Abstract
Мы сообщаем о новой адаптации радиального монослойной клеточной миграции анализа, впервые сообщили для измерения радиального миграцию адгезивных клеток опухоли на белки внеклеточного матрикса, для измерения моторику флуоресцентно меченных клеток иммунной системы, не соблюдают человека или мышиный эффекторных. Этот метод использует коллектор из нержавеющей стали и 10-а тефлон слайд централизовано хранение неадгезированных Т-клеток в лунки составляться либо сливающихся монослоев опухолевых клеток или белков внеклеточного матрикса. Свет и / или многоканального флуоресцентной микроскопии используется, чтобы отслеживать движение и поведение эффекторных клеток в течение долгого времени. Флуоресцентные красители и / или вирусные векторы, которые кодируют для люминесцентных трансгенов, используемые для по-разному маркировать типы клеток, для работы с изображениями. Этот метод отличается от аналогичного типа в анализах пробирке, которые отслеживают горизонтальную или вертикальную миграцию / вторжение с использованием камеры слайдов, агар или Transwell пластин. Анализ позволяет подробные данные отображения бе собирали с различными типами клеток, отличающихся от конкретных флуоресцентных маркеров; даже конкретные субпопуляции клеток (то есть, трансдуцировали / nontransduced) можно контролировать. Поверхностные интенсивность флуоресценции участки формируются с использованием конкретных каналов флуоресценции, которые соответствуют типу Миграция клеток. Это позволяет лучше визуализировать неадгезивные мобильности иммунных клеток в определенное время. Можно собирать доказательства других эффекторных функций клеток, таких как цитотоксичности или передачи вирусных векторов из эффектора к клеткам-мишеням, а также. Таким образом, метод позволяет исследователям микроскопически документ от клетки к клетке взаимодействия дифференциально-меченого неприлипшие с прикрепленных клеток различных типов. Такая информация может быть особенно актуально при оценке биологически-манипулировать или активированных типов иммунных клеток, где наглядное доказательство функциональности желательно с опухолевых клеток-мишеней перед их использованием для лечения рака.
Introduction
Радиальная однослойная миграция клеток для анализа был первоначально разработан для измерения инфильтративные свойства адгезивных клеток опухоли 1-4 на предметные стекла, покрытые внеклеточного матрикса (ECM) белков 5-7 или отдельных компонентов ECM, таких как фибронектин или ламинин 1,2. Методика участие посева суспензии отдельных клеток опухолевых клеток в центре скважин с использованием клеток седиментации коллектор из нержавеющей стали (CSM). После седиментации, опухолевые клетки будут прилипать к нижней части скважины и изменению диаметра исходной клеточной популяции с течением времени был использован, чтобы установить скорость горизонтальной подвижности. Радиальная однослойная миграция клеток для анализа обеспечили визуальную преимущество перед другими существующими методами, которые использовали Transwell пластины для анализа в пробирке мигрирующих возможности клеток; Эти анализы не являются благоприятной для визуализации 8. Кроме того, он также предоставил большое количество свободы в выборе временной точкех годов, когда миграция оценивается, без ограничения по количеству временные интервалы исследователь может выбрать изображения после осаждения.
Поскольку способность к миграции является важным функциональность для не-адгезивные клетки, особенно в области иммунотерапии или где они могут быть использованы в качестве средств доставки вирусных векторов, мы адаптировали использование CSM для оценки миграции неприлипающими клетки Типы на опухолевых клеточных монослоев, в дополнение к белкам ЕСМ. Дополнительным преимуществом микроскопом визуализации миграцию без прикрепленных клеток на жизнеспособных опухолевых клеток монослоев, на комплексном ECM, выделенной из опухолей, или на отдельные компоненты ECM делает этот анализ универсальным. Анализы, которые используют лунки, покрытые с одной внеклеточной белка не отражают точно ECM тканей субстрата или опухоль клетки будут мигрировать через в естественных условиях.
