Abstract
Vi rapporterar en ny anpassning av Radial Monolayer cellmigrationsassay, rapporterades först för att mäta den radiella migration av vidhäftande tumörceller på extracellulära matrisproteiner, för att mäta motilitet av fluorescensmärkta, icke vidhäftande humana eller murina effektorceller immunceller. Denna teknik använder en rostfri grenrör stål och 10 brunnar Teflon bild till fokalt deponera icke-vidhäftande T-celler i brunnar preparerade med antingen sammanflytande tumörcellmonoskikt eller extracellulära matrixproteiner. Ljus och / eller flerkanals fluorescensmikroskopi används för att spåra rörelse och beteende effektorcellerna över tiden. Fluorescerande färgämnen och / eller virala vektorer som kodar för fluorescerande transgener används för att differentiellt märka celltyper för avbildning. Denna metod skiljer sig från liknande typ in vitro-analyser som spårar horisontell eller vertikal migration / invasion utnyttjar glidkamrar, agar eller Transwell plattor. Analysen ger detaljerade bilddata till be samlats med olika celltyper kännetecknas av specifika fluorescerande markörer; även specifika subpopulationer av celler (dvs, omvandlade / nontransduced) kan övervakas. Surface intensitetsfluorescens tomter genereras med hjälp av specifika fluorescenskanaler som motsvarar till typen vandrande cellen. Detta möjliggör bättre visualisering av icke vidhäftande immuncell rörlighet vid specifika tidpunkter. Det är möjligt att inhämta uppgifter om andra effektorcellpopulationerna funktioner, såsom cytotoxicitet eller överföring av virala vektorer från effektor till målceller, liksom. Sålunda tillåter metoden forskare att mikroskopiskt dokumentera cell-till-cell-interaktioner av differentiellt märkt, icke vidhäftande med vidhäftande celler av olika typer. Sådan information kan vara särskilt relevant vid bedömningen av biologiskt manipulerade eller aktiverade immuncelltyper, där visuell bevis på funktionalitet önskas med tumörmålceller innan de används för cancerbehandling.
Introduction
De radiella Monolayer cellmigrationsassay utvecklades ursprungligen för att mäta infiltrativa egenskaper vidhäftande tumörceller 1-4 på objektglas belagda med extracellulär matris (ECM) -proteiner 5-7 eller med individuella ECM-komponenter, såsom fibronektin eller laminin 1,2. Tekniken involverade sådd en enkelcellsuspension av tumörceller i centrum av brunnarna med en rostfri cellsedimentegrenrör (CSM). Efter sedimentering, skulle tumörcellerna vidhäfta till botten av brunnen och förändringen i diametern hos den ursprungliga cellpopulationen över tiden användes för att etablera en hastighet av horisontell motilitet. Den Radial Monolayer cellmigrationsassay en visuell fördel jämfört med andra befintliga metoder som används Transwell plattor för att analysera den flyttande kapacitet in vitro av celler; dessa analyser är icke-främjar avbildning 8. Samt, förutsatt att den också en stor mängd frihet i valet av tidpunkts när migrationen bedöms, utan någon begränsning på antalet tidpunkter en forskare kan välja att bilden efter sedimentering.
Eftersom förmågan att migrera är en viktig funktionalitet för icke vidhäftande celler, speciellt inom området för immunbehandling eller där de kan användas som avgivningsvehiklar för virala vektorer anpassade vi användningen av CSM till utvärdera migration av icke-vidhäftande celler typer på tumörcellmonoskikt, förutom ECM-proteiner. Den ytterligare fördelen med mikroskopiskt visualisera migration av icke-vidhäftande celler på viabla tumörcellmonoskikt, på komplexa ECM isolerats från tumören, eller om enskilda ECM-komponenter gör denna analys mångsidig. Analyser som anställer brunnar belagda med ett enda extracellulärt protein återspeglar inte exakt ECM vävnadssubstrat eller tumör cellerna skulle migrera genom in vivo.
