadas do mesmo quadrante do mesmo poço em 1 e 48 horas. A Figura 4C e D foram gerados utilizando o ImageJ para converter fluorescência roxo digitalizado intensidades em terrenos de superfície quantitativos que são exibidos em formato tridimensional.
Finalmente, alloCTL humano foram feitas com células cerebrais humanos trópico estimuladoras inactivadas derivadas da linha celular de tumor da mama metastático MDA-MB-231BR por MLTR. A Figura 6 mostra microscopia de luz e de fluorescência ao longo do tempo de imagens não-aderente CMPTX marcado alloCTL, parcialmente transduzidas com RRV-EMD, migrando em proteínas da MEC extraídos from essas células tumorais. Em (A) fotomicrografia de campo claro mostra colocação focal de alloCTL imediatamente após a sedimentação. Em (B e F) mostram fotomicrografias de campo claro, a 4 e 8 h, respectivamente, o alloCTL radialmente na migrando a ECM. A densidade alloCTL diminui com a distância a partir do centro do poço (centro de poço é canto superior esquerdo do campo em BI). Painéis (C e G) mostra Toda a preparação alloCTL coradas com CMTPX; (D e H) demonstram a transdução parcial do alloCTL com RRV-EMD, como indicado por um pequeno número de células EMD + T, e (E e I) apresentam as imagens fundidas de RRV-EMD transduzidas alloCTL migrando no ECM juntamente com o alloCTL não transduzidas.
Figura 2. monocamadas de células de tumor ECM e plaqueadas em poços de deslizamento CSM. Fotomicrografias de poços de slides preparadoscom monocamadas de células de glioma (A) confluente U-87 mg, ou proteínas (B) ECM extraídos de confluente U-87 mg coradas com corante azul de Coomassie. Bar = 200 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Migração e citotoxicidade de linfócitos transduzidas RRV-EMD no centro e de ponta do depósito de células ao longo do tempo. Fotomicrografias fluorescentes tomadas em vários momentos, no bordo dianteiro e no centro de alloCTL-RRV-EMD, seguido de sedimentação numa monocamada de células de glioma de 87 mg L-aderentes. Effector alloCTL semeado como células individuais, formam aglomerados esféricos dentro de 4 horas (setas brancas) de colocação. Único CTL marcado com fluorescência migraram do centro do poço ums que o tempo avança. Após 24 horas, os adesivos de células vazias na monocamada aderente são visíveis presumivelmente devido a alloCTL citólise das células alvo do tumor (ver a área dentro traços). Bar = 200 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. radial migração de alloCTL murino coradas com eFluor 670 em células de glioma mStrawberry marcados mostrado em 1 e 48 h. Fotomicrografias fluorescentes de um quadrante do mesmo poço em (A) 1 hora e (B) 48 horas após a sedimentação de fluorescência marcado com alloCTL não aderente numa monocamada de células de glioma TU-2449. As fotomicrografias de baixa potência reflectir a superfície contida dentro de um quadrante do MCS bem (raio de 3 mm). Em alta potência (A e B, inserir) alloCTL (setas brancas) são mostrados na proximidade ou associados a células tumorais individuais; uma tem uma aparência desintegrada com núcleos fragmentados e é apoptótica. (C e D) mapas intensidade de fluorescência respectiva superfície obtidos utilizando o software ImageJ mostrando valores de pixels das imagens fluorescentes roxo digitalizados em forma gráfica tridimensional e colocados em uma grade que representa o raio bem de 3 mm. Bar = 500 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Migração de alloCTL e propagação horizontal da RRV-EMD de alloCTL transduzido para as células tumorais. Fotomicrografias fluorescentes em série costurados em conjunto para cobrir o raio do poço, utilizando software de edição de imagem. Migração de RRV-EMD transducedalloCTL (setas brancas) é mostrado em uma monocamada de células tumorais U-87 mg a 0 e 72 horas, seguido de sedimentação. RRV-EMD transdução de células tumorais na monocamada também é aparente a 72 horas após a adição do alloCTL EMD transduzidas, indicando que a transmissão horizontal de RRV infeccioso a partir de linfócitos de células de tumor ocorreu (caixa branca, e inserção). Bar = 200 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Radial