Здесь мы использовали аллореактивными цитотоксические T-лимфоциты (alloCTL), с повышенной чувствительностью к главной histocompatibility комплекс (МНС) белки, использующие одну сторону опухоли смешанной культуры лимфоцитов клеток реакции (MLTR) или смешанные реакции лимфоцитов (MLR) 9, как наш представитель неприлипающими типа клеток. Мы протестировали клетки человека, так и мышиный происхождения. При миграции измеряли на опухолевых монослоев, опухолевые клетки, используемые были либо частично соответствующих целей, показывая некоторые из тех же белков МНС, найденных на клеточной популяции, используемого для сенсибилизации эффекторы или полностью соответствующие цели, с полным набором молекул МНС, что эффекторы были осведомлены навстречу. В некоторых экспериментах мы использовали флуоресцентный CellTracker Red CMPTX или пролиферации клеток красителя eFluor 670 различать эффекторных и клеток-мишеней. Мы также использовали трансдукции кодирования вирусных векторов для флуоресцентных белков в качестве дополнительного способа визуализации клеток. Для некоторых анализов, мы трансдуцировали alloCTL с ретровирусных векторов реплицирующихся (макака), кодирующих изумрудно-зеленый (EMD) флуоресцентного белка 10,11; для дрERS, опухолевые клетки трансдуцированных лентивирусов векторов, кодирующих mStrawberry.
AlloCTL высевают через канал коллектора в центре либо монослоев опухолевых клеток или ECM, собранных с опухолевых клеток монослоя. Адгезивные и не прилипшие межклеточных взаимодействий были визуализированы с помощью света и / или с помощью флуоресцентной микроскопии с течением времени. Нарушения в опухолевых клеток монослоя на малой мощности, или опухолевые клетки с фрагментированными ядрами при высокой мощности были показатели повреждения клеток в результате лизиса и апоптоза, соответственно. Мы цифровой создал интенсивности поверхностного дневного карты, показывающие миграции неприлипающих флуоресцирующий Т-клеток над однослойных культур. Мы также отметили, цитотоксичность гендерная проблематика, клейкой монослоя глиомы клеток после формирования кластерной накладным неадгезированных alloCTL. Кроме того, было отмечено горизонтальной трансдукция RRV-EMD от alloCTL к глиомы монослоя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Презентация Подготовка
- Вставьте сотовый седиментации в коллекторе слайды в мешочки стерилизации и печать с автоклава ленты. Лицо с тефлоновым покрытием сторону слайд бумаги сторона мешка, чтобы избежать пластиковые отложений на скважинах.
- Автоклав мешки течение 15 мин при 121 ° С.
- Удалить слайд из стерилизации сумке в шкафу биобезопасности и место в стерильной 150 х 15 мм стерильную чашку Петри. До четырех слайдов может поместиться на чашку. Поставьте 35 х 10 мм чашки Петри рядом с горками. Добавьте 2-3 мл стерильного H 2 O, чтобы обеспечить увлажнение.
- Pre-пальто слайды с поли-D-лизина в 100 мкг / мл с помощью достаточного объема для покрытия всей скважины. После одного часа при комнатной температуре, аспирации раствора и промыть поверхность и два раза с помощью пипетки 1X PBS на поверхности лунки.
- При желании можно добавить фибронектин и другие компоненты ECM, чтобы обеспечить сильную приверженность опухолевых клеток. Добавить фибронектин в 5 мкг / мл в достаточно объемной Thaт в лунки не высохнет в течение короткого периода времени при комнатной температуре.
- После 1 ч, аспирации остатки раствора и промыть в два раза с помощью пипетки вверх и вниз с 1x PBS.
- Держите PBS на скважинах до опухоли не готов к обшивке. Слайды тот же день.
- Урожай сливающийся колбу желаемого приверженцем типа опухолевых клеток. Количество жизнеспособных клеток с использованием красителя исключение трипанового синего с помощью световой микроскопии и ресуспендируют в 5 × 10 6 клеток / мл в адекватно-буферном роста средней например, минимальная поддерживающая среда Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), L- глутамина и пирувата натрия.
- Если флуоресцентные изображения из клейкого клеточной популяции желательно, маркер прилипшие клеточной популяции с жизненно флуоресцентным красителем или краской пролиферации клеток следующие протоколы, предусмотренные изготовителем.
- Плавно пипетки 10 мкл полной среды в каждую лунку слайд заботясь, чтобы избежать образования пузырьков в вэйLs, так как они могут предотвратить равномерное соблюдение опухолевых клеток.
- Добавить 2,5-5,0 × 10 4 клеток (5-10 мкл клеточной суспензии) в среде в каждой лунке (фиг.1А). Регулировка оптимального количества в зависимости от типа опухолевых клеток и числом дней роста желаемых. Большие опухолевые клетки или быстро растущие клетки может потребовать меньше клеток на начальном этапе. Доведите объем также до 40 мкл добавлением среды и пипетку вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.