Här använde vi alloreaktiva cytotoxiska T-lymfocyter (alloCTL), är känsliga för stora histocompatibility komplex (MHC) proteiner med hjälp av envägs blandad lymfocyt tumörcellsreaktioner (MLTR) eller blandade lymfocytreaktioner (MLR) 9, som vår representant icke vidhäftande celltyp. Vi testade celler av både mänskligt och murint ursprung. När migrationen mättes på tumörmonolager, tumörcellerna som användes var antingen delvis relevanta mål och visar några av de samma MHC proteiner som finns på cellpopulationen som används för att medvetandegöra de effekten eller helt relevanta mål, med en full uppsättning av MHC-molekyler som effekten hade sensibiliserade mot. I vissa experiment använde vi fluorescerande Celltracker Röd CMPTX eller cellproliferation färgämne eFluor 670 att skilja mellan effektorceller och målceller. Vi använde också transduktion med virala vektorer kodning för fluorescerande proteiner som ytterligare ett sätt att visualisera cellerna. För vissa analyser, omvandlade vi alloCTL med retrovirala replikering vektorer (RRV) som kodar för Emerald Green (EMD) fluorescerande protein 10,11; för othERS, var tumörceller transducerade med lentivirusvektorer kodande för mStrawberry.
Den alloCTL såddes genom en kanal av grenröret in i mitten av antingen tumörcellmonoskikt eller ECM skördade från tumörcellmonoskikt. Vidhäftande och icke-vidhäftande cell interaktioner visualiserades genom ljus och / eller genom fluorescensmikroskopi med tiden. Störningar i tumörcellen monolager vid låg effekt, eller tumörceller med fragmente kärnor på hög effekt var indikatorer på cellskada efter lys och apoptos, respektive. Vi skapade digitalt ytan intensitet fluorescerande kartor som visar migreringen av icke-vidhäftande fluorescerande T-celler över monolagerkulturer. Vi noterade också cytotoxicitet framkallade den vidhäftande gliom encellsskiktet efter klusterbildning av det överlagrade icke vidhäftande alloCTL. Som väl var horisontell transduktion av RRV-EMD från alloCTL till gliom monolager observeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Skjut Förberedelse
- Sätt Cell Sedimenterings Manifold glider in steriliseringspåsar och försegla med autoklav tejp. Face the teflonbelagd sida av bilden papperssidan av påsen för att undvika plastavlagringar på brunnarna.
- Autoklav påsar för 15 minuter vid 121 ° C.
- Ta bort bild från sterilisering påse inuti en biosäkerhet skåp och plats i en steril 150 x 15 mm steril petriskål. Upp till fyra diabilder kan passa per maträtt. Placera en 35 x 10 mm petriskål intill bilderna. Lägg 2-3 ml sterilt H2O för att ge befuktning.
- Förbeläggning glasen med poly-D-lysin vid 100 | ig / ml genom användning av tillräcklig volym för att täcka hela väl. Efter en timme vid RT, aspirera lösningen och skölj ytan av brunnen två gånger genom att pipettera 1 x PBS över ytan av brunnarna.
- Du kan också lägga fibronektin eller andra ECM-komponenter för att säkerställa starkare tumörcells följsamhet. Lägg fibronektin vid 5 mikrogram / ml i tillräcklig volym that brunnarna torkar inte inom en kort tidsperiod vid RT.
- Efter 1 timme, aspirera överblivna lösningen och tvätta två gånger genom att pipettera upp och ned med 1x PBS.
- Håll PBS på brunnarna tills tumören är klar för plätering. Användning glider samma dag.
- Skörda en konfluent kolv av den önskade vidhäftande tumörcelltypen. Räkna livskraftiga celler med användning av trypanblått färgexklusion med Ijusmikroskopi och återsuspendera vid 5 x 10 6 celler / ml i ett adekvat-buffrat odlingsmedium, till exempel Dulbeccos minimala essentiella medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS), L- glutamin och natriumpyruvat.
- Om fluorescerande avbildning av den vidhäftande cellpopulationen önskas, märka den vidhäftande cellpopulationen med en vital fluorescerande färgämne eller en cellproliferations färgämne genom att följa de protokoll som tillhandahålls av tillverkaren.
- Väl pipett 10 ul av komplett medium i varje brunn av sliden var noga med att undvika att skapa bubblor i wells, eftersom dessa kan förhindra jämn tumörcells följsamhet.
- Lägg 2,5-5,0 x 10 4 celler (5-10 il cellsuspension) till mediet i varje brunn (Figur 1A). Justera det optimala antalet beroende på tumörcelltypen och antalet dagar av tillväxt önskas. Större tumörceller eller snabba växande celler kan kräva färre celler initialt. Ta väl volym upp till 40 | il genom tillsats av medium och pipett upp och ner för att säkerställa en jämn fördelning av celler.