migração de alloCTL transduzidas com RRV-EMD e corados com CellTracker Red CMTPX. As células foram sedimentadas em extractos de ECM derivados a partir de células MDA-MB-231BR. Migração de alloCTL foi visualizada por microscopia óptica de campo claro, a 0, 4 e 8 horas (A, B, F coluna 1, respectivamente). Fluoréimagens de perfume do CMPTX (vermelho) marcado alloCTL (C, G, coluna 2), o RRV-EMD (verde) transduzidas alloCTL (D, H, coluna 3), e as imagens fundidas (E, I, coluna 4) são mostrado a 4 e 8 horas. Barras = 200 fim; Bar mostrado na B aplicável a imagens CI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As células tumorais em uma única suspensão de células foram pipetadas para os poços de uma lâmina de Teflon-mascarado. As células foram deixadas aderir e, em seguida, formado monocamadas numa atmosfera humidificada com 5% de CO2, 37 ° C incubadora (Figura 1A). Monocamadas estabelecidas ou proteínas da MEC derivados de monocamada podiam ser colhidas para estes ensaios (Figura 1B). Linfócitos T efectoras marcadas com corantes fluorescentes vitais ou transduzidas com vectores que codificam para EMD foram semeadas para o centro do poço, utilizando um MCS. A capacidade das células T efectoras não aderentes para migrar em monocamada ou as proteínas da MEC, em seguida, ao longo do tempo foi avaliada e quantificada com luz e microscopia de fluorescência. Aqui, foi avaliada a migração e citotoxicidade de efetoras não aderente alloCTL em uma monocamada de alvo parcialmente relevante células U-87 mg de glioma (Figuras 3 e 5). Estas células alvo, que exibem apenas uma parte do antigénio de leucócito humano(HLA) moléculas (HLA-A2, B44) encontrados nos estimuladores originais, foram usadas para reduzir a actividade lítica potente que seria exibida pelo alloCTL para as células alvo 13-06-MG relevantes (HLA-A1,2 e B44 , 57). Observou-se também a mobilidade do alloCTL sobre ECM colhido a partir de uma monocamada de células de tumor da mama MDA-MB-231BR (Figura 6). O alloCTL foram gerados por um modo de acordo com MLTR métodos anteriormente publicados 9. Effector alloCTL foram colhidas 4-5 dias após o one-way MLTR e transduzidas com RRV-GS4-EMD (Figuras 3 e 5) ou RRV-ACE-EMD (Figura 6) 10,11. Níveis mais elevados foram obtidos de transdução com o vector GS4 utilizando uma leucemia do macaco Gibbon do envelope do vírus com o vector anfotrópico ACE. Usando este ensaio de migração radial, observamos que tanto transduced e nontransduced fluorescently marcado alloCTL tinha capacidade migratória. Também demonstramos que eles retêm a sua capacidade para ser CYTotoxic depois de submetidos a manipulações para a transdução RRV.
A capacidade de migrar para alloCTL murino também foi avaliada (Figura 4). alloCTL sensibilizados para haplótipo H-2b / k exibido pelas células TU-2449 foram marcadas com eFluor 670 (roxo) e um ensaio de migração foi realizada utilizando TU-2449 transduzidas com CMV-Palha-IRES-FLUC2 (vermelho). Ao utilizar alvo totalmente relevante, um número menor de células efectoras alloCTL foram semeadas para evitar a lise rápida das células de tumor alvos. Usando 1 h na forma de uma linha de base, as células T são, em grande parte localizada a uma densidade elevada no centro do poço como uma suspensão de célula única. As micrografias 48 hr mostrar extensa migração de células T em relação a aresta exterior do poço e o agrupamento de alloCTL é prontamente aparente com destruição das células do tumor no sítio do seu depósito inicial. A proliferação das células TU-2449 é evidenciada como o mStrawberry células marcadas aumentar em densidade sobre o poço. Isto é melhor visto na superfícieparcelas de fluorescência que foram gerados para visualizar a distribuição de células roxas nos poços (Figura 4, painel inferior). Mobilidade AlloCTL é muito mais evidente no poço às 48 horas comparado com a linha de base de 1 hora. À semelhança do que foi visto nos ensaios utilizando células de glioma humano e alloCTL, um apuramento das células tumorais em torno da área do depósito inicial de efectores é perceptível a 48 h, sugerindo que a lise das células alvo do tumor.