- После того как все колодцы высевают, позволяют опухолевые клетки придерживаться при комнатной температуре, а затем поместите крышку на 150 х 15 мм чашки Петри и тщательно перемещайте антенну в 37 ° C / 5% CO 2 увлажненном инкубаторе в течение по крайней мере 24 часов.
- Изменение культуральную среду в день. Тщательно пипетки часть отработанного среды из монослоя и заменить свежей полной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за испарения, больший объем нужно будет добавить, чем был вывезен. Wells будет готов для анализа, когда даже confluent слой клеток присутствует. Это, как правило, через 1-3 дней после первоначального посева. - Промыть монослой осторожно один раз PBS, как описано в стадии 1,4 и либо перейти к шагу 2, если монослои желании или к шагу 1,13 ниже, чтобы извлечь белков ЕСМ в монослое.
- Сделать 0,5% Тритон-X (об / об) раствор в полной среде и добавить 30 мкл в каждую лунку. Пусть монослой переварить в капот в течение 2 мин, а затем дважды промывали полной средой с помощью пипетки, как описано выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: ECM слой может быть видимым с помощью световой микроскопии (рис 2). Используйте слайды сразу, или держать в полной среде в увлажненной CO 2 инкубаторе в течение 1-2 дней. Не позволяйте лункам высыхать.
2. Осаждение неадгезированных Т-клеток на слайд
- Если флуоресцентный томография неадгезированных клеточной популяции желательно, маркировать неадгезированных клеточных популяций с жизненной флуоресцентного красителя, таких как CFSE, сотовый Tracker Красной CMPTX или eFluor670, следуя протоколы, предусмотренные заводом-изготовителем, по крайней мере 1 час до начала анализа. С другой стороны, манипуляции, чтобы экспрессировать флуоресцентные белки, кодируемые вирусные векторы.
- Автоклав сотового оседания коллектор в автоклаве сумке, как описано в разделе 1.2 выше.
- Снимите влажной камере, содержащей тефлоновым покрытием слайды из инкубатора и место в кабинете биологической безопасности.
- Промыть скважин с 1x PBS с помощью пипетки вверх и вниз, а затем добавить 45 мкл полной среде, содержащей, по меньшей мере 10% сыворотки.
- Удалить коллектор из конверта стерилизации и тщательно скользить в течение скважин до "крючок" в конце коллектора касается нижней части ползуна (Фиг.1В).
- Убедитесь, что культуральная среда видна в каждом из каналов. Если ничего не видели, снять коллектор и добавить больше средних и соответствующую лунку, то заменить и проверить еще раз.
- Повторите шаг 2,5 для каждого чанNel коллектора, или на столько скважин по желанию.
- Граф неадгезированных клетки и ресуспендируют в размере не менее 1,0-2,0 х 10 5 / мкл. Составьте 1 мкл клеток и медленно пипетки их в канал (рис 1в). Сделайте это для каждой скважины лучшего.
- Оставьте весь загруженный устройство клеток, то есть, коллектор и слайд, внутри биологической капотом в течение 20-30 мин, чтобы клетки в канале осесть.
- Снимите коллектор, касаясь обеих сторон и аккуратно поднимите вертикально вверх от слайда, чтобы не нарушить клетки очагово высевают в центре скважин (рис 1D).
- Проверить каждую лунку, чтобы гарантировать, что не-адгезивные клетки были успешно высевают в центре и оставаясь в пределах окружности коллектора канала. В не-адгезивные клетки в идеале немного прилипать к монослоя или ECM и друг к другу, поэтому аккуратно перемещая выпасть не вызывают клеточный Pelleт расходиться. Не толкаться слайда.
3. флуоресцентной микроскопии
- При соответствующем экспериментальном оборудовании, выполните визуализацию после оседания подтверждается. В идеале, использовать микроскоп, оснащенный камерой СО 2 и влажности. Изображение на малой мощности, т.е. 4X или 10X, чтобы обеспечить несколько изображений, которые будут приняты большей площади, так что полнота скважины могут быть видны.
- Приобретать цифровых изображений с помощью программного обеспечения для съемки. Выполните светлого поля и / или изображений многоканальный флуоресценции.
- При желании, настроить покадровой записи изображения в различных каналов, по той или иной области, или оставить слайд увлажняется и в 37 ° C / 5% CO 2 инкубатора и вручную вывести на изображении в точках желаемое время (рис 1Е и F, рекомендуется для более длительных).
4. Анализ и отображение
- Использование ПО для редактирования изображений, объединить свет и ЭПuorescent изображения в один слой, так что несколько типов клеток и маркеров можно увидеть в том же изображении. Перетащите файлы изображений для каждого отдельного цвета в программе и, когда будет предложено, выберите опцию «Добавить слой", чтобы создать файл изображения с несколькими слоями.