- Efter alla brunnar är seedade, tillåter tumörcellerna att fästa vid RT, sedan placera locket på 150 x 15 mm petriskål och försiktigt flytta skålen till en 37 ° C / 5% CO2 fuktad inkubator i minst 24 timmar.
- Ändra odlingsmediet dagligen. Försiktigt pipettera en del av det använda mediet från monolagret och ersätta med färskt komplett medium.
OBS: På grund av avdunstning, kommer mer volym måste läggas än togs ut. Wells kommer att vara redo för analys när en jämn, conflödet lager av celler är närvarande. Detta är vanligtvis 1-3 dagar efter initial ympning. - Tvätta cellslager försiktigt en gång med PBS som beskrivs i steg 1,4 och antingen gå vidare till steg 2 om monolager önskas, eller till steg 1.13 nedan för att utvinna ECM-proteiner från monolager.
- Gör en 0,5% Triton-X (volym / volym) lösning i komplett medium och tillsätt 30 | il till varje brunn. Låt monoskikt smälta i huven för 2 minuter, tvätta sedan två gånger med fullständigt medium genom pipettering såsom beskrivits ovan.
OBS: ECM skiktet kan vara synligt genom Ijusmikroskopi (figur 2). Använd diabilder direkt, eller hålla komplett medium i fuktad CO2 inkubator under 1-2 dagar. Låt inte brunnarna torka ut.
2. Sedimente av icke-vidhäftande T celler på Slide
- Om fluorescerande avbildning av icke vidhäftande cellpopulation önskas, märka de icke-adherenta cellpopulationer med en vital fluorescerande färgämne, såsom CFSE, Cell Tracker Red CMPTX eller eFluor670 genom att följa de protokoll som tillhandahålls av tillverkaren minst 1 timme före analysen. Alternativt manipulera celler att uttrycka fluorescerande proteiner som kodas av virala vektorer.
- Autoklav cellsedimente grenrör i en autoklav påse som beskrivs i 1.2 ovan.
- Avlägsna fuktad kammare som innehåller teflon belagda diabilder från inkubatorn och plats i biologiska säkerhetsskåp.
- Tvätta brunnarna med 1 x PBS genom att pipettera upp och ned, tillsätt sedan 45 | il fullständigt medium som innehåller minst 10% serum.
- Ta bort grenröret från steriliserings kuvertet och skjut försiktigt in över brunnarna tills "kroken" i slutet av grenröret vidrör botten av bilden (Figur 1B).
- Se till att odlingsmediet är synlig i var och en av kanalerna. Om ingen ses, ta av grenröret och tillsätt mer medium till motsvarande brunn, sedan tillbaka och kontrollera igen.
- Upprepa steg 2,5 för varje channel av grenröret, eller så många brunnar som önskas.
- Räkna icke vidhäftande celler och slamma på inte mindre än 1,0-2,0 x 10 5 / l. Rita upp 1 l av celler och långsamt pipett dem i kanalen (Figur 1C). Gör detta för varje brunn önskas.
- Lämna hela cellen laddad anordning, dvs grenröret och skjut, inuti bio-huven för 20-30 min för att tillåta cellerna i kanalen sedimentera.
- Ta grenröret genom att trycka båda ändar och försiktigt lyfta den rakt upp från bilden så att inte störa cellerna fokalt ympade i mitten av brunnarna (Figur 1D).
- Inspektera varje brunn för att säkerställa att de icke-vidhäftande cellerna har framgångsrikt såddes vid centrum av den väl vistas inom omkretsen av grenrörskanal. De icke-vidhäftande cellerna kommer idealt något hålla sig till monolager eller ECM och till varandra, därför försiktigt flytta sliden runt kommer inte att orsaka cell pellet att skingra. Inte trängs bilden.
3. Fluorescensmikroskopi
- Med lämplig experimentell utrustning, utför avbildning efter sedimente bekräftas. Helst använder ett mikroskop som är utrustad med en CO 2 och fuktkammare. Bild på låg effekt, dvs 4X eller 10X, för att möjliggöra flera bilder som ska vidtas av ett större område så att hela den väl kan ses.
- Förvärva digitala bilder med hjälp av bildbehandlingsprogrammet. Utför bright och / eller flerkanals fluorescens avbildning.
- Om så önskas, skapa en time-lapse för att spela in bilder i olika kanaler under ett visst område, eller hålla glid fuktad och i en 37 ° C / 5% CO2 inkubator och manuellt ta ut till bilden vid tidpunkter önskade (Figur 1E & F, rekommenderas för längre tidspunkter).