Uma etapa fundamental neste ensaio é o crescimento de monocamadas saudáveis e colheita subseqüente de ECM "esquelético". Inoculação das células tumorais em 2,5-5,0 x 10 4 culas por po, de acordo com o passo 1.9 acima, normalmente resultou em aproximadamente uma monocamada até mesmo para os tipos de células de tumor foram utilizados. Descobrimos que é importante para permitir que as células tumorais a aderir à TA, caso contrário, a convecção que ocorre a 37 ° C vai empurrar as células para o centro das cavidades. Como assim, pré-revestimento do wi poçosth poli-D-lisina e / ou uma proteína da MEC tais como a fibronectina ou o colagénio pode aumentar muito a taxa de sucesso. Além disso, tivemos mais sucesso com estes ensaios utilizando derivados de monocamada ECM 'esqueleto' do que com componentes da MEC individuais (ie., Fibronectina, colágeno), que se mostraram muito menos confiável. É importante a experiência com o número de células não aderentes a depositar através do colector de sedimentação, bem como, e se utilizar um tipo de célula pura, pode, teoricamente, ser capaz de definir um coeficiente de motilidade com este ensaio. Como o volume é também pequena e a evaporação de algum meio ocorre, a monocamada necessita de ser reabastecido diariamente com meio fresco. Substituição de mídia também evita acúmulo de lactato tóxicos como as células crescem e se dividem. A falha em cultivar uma monocamada saudável pode resultar na queda da monocamada ou ECM da superfície dos poços.
Os azuis proteínas da MEC manchadas Coomassie derivados da li de células de glioma U-87 mgne acordo com o passo 1.13 acima são mostradas como um exemplo visual da camada de substrato aderente deixado para trás após a digestão com Triton X-100 (Figura 1B). ECM produção de uma linha celular de carcinoma da mama, células MDA-MB-231BR, muitas vezes era desigual e fina, resultando numa camada de ECM que era mais fracamente aderente e, por vezes, levantada a partir da corrediça durante o ensaio. A aderência de proteínas de ECM com a corrediça melhorada quando as células tumorais foram mantidas como monocamadas confluentes por 1-2 dias antes da digestão. Durante todo o processo, a manutenção da vedação de Teflon em torno do poço também era importante. Mantendo o volume baixo e minimizar a exposição do teflon para a solução de Triton-X100 mitigado dano à integridade da vedação de teflon.
Uma adaptação do presente protocolo pode ser o uso de uma matriz extracelular tridimensional colhida a partir de seções de outubro tecido tumoral incorporado 14. No entanto, deve notar-se que a distância entre o plano bottOMED bem a superfície da lâmina é apenas 1 mm; assim, as seções superiores a esta espessura pode ser perturbada por colocação manifold. Além disso, um método terá de ser concebido para efectuar um ligeiro orifício de trepanação no tecido para aceitar a gota de meio contendo as células não aderentes.
Preparação de uma suspensão de células individuais bem dispersa dos linfócitos T efectoras antes da sedimentação também foi imperativo. Trituração suave das células T não aderentes para dispersar os agregados a uma suspensão de uma única célula foi um passo essencial para a direita antes de carregar o alloCTL para os canais do CSM. A utilização de tampões de dissociação de células não enzimática devem ser empregues, se necessário. Além disso, a densidade dos linfócitos efectores deve ser de cerca de 1,0-2,0 x 10 5 células / ul de sedimentação, como descrito acima no passo 2.8. Números baixos de células pode resultar em nenhuma sedimentação, enquanto que os números de células mais elevadas podem causar um grande depósito que é fácil para interromper o movimento quandodeslize. Recomenda-se também que a concentração de soro no meio ser de pelo menos 10% para proporcionar tensão superficial adequada do menisco positivo que reduz a possibilidade de transbordamento.
Um microscópio de luz invertida com recursos de imagens de fluorescência e um 4x ou 10x objetivos é ideal para este ensaio. Os pontos de tempo para a imagem latente pode ser determinada de acordo com as investigações experimentais individuais e tipos de células. Os CTL não-aderente, em particular migrar a partir do centro de sedimentação para a borda do poço mais rapidamente em proteínas de ECM (4-8 h) do que sobre uma monocamada de células (12-72 h). Parcialmente células-alvo relevantes MHC foram preferível metas relevantes para nosso ensaio alloCTL para incentivar a visualização de motilidade e reduzir mediada por células citólise das monocamadas antes da migração significativa pode ocorrer; usar de um efetor baixo para atingir relação também retarda a lise. O uso de metas parcialmente compensadas permite uma melhor visualização das RRVtransmissão para as células tumorais, bem.
O uso de um microscópio invertido proporciona várias vantagens relativamente a um alcance vertical. Um âmbito invertido permite a imagiologia através da câmara humidificada para que as lâminas não tem de ser perturbado, ao mesmo tempo, manter um ambiente estéril para as células. Além disso, a imagem através da câmara proporciona uma barreira entre a amostra e o técnico, permitindo a adesão a nível de biossegurança II diretrizes (BSL II) quando se trabalha com tecidos de origem humana 15.