- При большем увеличении, взять, выравнивания и склеивать изображения через скважины в цифровом виде. Выравнивание файлы, глядя на консервативных областей между двумя изображениями, и не накладывая одно изображение на верхней части другой, пока полное изображение генерируется.
- Добавить микрон баров на изображения во время съемки с использованием программного обеспечения захвата для определения расстояния отдельные клетки мигрировали.
- Для определения миграции клеток в различные моменты времени, делать карты интенсивности флуоресценции поверхность с программным обеспечением обработки изображений, т.е. ImageJ, количественно флуоресцентный агрегации или разнести во времени Т-клеток.
- Для создания графики поверхностей, принять слоистую изображение, созданное на шаге 4.1 и под окном Layers,снять все слои, кроме тех, соответствующих каналу желаемого. Например, если поверхность участка желательно, чтобы визуализировать выражение EMD, только «зеленые» слои, соответствующие фильтру, используемого для этого маркера должны быть видны.
- Свести изображение и сохранить его в формате, признанного (например, .png) и загрузить изображение в программу. Для создания поверхности сюжет, изменить тип изображения с 8-бит, изменить яркость / контрастность, сколько необходимо для уменьшения фона и выберите опцию "Анализ / Площадь участка». Изображения на рисунке 5, путем проверки "Тень", "Нарисуйте ось ',' один полигон на линии ', и' Smooth 'флажки.
- Кроме того, выполнять измерения, используя радиус или диаметр от месторождения фокальной клеток в нулевой момент времени и сравнить с клетками в крайнюю точку в различные моменты времени. Диаметр тефлоновой скважин 6,0 мм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Вирусные векторы, кодирующие флуоресцентные белки могут быть использованы в дополнение к, или вместо, флуоресцентным красителем. Вирусный трансдукция должны быть выполнены до начала моторики анализа. Как адгезивные и не адгезивные типы клеток могут быть дифференциально-меченных. Протокол трансдукции будет зависеть от типа используемого вектора. Здесь мы трансдуцировали alloCTL в цифрах 3, 5 и 6 с RRV-EMD по крайней мере два дня до начала анализа, используя протокол, описанный 12. Мы также использовали Lentiviral вектор, ЦМВ-клубнично-IRES-FLUC2, преобразовывать раковые клетки, чтобы выразить mStrawberry красный флуоресцентный белок (рисунок 4). Это трансдукции было достигнуто путем добавления вектора в колбу клеток в течение 48 ч, после чего добавл ют свежую среду. После того как клетки для восстановления в течение двух дней, лимитирующего разведения проводили для генерирования популяции 100% трансдуцированных клеток.
(рис 3 и 5). Люминесцентной микроскопии показывает клетки, изначально высевают в центре скважины, мигрируют от центра с течением времени. Образование alloCTL агрегатов после 4 ч (фиг.3, белые стрелки) может отражать аутокринных моделей роста, проявляемых активации IL-2-продуцирующих Т-клеточных популяций 13.
В другом эксперименте, мышиный эффектор alloCTL были сделаны с односторонним MLR использованием гаплотипов H-2d линии BALB / C ответчик спленоцитов и гаплотип H-2b / K стимулятор спленоцитов от мышей B6C3F1, штамм, к которому ТУ-2449 глиома сингенных. Непосредственно перед посевом через канал ТОн многообразия на опухолевых клеток монослоя, alloCTL окрашивали eFluor 670. alloCTL (фиолетовый клетки) высевали в центре установленных монослоев ТУ-2449 клеток глиомы (красный), которые были на 100% трансдуцированных с CMV-Straw- IRES-FLUC2 вирусный вектор, и высевали на скважинах день до анализа. Рисунок 4а и б, показывают микроскопических изображений, сделанных тем же квадранте той же скважине на 1 и 48 ч. Рисунок 4С и D были получены с использованием ImageJ для преобразования оцифрованного фиолетовый флуоресценции интенсивности в количественных поверхностных участков, которые отображаются в трехмерном формате.