4. Analys och visning
- Använda bildbehandlingsprogram, slå samman ljus och fluorescent bilder till ett skikt så att flera celltyper och markörer kan ses i samma bild. Dra och släpp bildfilerna för varje enskild färg i programmet och, när du uppmanas, välj "Lägg Layer" alternativet för att skapa en bildfil med flera lager.
- Vid större förstoring, ta, rikta, och sy ihop bilder över brunnen digitalt. Rikta filer genom att titta på konserverade regioner mellan två bilder och överliggande en bild ovanpå den andra tills en fullständig bild genereras.
- Lägg micron barer till bilder under förvärvs använder fånga mjukvaran för att bestämma avstånd enskilda celler har migrerat.
- För att bestämma cellmigration vid olika tidpunkter, gör ytan intensitet fluorescens kartor med bildbehandlingsprogram, dvs ImageJ, att kvantifiera fluorescerande T-cell aggregering eller spridas över tiden.
- För att generera ytan tomter, ta en skiktad bild genererad i steg 4.1 och under Layers fönstret,avmarkera alla lager utom de som motsvarar önskad kanal. Till exempel, om en yta tomt önskas att visualisera EMD uttryck bör endast de "gröna" lager som motsvarar filtret som används för denna markör vara synlig.
- Platta bilden och spara den i ett filformat erkänd (t.ex. .png) och ladda in bilden i programmet. För att generera ytan tomten, ändra typ bild till 8-bit, ändra ljusstyrka / kontrast som behövs för att minska bakgrunden, och välj "Analyze / Surface Plot" alternativet. Bilderna i figur 5 genererades genom att kontrollera "Skugga", "Rita Axis," One Polygon Per Line ", och" Smooth "kryssrutor.
- Alternativt kan du ta mätningar med radien eller diametern från bränncell deposition vid noll och jämför med cellerna vid den yttersta punkten vid olika tidpunkter. Diametern av Teflon brunnar är 6,0 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virala vektorer som kodar för fluorescerande proteiner kan användas som tillägg till eller i stället för, fluorescerande färgämne. Viral transduktion bör utföras i god tid före motilitet analysen. Både vidhäftande och icke-vidhäftande celltyper kan vara differentiellt märkt. Protokollet för transduktion kommer att bero på den typ av vektor som används. Här, omvandlade vi alloCTL i figurerna 3, 5 och 6 med RRV-EMD minst två dagar i förväg för analysen med hjälp av protokoll som beskrivs 12. Vi använde också en lentivirusvektor, CMV-jordgubb-IRES-FLUC2, att omvandla tumörcellerna att uttrycka mStrawberry röda fluorescerande protein (Figur 4). Denna transduktion åstadkoms genom tillsats av vektorn till kolven med celler för 48 h, vid vilken punkt, var färskt medium tillsattes. Efter att tillåta cellerna att återhämta sig i två dagar, begränsande utspädning utfördes för att generera en population av 100% transducerade celler.
(figurerna 3 och 5). Fluorescensmikroskopi visar celler, som ursprungligen ympats vid centrum av brunnen, migrera bort från centrum med tiden. Bildningen av alloCTL aggregerar efter 4 h (fig 3, vita pilar) sannolikt reflekterande av autokrina tillväxtmönster som uppvisas av aktiverad, IL-2-producerande T-cellpopulationer 13.
I ett annat experiment var murin effektor alloCTL gjorts av envägs MLR med användning av haplotyp H-2d Balb / c-responder-splenocyter och haplotyp H-2b / k stimulator splenocyter från B6C3F1-möss, den stam som TU-2449 gliom är syngen. Omedelbart före sådd genom kanalen för tHan lare på tumör encellsskiktet, var den alloCTL färgas med eFluor 670. alloCTL (lila celler) såddes i mitten av etablerade monolager av TU-2449 gliomceller (röda) som var 100% omvandlade med CMV-Straw- IRES-FLUC2 viral vektor, och pläterade på brunnar dagen före analysen. Figur 4A och B visar mikroskopiska bilder tagna av samma kvadrant av samma brunn vid 1 och 48 tim. Figur 4C och D genererades med ImageJ att konvertera digitaliserad lila fluorescens intensiteter i kvantitativa yta tomter som visas i tredimensionella formatet.