Se estiver usando um alcance vertical, a maior ampliação realizáveis sem perturbar o menisco positivo do poço é de 20x. Infelizmente, o uso de uma lamela, ou acessórios kit óptica para o colector de sedimentação celular, não é recomendado, pois o rompimento do menisco geralmente resulta na propagação das células não aderentes sedimentadas ao longo do bem. Imagiologia por longos períodos de tempo podem requerer a adição cuidadosa de medIUM a cada poço para substituir aquele perdida por evaporação, embora isto seja mais provável que sejam necessários durante a imagiologia de lapso de tempo.
Este protocolo é distinto de métodos que medem a migração celular horizontal de células aderentes em Zigmond 16,17 Chambers, a concepção de que não iria permitir a visualização da migração de células não aderentes. Outros ensaios que avaliam a migração horizontal para um gradiente quimiotáctica através de um substrato tal como de agar são geralmente usados para estudar a migração de um tipo de célula 18-20. Uso do MCS oferece várias vantagens para estes métodos, bem como métodos que medem a migração vertical / invasão de células de cultura, tais como em câmaras de Boyden ou placas Transwell de Matrigel. Em primeiro lugar, o contato célula-célula permite uma determinação da interação célula-alvo efetoras e lesão por células efetoras. A capacidade citolítica de alloCTL-RRV-EMD inicialmente estimulada pela one-way MLTR com estimulador de células tumorais 13-06-MG para a partialiado MHC-matched linha de células U-87 mg é evidente no centro da monocamada a 24 e 72 h, seguido de sedimentação (Figuras 3 e 5, as linhas a tracejado). Assim, a degradação das células TU-2449 por alloCTL murino é visível em 48 horas pós-sedimentação (Figura 4). A monocamada é obliterada no centro de depósito alloCTL, mas ocorre mais lentamente durante o restante da monocamada, quer devido à sobreposição na expressão de HLA de 13-06 mg e 87 mg L-nos ensaios com células humanas 21 ou o baixo o número inicial de células efectoras para o glioma murino. Além disso, a densidade de efector para alvo é reduzida como efetor alloCTL migram para longe do local de sedimentação. Além disso a migração e a citólise, este protocolo pode ser utilizado para visualizar a transferência de proteínas fluorescentes de codificação de vírus. Aqui, a transferência de codificação para RRV EMD do alloCTL para as células tumorais é evidente depois de 72 horas (Figura 5, inserção).
Uma limitação deste modelo é que a migração só pode ser avaliada in vitro, que não pode ser verdadeiramente um reflexo da migração in vivo. Outra limitação é que os gradientes de receptores de quimiocinas / quimiocina não pode ser estabelecida usando o modelo. Enquanto interações de células do sistema imunológico com ECM ou células tumorais individuais ainda podem ocorrer e depender do que essas células secretam ou expressar, este burro motilidadeay não responder a perguntas sobre se as células não aderentes irá migrar especificamente a ou para longe de factores isolados.
Uma vantagem deste ensaio é a capacidade de determinar se uma população de células não-aderentes manter a funcionalidade migratório se os linfócitos ter ou não ter sido transduzidas. No nosso exemplo, a subpopulação transduzidas é visível através de expressão da proteína Merck, e é claro que a funcionalidade migratório é mantido nesta subpopulação. Uma aplicação mais ampla, pode ser para testar os efeitos de várias concentrações de agentes ou drogas que possam afectar a migração de células imunitárias não aderente. Além disso, outras células hematopoiéticas pode ser testado para a mobilidade em diferentes substratos ou de células aderentes derivadas de tecido normal. Finalmente, embora não seja feita aqui, semeando uma combinação de tipos de células aderentes, isto é, as células do estroma ou células dendríticas com tumor, pode fornecer análises reflectora de mais complexo em ambientes in vivo.
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Acknowledgments
Apoiado em parte pelo NIH R01 CA121258, CA125244 R01, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Grant Número UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, e do Fundo de Investigação Holmes Memorial Joan S.. MJH e GCO recebeu suporte do Joan S. Holmes Memorial pós-doutorado na Universidade da Califórnia. O dispositivo CSM foi obtido da Creative métodos científicos: www.creative-sci.com. O vector lentiviral foi recebido a partir da UCLA Vector Core, que é suportado por CURA / P30 DK041301.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μl Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μl Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
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