Наконец, человек alloCTL были сделаны с инактивированной стимул мозга человека-тропные клеток, полученных из метастатических линии опухолевых клеток молочной железы MDA-MB-231BR по MLTR. Фиг.6 показывает легкие и флуоресцентной микроскопии изображений с течением времени неприлипшие CMPTX-меченого alloCTL, частично трансдуцировали RRV-EMD, мигрируя на ECM белков, экстрагированных Fрум эти опухолевые клетки. В (А) светлое поле микрофотография показывает фокусное размещение alloCTL сразу после осаждения. В (В и F) яркий микрофотографии поля показывают, что при 4 и 8 ч соответственно, alloCTL радиально миграции на ECM. Плотность alloCTL уменьшается с расстоянием от центра скважины (центр ямы верхний левый угол поля в BI). Панели (С и G) шоу Вся подготовка alloCTL окрашивали CMTPX; (D и H) показывают частичное трансдукцию alloCTL с RRV-EMD как указано небольшим числом EMD + Т-клеток, и (Е и I) показывают, объединенные образы RRV-EMD трансдуцировали alloCTL миграции на ECM вместе с untransduced alloCTL.
Рисунок монослоя клеток 2. опухолей и ECM высевали на CSM слайд скважин. Микрофотографии слайд скважин подготовленс (А) вырожденная U-87 мг монослоев клеток глиомы, или (б) ECM белков, экстрагированных из сливной U-87 мг окрашивали кумасси голубым красителем. Бар = 200 мкм. Щелкните здесь для большей версии этой фигуры.
Рисунок 3. Миграция и цитотоксичность RRV-EMD трансдуцированных лимфоцитов в центре и передний край депозита клеток в течение долгого времени. Флуоресцентные микрофотографии, сделанные в разное время на переднем крае и в центре alloCTL-RRV-EMD следующей седиментации на монослой прилипших клеток глиомы U-87 мг. Effector alloCTL высевают в отдельные клетки, образуют сферические кластеры в течение 4 ч (белые стрелки) размещения. Одноместный флуоресцентно-меченых CTL мигрировали от центра хорошоВремя прогрессирует. После 24 ч, пустые участки клеток в монослое клейкого видны предположительно из-за alloCTL цитолиза целевых опухолевых клеток (см зону в тире). Бар = 200 мкм. Щелкните здесь для большей версии этой фигуры.
Рисунок 4. Радиальное перемещение мышиной alloCTL окрашивали eFluor 670 на mStrawberry-меченых клеток глиомы, показанных на один и 48 ч. Флуоресцентные микрофотографии одного квадранта в той же скважине в (A) 1 ч и (В) 48 ч после осаждения флуоресцентно меченных неадгезированных alloCTL на монослой Ту-2449 клеток глиомы. Микрофотографии малой мощности отражают области, которые содержатся в одном квадранте КСМ а (радиус 3 мм). При высокой мощности (А и B, вкладки) аллоCTL (белые стрелки) показаны в непосредственной близости от или связанных с отдельными опухолевых клеток; один имеет дезинтегрированного внешний вид с фрагментированными ядрами и апоптическая. (С и D) соответствующая поверхность карты интенсивности флуоресценции получены с использованием ImageJ программного обеспечения, показывающий значения пикселей в цифровой форме фиолетовый флуоресцентный изображений в трехмерном графическом виде и помещают на сетку, представляющего радиус скважины 3 мм. Бар = 500 мкм. Щелкните здесь для большей версии этой фигуры.
Рисунок 5. Миграция alloCTL и горизонтальной распространения RRV-EMD от трансдуцированной alloCTL к опухолевым клеткам. Флуоресцентные микрофотографии последовательно сшиты вместе, чтобы покрыть радиус скважины с использованием программного обеспечения для редактирования изображений. Миграция RRV-EMD трансдуцировалиalloCTL (белые стрелки) показан на монослой U-87 мг опухолевых клеток при 0 и 72 ч следующего осаждения. RRV-EMD трансдукции опухолевых клеток в монослое также очевидно при 72 ч после добавления EMD-трансдуцированных alloCTL, указывая, что горизонтальная передача инфекционного RRV из лимфоцитов в отношении опухолевых клеток произошло (белая коробка, и вставку). Бар = 200 мкм. Щелкните здесь для большей версии этой фигуры.