Slutligen var humant alloCTL gjordes med inaktiv stimulatorceller humana hjärn-tropism celler härledda från den metastatiska brösttumör cellinje MDA-MB-231BR av MLTR. Figur 6 visar ljus och fluorescensmikroskopi bilder över tid av icke vidhäftande CMPTX-märkt alloCTL, delvis transducerad med RRV-EMD, migrera på ECM-proteiner extraherade from dessa tumörceller. I (A) den ljusa fältet mikrofotografiet visar fokal placering av alloCTL omedelbart efter sedimentering. I (B och F) ljusa fält fotomikrografier visar, vid 4 och 8 timmar, respektive den alloCTL radiellt migrera på ECM. Den alloCTL tätheten minskar med avståndet från centrum av brunnen (mitten av brunnen är övre vänstra hörnet av fältet i BI). Paneler (C och G) show hela alloCTL beredningen färgas med CMTPX, (D och H) visar partiella transduktion av alloCTL med RRV-EMD såsom indikeras av ett litet antal EMD + T-celler, och (E och I) visar de sammanslagna bilder av RRV-EMD transducerade alloCTL migrerar på ECM tillsammans med otransducerade alloCTL.
Figur 2. Tumörcellmonoskikt och ECM pläterade på CSM glidbrunnar. Mikrofotografier av glidbrunnar bereddamed (A) sammanflytande U-87 mg gliom-cellmonoskikt, eller (B) ECM-proteiner extraherade från konfluenta U-87 mg färgades med Coomassie blue färgämne. Bar = 200 nm. Klicka här för en större version av denna siffra.
Figur 3. Migration och cytotoxicitet av RRV-EMD omvandlade lymfocyter i centrum och framkanten på cell deposition över tiden. Fluorescerande mikrofotografier tagna vid olika tidpunkter i framkant och i mitten av alloCTL-RRV-EMD efter sedimentation på ett monolager av vidhäftande U-87 mg gliomceller. Effector alloCTL seedade som enskilda celler, bildar sfäriska kluster inom 4 timmar (vita pilar) för placering. Single fluorescensmärkt CTL har migrerat från mitten av brunnen ens tiden går. Efter 24 timmar, tom cell fläckar i vidhäftande monolager syns förmodligen på grund av alloCTL cytolys av tumörmålceller (se område inom streck). Bar = 200 nm. Klicka här för en större version av denna siffra.
Figur 4. Radiell migration av murin alloCTL färgas med eFluor 670 på mStrawberry Märkta gliomceller som visas vid ett och 48 h. Fluorescerande mikrofotografier av en kvadrant av samma brunn av (A) en timme och (B) 48 h efter sedimentering av fluorescens -märkt icke vidhäftande alloCTL på ett monolager av TU-2449 gliomceller. De låga effekt fotomikrografier spegla området finns inom en kvadrant av CSM väl (radie 3 mm). Vid hög effekt (A och B, inlägg) alloCTL (vita pilar) visas i anslutning till eller associeras med enskilda tumörceller; man har en sönder utseende med fragmente kärnor och är apoptotiska. (C och D) respektive yta intensitet fluorescens kartor erhållits med ImageJ programvara visar pixelvärdena för de digitaliserade lila fluorescerande bilder i tredimensionell grafisk form och placeras på ett rutnät som representerar väl radien av 3 mm. Bar = 500 nm. Klicka här för en större version av denna siffra.
Figur 5. Migration av alloCTL och horisontell spridning av RRV-EMD från transducerad alloCTL till tumörceller. Fluorescerande mikrofotografier seriellt sys ihop för att täcka radien av brunnen med hjälp bildredigeringsprogram. Migration av RRV-EMD transduceradalloCTL (vita pilar) visas på ett monolager av U-87 mg tumörceller vid 0 och 72 timmar efter sedimentation. RRV-EMD transduktion av tumörceller i monoskiktet är också uppenbar vid 72 h efter tillsats av EMD-transducerade alloCTL, vilket indikerar att horisontell överföring av infektiösa RRV från lymfocyter till tumörceller har skett (vita rutan, och infälld). Bar = 200 nm. Klicka här för en större version av denna siffra.