Рисунок 6. Радиальная миграция alloCTL трансдуцировали RRV-EMD и окрашивали CellTracker Красной CMTPX. Клетки осаждали на ECM экстрактов, полученных из MDA-MB-231BR клеток. Миграция alloCTL была отображена в светлом поле оптического микроскопа при 0, 4 и 8 ч (А, В, F столбец 1, соответственно). Fluoreзапах образы CMPTX (красный) помечены alloCTL (C, G, колонка 2), RRV-EMD (зеленый) трансдуцировали alloCTL (D, H, колонка 3), а объединенные изображения (E, I, колонка 4) показан на 4 и 8 ч. Бары = 200 мкм; Бар показано на B, применимого к изображений CI. Нажмите здесь для большей версии этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Опухолевые клетки в суспензии отдельных клеток пипеткой в лунки тефлоном маскируется слайда. Клетки дают возможность прилипать, а затем формируется монослоев в увлажненной 5% CO 2, 37 ° С инкубатор (фиг.1А). Установленные монослои или ECM белки, полученные из монослоя могут быть собраны для этих анализов (фиг.1В). Эффекторные Т-лимфоциты, помеченные витальных красителей люминесцентных или трансдуцированные векторов, кодирующих EMD высевают в центре скважины с использованием КСМ. Способность неприлипающих эффекторных Т-лимфоцитов мигрируют на однослойных или ECM белков с течением времени был затем оцениваются и количественно светом и флуоресцентной микроскопии. Здесь, мы оценили миграцию и цитотоксичность не соблюдают эффекторной alloCTL на монослой частично релевантных целевых U-87 мг клеток глиомы (Рисунки 3 и 5). Эти клетки-мишени, отображающие только некоторые из организме человека антиген лейкоцитов(HLA) молекулы (HLA-A2, B44) на оригинальные стимуляторы, были использованы для уменьшения сильной литическую активность, которая будет отображаться на alloCTL соответствующим 13-06 мг клеток-мишеней (HLA-B44 и A1,2 , 57). Мы также наблюдали подвижность alloCTL на ECM собранного из монослоя MDA-MB-231BR опухолевых клеток молочной железы (фиг 6). AlloCTL были получены с помощью односторонней MLTR в соответствии с методами ранее опубликованных 9. Effector alloCTL собирали через 4-5 дней после односторонней MLTR и трансдуцировали RRV-GS4-EMD (Рисунки 3 и 5) или RRV-ACE-EMD (Рисунок 6) 10,11. Более высокие уровни трансдукции были достигнуты с вектором GS4 использующей Гиббон обезьяна вируса лейкоза конверт, чем с амфотропный вектор ACE. Использование этой радиальной миграции анализа, мы отметили, что оба трансдуцировали и nontransduced флуоресцентно-меченых alloCTL было миграционную способность. Мы также продемонстрировать, что они сохраняют свою способность к CYTotoxic после прохождения манипуляции для RRV трансдукции.
Способность мышиного alloCTL мигрировать также оценивали (рисунок 4). alloCTL чувствительным к гаплотипа H-2b / к отображаемой Ту-2449 клеток окрашивали eFluor 670 (фиолетовый) и миграция анализ проводили с использованием Ту-2449, трансдуцированную CMV-соломенно-IRES-FLUC2 (красный). При использовании полностью соответствующую цели, меньшее количество alloCTL эффекторных клеток высевали, чтобы предотвратить быстрое лизис опухолевых клеток мишеней. Использование 1 ч в качестве основы, Т-клетки в основном локализованы при высокой плотности в центре также суспензии отдельных клеток. В 48 ч микрофотографии показывают обширную миграцию Т-клеток по отношению к внешнему краю колодца и кластеризации alloCTL является очевидным при разрушении клеток опухоли в месте их первоначального депозита. Распространение ТУ-2449 клеток свидетельствует как mStrawberry меченые клетки увеличение плотности над хорошо. Это лучше видно в поверхностифлуоресценции участки, которые были созданы для визуализации распределения пурпурных клеток в лунках (рис 4, нижняя панель). AlloCTL мобильности гораздо более очевидны в скважине на 48 ч по сравнению с 1 ч базовой линии. Подобно тому, как это видно в анализах с использованием alloCTL и клеток глиомы человека, зазор опухолевых клеток вокруг области начального депозита эффекторов заметно при 48 ч, что свидетельствует лизис опухолевых клеток-мишеней.
Важным шагом в этом анализе является рост здоровых монослоев и последующего урожая "скелета" ECM. Посев клеток опухоли в 2,5 - 5,0 х 10 4 клеток на лунку, в соответствии со стадией 1,9 и выше, как правило, приводит к примерно даже монослоя для типов опухолевых клеток, которые мы использовали. Мы обнаружили, что важно, чтобы опухолевые клетки придерживаться при комнатной температуре, в противном случае конвекции, которая происходит при температуре 37 ° С будет толкать клетки к центру лунки. Кроме того, предварительно покрытие Wi скважинго поли-D-лизина и / или ЕСМ белок, такой как фибронектин или коллаген может значительно увеличить вероятность успеха. Кроме того, у нас было больше шансов на успешное этих анализов с помощью монослоя, полученного "скелета" ECM, чем отдельные компоненты ECM (т.е.., Фибронектин, коллаген), которая оказалась гораздо менее надежны. Важно, чтобы поэкспериментировать с количеством прикрепленных клеток, не являющихся для нанесения через коллектор седиментации, а также и при использовании чистого типа клеток, можно теоретически иметь возможность определить коэффициент подвижности с этим анализом. Поскольку объем и мало, а некоторые испарение среды происходит, монослой должен быть пополнен в день свежей средой. Замена средства массовой информации также предотвращает накопление токсичных лактата в клетки растут и делятся. Отказ культивировать здоровый монослой может привести в потере монослоя или ECM от поверхности скважины.
Кумасси синий окрашенные белки ECM, полученные от U-87 мг глиомы элементная литийNE в соответствии с этапом 1,13 выше, показаны в качестве визуального примера клейкого слоя подложки, оставленных после переваривани Triton X-100 (Фиг.1В). Производство ЕСМ от линии карциномы молочной железы клеток, MDA-MB-231BR клетки, часто был неоднородным, и тонкий, в результате чего ECM слой, который был слабее, а иногда и прилипший поднимается от ползуна во время теста. Соблюдение ECM белок к слайду улучшается, когда опухолевые клетки поддерживали в сливающихся монослоев в течение 1-2 дней до пищеварения. На протяжении всего процесса, обеспечение тефлоновое уплотнение окружающих скважину был также очень важна. Поддержание объема низкой и сведения к минимуму воздействия на тефлона в растворе Triton-X100 уменьшены повреждения целостности тефлоновое уплотнение.
Один адаптация этого протокола может быть использование трехмерной внеклеточной матрицы заготовленной от разделах ОКТ встроенной опухолевой ткани 14. Тем не менее, следует отметить, что расстояние от плоской BottOMED скважины на поверхность скольжения, только 1 мм; Таким образом, участки, превышающие этот толщину может быть нарушена путем размещения многообразии. Кроме того, способ должны быть разработаны для изготовления небольшой заусенцев отверстие в ткани, чтобы принять каплю среды, содержащей не-адгезивные клетки.
Подготовка хорошо диспергированной одного суспензии клеток эффекторных Т-лимфоцитов в заранее осаждения было просто необходимо. Нежный tituration из неприлипающих Т-клеток, чтобы разогнать агрегатов к одной клеточной суспензии было важным шагом прямо перед загрузкой alloCTL в каналах CSM. Использование неферментативного клеточной диссоциации буферов следует использовать, если это необходимо. Кроме того, плотность эффекторных лимфоцитов должно быть около 1,0 - 2,0 х 10 5 клеток / мкл дл седиментации, как описано в стадии 2,8 выше. Номера Низкие клеток может привести к отсутствию седиментации, в то время как более высокие количества клеток может привести к большой депозит, который легко нарушить при перемещениискользить. Рекомендуется также, что концентрация сыворотки в среде, по меньшей мере 10%, чтобы обеспечить адекватную поверхностное натяжение положительного мениска, что снижает возможность перелива.
Перевернутый оптический микроскоп с возможностью флуоресцентной томографии и 4-кратным или 10-кратным целей является оптимальным для данного анализа. Моменты времени для работы с изображениями может быть определена в соответствии с индивидуальными экспериментальных запросов и типов клеток. Не соблюдают CTL, в частности, перенести из центра осаждения к краю и быстрее на ECM белков (4-8 ч), чем за клеточный монослой (12-72 ч). Частично МНС соответствующие клетки-мишени были предпочтительнее соответствующих целей для нашей alloCTL анализа поощрения визуализации подвижности и снижения клеточного цитолиза монослоев до возможен значительный миграция; Применение низкой эффектора целевой коэффициент также замедляет лизис. Использование частично подобранных задач позволяет для лучшей визуализации RRVпередача опухолевых клеток, а также.
Использование инвертированного микроскопа дает несколько преимуществ по сравнению с вертикальной рамки. Объем перевернутой позволяет визуализации через влажной камере, так что скользит не должны быть нарушена, а также поддержание стерильной среды для клеток. Кроме того, изображения через камеру обеспечивает барьер между образцом и технике, что позволяет по соблюдению биологической безопасности II уровня (BSL II) Руководящие принципы при работе с человеком происходит ткани 15.