Figur 6. Radial migration av alloCTL transducerad med RRV-EMD och färgas med Celltracker Red CMTPX. Cellerna sedimenterades på ECM extrakt härledda från MDA-MB-231BR celler. Migration av alloCTL avbildades genom ljusa fält Ijusmikroskopi vid 0, 4 och 8 h (A, B, F kolumn 1, respektive). Fluoredoft bilder av CMPTX (röd) märkt alloCTL (C, G, spalt 2), RRV-EMD (grön) transducerad alloCTL (D, H, kolumn 3), och de sammanslagna bilderna (E, I, kolumn 4) är visas vid 4 och 8 h. Staplar = 200 pm; Bar visas i B gäller bilder CI. Klicka här för en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumörceller i en enkelcellsuspension pipetterades i brunnarna i en Teflon-maskerad bild. Cellerna fick fästa och sedan bildade monoskikt i en fuktad 5% CO2, 37 ° C inkubator (Figur 1A). Etablerade monolager eller ECM-proteiner som härrör från monolager kunde skördas för dessa analyser (Figur 1B). Effector T-lymfocyter märkta med vitala fluorescerande färgämnen eller transducerade med vektorer som kodar för EMD såddes i centrum av den brunn med användning av en CSM. Förmågan hos icke-vidhäftande effektor T-lymfocyter att migrera på monolager eller ECM-proteiner över tid sedan utvärderas och kvantifieras med ljus och fluorescensmikroskopi. Här, utvärderade vi migration och cytotoxicitet av icke vidhäftande effektor alloCTL på ett monolager av delvis relevant målgrupp U-87 mg gliomceller (figur 3 och 5). Dessa målceller, bara visar en del av HLA-antigen(HLA) molekyler (HLA-A2, B44) finns på de ursprungliga stimulatorer, användes för att reducera den potenta lytiska aktiviteten som skulle visas av alloCTL till relevanta 13-06-MG målceller (HLA-A1,2 och B44 , 57). Vi observerade också rörligheten i alloCTL på ECM skördas från ett monolager av MDA-MB-231BR brösttumörceller (Figur 6). Den alloCTL genererades genom envägs MLTR enligt metoder tidigare publicerade 9. Effector alloCTL skördades 4-5 dagar efter en riktad MLTR och transducerades med RRV-GS4-EMD (figurerna 3 och 5) eller RRV-ACE-EMD (fig 6) 10,11. Högre transduktion nivåer uppnåddes med GS4 vektorn utnyttjar en Gibbon apa leukemivirus kuvert än med amfotropiska ACE vektorn. Med hjälp av denna radiella migrationsanalys, noterade vi att både omvandlade och nontransduced fluorescensmärkt alloCTL hade flyttande kapacitet. Vi visar också att de behåller sin förmåga att CYTotoxic genomgår efter manipulationer för RRV transduktion.
Förmågan hos murina alloCTL att migrera bedömdes också (Figur 4). alloCTL sensibiliserade för haplotyp H-2b / k visas av TU-2449 celler färgades med eFluor 670 (lila) och en migrations analys utfördes med hjälp av TU-2449 transducerad med CMV-Straw-IRES-FLUC2 (röd). Vid användning av helt relevant mål, var ett lägre antal alloCTL effektorceller ympas för att förhindra en snabb lys av mål tumörcell. Använda 1 h som en baslinje, är T-celler till stor del lokaliserad vid hög densitet i mitten av brunnen som en enkelcellsuspension. De 48 hr mikrografier visar omfattande migration av T-celler mot den yttre kanten av brunnen och klustring av alloCTL är uppenbart med förstörelse av tumörcellerna vid platsen för sin första insättning. Proliferation av TU-2449 celler styrks som mStrawberry märkta celler öka i densitet över brunnen. Detta är bättre framgår av ytanfluorescens tomter som genererades för att visualisera fördelningen av lila cellerna i brunnarna (figur 4, nedre panelen). AlloCTL mobilitet är mycket mer uppenbar i brunnen vid 48 h jämfört med en timme baslinjen. Liknar vad som sågs i analyser som utnyttjar mänskliga alloCTL och gliomceller är ett avslut av tumörcellerna runt området av den första insättningen av effekten märkbar vid 48 h, vilket tyder lys av tumörmålceller.