При использовании вертикальное область, максимальном увеличении достижимо, не нарушая положительный мениск скважину в 20 раз. К сожалению, использование покровным или оптика комплект аксессуаров к сотовым оседания коллектора, не рекомендуется, так как нарушение мениска, как правило, приводит к распространению осажденных неприлипающих клеток по всему хорошо. Изображений в течение длительных периодов времени, возможно, требует осторожного добавления Medий в каждую лунку, чтобы заменить, что потеряли испарения, хотя это, скорее всего, потребуется во время съемки в заданный промежуток времени.
Этот протокол отличается от методов, которые измеряют горизонтальную миграцию клеток адгезивных клеток в Zigmond палат 16,17, дизайн которых не позволит визуализации неадгезированных миграции клеток. Другие анализы, которые оценивают горизонтального переноса в направлении хемотаксиса градиента через подложку, такую как агар, как правило, используется для изучения миграции клеток одного типа 18-20. Использование CSM обеспечивает несколько преимуществ этих методов, а также методы, которые измеряют вертикальной миграции / вторжение культивируемых клеток, например, в Бойдена камер или Матригель Transwell пластин. Во-первых, клетка-клетка контакт позволяет для определения взаимодействия клеток целевой эффекторной и травматизма эффекторных клеток. Цитолитический способность alloCTL-RRV-EMD первоначально стимулируется односторонним MLTR с стимуляторов 13-06-МГ опухолевых клеток к Партиейсоюзник МНС-клеточная линия соответствует U-87 мг видно в центре монослоя на 24 и 72 ч следующие седиментации (фиг.3 и 5, пунктирные линии). Кроме того, деградация Ту-2449 клеток мышиным alloCTL виден на 48 ч после осаждения (рисунок 4). Монослой уничтожены в центре alloCTL депозита, но происходит более медленно, в течение оставшейся части монослоя, вследствие либо с перекрытием в экспрессии HLA-13-06 мг и U-87 мг в анализах с клетками человека 21 или низкий стартовый номер эффекторных клеток для мышей глиомы. Кроме того, эффектора к мишени плотность снижается, как эффектор alloCTL мигрируют от седиментации сайта. В дополнение к миграции и цитолиза, этот протокол может быть использован для визуализации передачу кодирования флуоресцентных белков вируса. Здесь передача RRV кодирования для EMD от alloCTL к опухолевых клеток, очевидно, после 72 часов (рис 5, вставка).
Ограничение этой модели является то, что миграция может быть оценена только в пробирке, которая не может быть по-настоящему отражать в естественных условиях миграции. Еще одно ограничение является то, что градиенты хемокинов / хемокинов рецепторов не может быть установлена с помощью модели. В то время как взаимодействие иммунных клеток с ECM или отдельных опухолевых клеток может еще произойти и зависят от того, что эти клетки секретируют или выразить, это моторику задницуай не будет отвечать на вопросы относительно того, неадгезивные клетки мигрируют специально для или от отдельных факторов.
Преимущество такого анализа является возможность определить, является ли население, не прилипшие клетки поддерживают миграционную функциональность, если лимфоциты имеют или не были трансдуцированных. В нашем примере, трансдуцированных субпопуляции виден через экспрессии белка EMD, и ясно, что мигрирующие функциональность поддерживается в этой подгруппе. Более широкое применение может быть, чтобы проверить действие различных концентраций агентов или лекарств, которые могут повлиять на неприлипающими миграцию иммунных клеток. Кроме того, другие кроветворные клетки могут быть проверены на мобильности на различных подложках или прикрепленных клетках, полученных из нормальной ткани. Наконец, хотя это не сделано здесь, посев комбинацию адгезивных типов клеток, то есть клеток стромы или дендритных клеток с опухолевыми, может обеспечить отражательный анализ более сложных в естественных условиях,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Работа частично поддержана NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA аст Грант Количество UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, и Холмс исследовательского фонда Джоан С. Мемориал. MJH и ОПО получили поддержку из Джоан С. Холмс Мемориал докторантуру в Лос-Анджелесе. Устройство CSM была получена из творческих научных методов: www.creative-sci.com. Лентивирусный вектор был получен из Калифорнийского университета Векторный Core, которая поддерживается CURE / P30 DK041301.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μl Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μl Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
- Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
- Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
- Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. Determinants of human astrocytoma migration. Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).
- Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
- Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
- Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
- Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
- Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
- Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
- Prevention, C. fD. C. a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5 edn, Health and Human Services. (2009).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
- Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
- Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).