Ett kritiskt steg i denna analys är tillväxten av friska monolager och efterföljande skörd av "skelett" ECM. Ympning av tumörcellerna vid 2,5-5,0 x 10 4 celler per brunn, enligt steg 1,9 ovan, vanligtvis resulterade i en ungefär ens monoskikt för tumörcelltyper vi använt. Vi fann det viktigt att göra det möjligt för tumörceller att vidhäfta vid RT, annars konvektion som sker vid 37 ° C kommer att driva cellerna mot mitten av brunnarna. Vad bra, för-beläggning av brunnar with poly-D-lysin och / eller en ECM protein såsom fibronektin eller kollagen kan kraftigt öka framgång. Dessutom hade vi bättre framgång med dessa analyser som använder mono-derived "skelett" ECM än med enskilda ECM-komponenter (dvs., Fibronektin, kollagen), som visade mycket mindre tillförlitliga. Det är viktigt att experimentera med antalet icke vidhäftande celler att deponera genom sedimente grenrör också, och om du använder en ren celltyp, kan man teoretiskt kunna definiera en motilitet koefficient med denna analys. Eftersom skålvolymen är liten och någon avdunstning av mediet inträffar måste monolagret som skall fylls dagligen med färskt medium. Ersättnings Media förhindrar också ansamling av giftiga laktat som cellerna växa och dela. Underlåtenhet att odla en sund monolager kan resultera i utsöndring av monolager eller ECM från brunnen ytan.
Coomassie blåfärgade ECM-proteiner härledda från U-87 mg gliomcell line enligt steg 1,13 ovan visas som en visuell exempel på det vidhäftande substratskiktet kvar efter digerering med Triton X-100 (Figur 1B). ECM produktion från en bröstcancer cellinje, MDA-MB-231BR celler, ofta var bristfällig och tunn, vilket resulterar i en ECM skikt som var mer dåligt vidhäftande och ibland lyfts från bilden under analysen. ECM protein anslutning till bilden förbättras när tumörceller upprätthölls som sammanflytande monolager i 1-2 dagar innan matsmältningen. Under hela processen, underhåll av Teflon tätningen kring brunnen var också viktigt. Att hålla volymen låg och minimera exponeringen av Teflon till Triton-X100-lösning mildras skada integriteten av Teflon tätningen.
En anpassning av detta protokoll kan vara användning av en tredimensionell extracellulär matrix skördas från delar av oktober inbäddade tumörvävnad 14. Emellertid bör det noteras att avståndet från den plana BottOmed väl till glidytan är bara 1 mm; alltså, kan sektioner överskrider denna tjocklek störas av grenrör placering. Dessutom skulle en metod måste införa metoder för att göra en liten borrhål i vävnaden för att acceptera droppen av medium innehållande de icke-adherenta celler.
Framställning av en väldispergerad enkelcellsuspension av effektor-T-lymfocyter i förväg om sedimente var också absolut nödvändigt. Gentle tituration av de icke-vidhäftande T-celler för att skingra aggregat till en enda cellsuspension var ett viktigt steg precis innan du laddar alloCTL in kanalerna i CSM. Användning av icke-enzymatiska cell dissociation buffertar bör användas vid behov. Vidare bör densiteten av effektor-lymfocyter vara omkring 1,0-2,0 x 10 5 celler / mikroliter för sedimentering, såsom beskrivs i steg 2.8 ovan. Låga cellantal kan resultera i att ingen sedimentering, medan högre cellantal kan orsaka en stor insättning som är lätt att störa när du flyttarskjut. Det rekommenderas också att serumkoncentrationen i mediet vara minst 10% för att ge tillräcklig ytspänning positiv menisk som minskar möjligheten för spillover.
En inverterad ljusmikroskop med fluorescens bildhanteringsfunktioner och en 4x eller 10x mål är optimal för denna analys. De tidpunkter för avbildning kan bestämmas enligt individuella experimentella undersökningar och celltyper. Den icke-vidhäftande CTL särskilt migrera från centrum av sedimente mot kanten av brunnen snabbare på ECM-proteiner (4-8 h) än över ett cellmonoskiktet (12-72 h). Delvis MHC relevanta målceller var att föredra framför relevanta mål för vår alloCTL analys för att uppmuntra visualisering av motilitet och minska cellmedierad cytolys av monolager innan betydande migration kan uppstå; användning av en låg effektor att rikta förhållandet saktar också lys. Användningen av delvis matchade mål möjliggör bättre visualisering av RRVöverföring till tumörcellerna också.
Användning av ett inverterat mikroskop ger flera fördelar jämfört med en upprätt omfattning. En inverterad utrymme möjliggör avbildning genom fuktig kammare så att diabilder inte behöver bli störd, och samtidigt upprätthålla en steril miljö för cellerna. Även avbildning genom kammaren ger en barriär mellan provet och teknikern, vilket möjliggör anslutning till skyddsnivå II (BSL II) riktlinjer vid arbete med humanhärrörande vävnad 15.
Om du använder en upprätt omfattning, är den högsta förstoringen uppnås utan att störa den positiva menisken av brunnen 20x. Tyvärr, användning av ett täck eller optik kit tillbehör till cellsedimente grenrör, rekommenderas inte, eftersom störningar i menisken resulterar vanligtvis i spridningen av de sedimente icke-vidhäftande celler i hela väl. Imaging över långa tidsperioder kan kräva försiktig tillsats av Medsium till varje brunn för att ersätta det förlorade mot avdunstning, även om detta är mer sannolikt att krävas under time-lapse avbildning.
Detta protokoll är distinkt från metoder som mäter horisontell cellmigrering av vidhäftande celler i Zigmond Chambers 16,17 skulle vars utformning inte medge visualisering av icke vidhäftande cellmigration. Andra analyser som utvärderar horisontell migrering mot en kemotaktisk gradient genom ett substrat, såsom agar i allmänhet används för att studera migration av en celltyp 18-20. Användning av CSM ger flera fördelar med dessa metoder samt metoder som mäter vertikala migration / invasion av odlade celler, såsom i Boyden kammare eller Matrigel Transwell plattor. Först låter cell-cellkontakt för en bestämning av mål-effektorcell interaktion och skador genom effektorceller. Den cytolytiska förmåga alloCTL-RRV-EMD ursprungligen stimuleras av envägs MLTR med stimulator 13-06-MG tumörceller till partially MHC-matchade U-87 mg cellinje är tydligt i mitten av monolager vid 24 och 72 timmar efter sedimentation (figur 3 och 5, streckade linjer). Som väl är nedbrytningen av TU-2449-celler genom murin alloCTL synlig vid 48 h efter sedimente (Figur 4). Monoskiktet utplånas vid centrum av alloCTL insättning, men uppträder mer långsamt under resten av monoskiktet, till följd antingen av överlappningen i HLA expression av 13-06-MG och U-87 mg i analyserna med humana celler 21 eller den låga start antal effektorceller för murina gliom. Dessutom är effektor och mål densitet reduceras som effektor alloCTL migrera bort från det sedimentestället. Förutom migration och cytolys, kan detta protokoll användas för att visualisera överföringen av viruset kodning fluorescerande proteiner. Här är överföring av RRV kodar för EMD från alloCTL till tumörcellerna uppenbart efter 72 timmar (Figur 5, infälld).
En begränsning av denna modell är att migration endast kan bedömas in vitro, vilket kanske inte riktigt reflekterande av in vivo migration. En annan begränsning är att kemokin / kemokinreceptor gradienter inte kan fastställas med hjälp av modellen. Även interaktioner av immunceller med ECM eller enskilda tumörceller kan fortfarande förekomma och beror på vad dessa celler utsöndrar eller uttrycker, detta motilitet assay skulle inte svara på frågor om huruvida de icke-vidhäftande cellerna kommer att migrera specifikt till eller från enskilda faktorer.
En fördel med denna analys är förmågan att avgöra om en population av icke-vidhäftande celler upprätthålla vandrande funktionalitet om lymfocyterna har eller inte har transducerats. I vårt exempel är den transducerade subpopulationen synlig genom EMD proteinuttryck, och det är uppenbart att migrations funktionalitet bibehålls i denna underpopulation. En bredare tillämpning kan vara att testa effekterna av olika koncentrationer av medel eller läkemedel som kan påverka icke vidhäftande immuncellmigration. Dessutom kanske andra hematopoetiska celler testas för rörligheten på olika substrat eller vidhäftande celler som härrör från normal vävnad. Slutligen, även om det inte är gjort här, sådd en kombination av fastsittande celltyper, dvs stromaceller eller dendritiska celler med tumör, kan ge analyser reflekterande av mer komplexa in vivo miljöer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Stöds delvis av NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Grant Number UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, och Joan S. Holmes Memorial Research Fund. MJH och GCO mottagna stöd från Joan S. Holmes Memorial postdoktorsstipendium vid UCLA. CSM-enheten erhölls från Creative Vetenskapliga metoder: www.creative-sci.com. Den lentivirusvektor mottogs från UCLA Vector Core, som stöds av CURE / P30 DK041301.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μl Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μl Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
- Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
- Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
- Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. Determinants of human astrocytoma migration. Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).
- Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
- Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
- Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
- Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
- Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
- Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
- Prevention, C. fD. C. a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5 edn, Health and Human Services. (2009).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
- Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
- Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).
