Abstract
İlk floresan etiketli, yapışkan olmayan, insan veya murin efektör bağışıklık hücrelerinin hareketliliği ölçmek için, hücre dışı matris proteinleri üzerinde yapışık tümör hücrelerinin radyal migrasyonun ölçülmesi için rapor Radyal tabakalı hücre gücü deneyi yeni bir adaptasyon sunulmaktadır. Bu teknik bir paslanmaz çelik manifoldu ve 10-kuyu teflon slayt fokal birleşen tümör hücre mono tabakaları veya hücre dışı matriks proteinleri ya hazırlanan kuyulara yapışmaz T hücrelerini yatırmak için kullanır. Hafif ve / veya çok-kanallı floresan mikroskobu zamanla efektör hücrelerin hareketi ve davranışını izlemek için kullanılır. Floresan boyalar ve / veya floresan transgenler için kod diferansiyel görüntüleme için hücre tipleri etiketlemek için kullanılan viral vektörler. Bu yöntem, bir slayt bölmeleri, agar veya Transwell plakaları kullanılarak, yatay ya da dikey göç / işgali etiket in vitro deneyler içindeki tip farklıdır. Tahlil ayrıntılı görüntüleme verileri b sağlarBelirli bir fluoresan markörler ile ayırt farklı hücre tipleri ile toplanmış, e; hücrelerin hatta belirli alt gruplar (örneğin, nontransduced / transdüksiyon ile aktarılabilir) izlenebilir. Yüzey yoğunluklu floresan araziler göç hücre tipine karşılık gelen özel flüoresan kanalları kullanılarak üretilir. Bu belirli zamanlarda yapışkan olmayan immün hücre hareketliliğinin iyi olarak gösterebilir. Bir de, hedef hücrelere gibi sitotoksisite veya efektör viral vektörlerin transferi gibi diğer efektör hücre fonksiyonlarının, kanıt toplamak mümkündür. Bu durumda, yöntem, araştırmacılar mikroskobik çeşitli yapışkan hücreler ile farklı olarak etiketli olmayan yapışık hücre-hücre etkileşimleri belge sağlar. Bu tür bilgiler, işlevselliği görsel kanıt, kanser tedavisi için kullanılmadan önce tümör hedef hücreleri ile arzu edilen biyolojik olarak manipüle ya da aktive edilmiş immun hücre tiplerinin belirlenmesinde, özellikle uygun olabilir.
Introduction
Radyal tabakalı hücre gücü deneyi ilk olarak, hücre dışı matris (ECM), proteinleri 5-7 ile ya da fibronektin ve laminin 1,2 tek tek ECM bileşenleri ile kaplanmış dilimlerin üzerine yapışık tümör hücreleri 1-4 infiltratif özelliklerini ölçmek için geliştirilmiştir. Bu teknik, paslanmaz çelik bir hücre, sedimantasyon manifoldu (CSM) kullanılarak kuyu merkezinde tümör hücrelerinin tek bir hücre süspansiyonu tohumlama çıkıyor. Sedimantasyon sonra, tümör hücreleri, yatay motilite oranı belirlemek üzere kullanılan kuyu ve zaman içinde başlangıç hücre popülasyonunda çapında değişiklik alt azaltacaklardır. Radyal tabakalı hücre gücü deneyi hücrelerinin in vitro göç yeteneklerine tahlil edilmesi Transwell plakaları kullanılan diğer mevcut yöntemlere göre görsel bir avantaj sağlanır; Bu analizler görüntüleme 8 olmayan elverişli. Yanı sıra, aynı zamanda bir zaman noktası seçiminde özgürlük büyük miktarda sağladıgöç, değerlendirilir timepoints sayısında herhangi bir sınır ile bir araştırmacı sedimantasyon sonra görüntünün tercih ne zaman s.
Geçirmek için yeteneği, özellikle de viral vektörler için salıverme araçları olarak kullanılabilir immünoterapi veya burada alanında, yapışkan olmayan hücreler için önemli bir işlevi olduğu için, yapışkan olmayan hücre göçünü değerlendirmek için CSM kullanımını uyarlanmış tümör hücre tekli katmanları üzerinde tipleri, ECM proteinleri ilave olarak. Mikroskopik olarak, ya da tek tek ECM bileşenleri tümöründen izole edilmiş kompleks ECM ile, uygun bir tümör hücre tekli katmanları üzerinde yapışkan olmayan hücreleri göç görselleştirme yararı, bu deney, çok yönlü kılar. Tek bir hücre dışı bir protein ile kaplı oyuklar da kullanan deneyler doğru hücrelerin, in vivo yoluyla göç edecektir ECM doku alt-tabakanın ya da tümör yansıtmamaktadır.
Burada, biz büyük histocomp karşı duyarlı alloreaktif sitotoksik T lenfositleri (alloCTL), kullanılanBizim için temsili yapışmayan hücre tipi olarak, tek yönlü karma lenfosit tümör hücresi tepkileri (MLTR) ya da karışık lenfosit reaksiyonları (MLR), 9 kullanarak atibility kompleksi (MHC) proteinleri içerir. Biz de, insan ve murin kökenli hücreler test edildi. Göç tümör mono tabakaları üzerinde ölçüldü zaman kullanılan tümör hücreleri ya kısmen ilgili hedefler MHC moleküllerinin tam bir set ile efektörler, ya da tamamen ilgili hedefler, duyarlı kullanılan hücre popülasyonu üzerinde bulunan aynı MHC proteinlerinin bazı görüntüleme, olduğunu etkileyiciler karşı duyarlı hale getirilmiş. Bazı deneylerde, efektör ve hedef hücrelerin ayırt etmek için floresan CellTracker Kırmızı CMPTX veya hücre çoğalması, boya eFluor 670 kullanılır. Ayrıca hücrelerin görselleştirmek için ek bir yol olarak floresan proteinler için viral vektörler, kodlama ile transdüksiyon kullanılır. Bazı deneyler için, Emerald Green (Merck) floresan protein 10,11 kodlayan retroviral replike vektörleri (RRV) ile alloCTL transduse; oth içinalıcılar, tümör hücreleri mStrawberry kodlayan lentiviral vektörleri ile transdüse edilmiştir.
alloCTL tümör hücre monokatmanlarından hasat edilen tümör hücre mono tabakaları ya da ECM ya merkezine manifoldunun bir kanal üzerinden ekilmiştir. Yapışkan olmayan yapışık hücre etkileşimleri ışık ve / veya zaman içinde floresan mikroskobu ile görülür hale getirilirler. Yüksek güçte parçalanmış çekirdekleri ile düşük güçte tümör hücre mono tabakasında bozulması ya da tümör hücreleri, sırasıyla erime ve apoptoz ile hücre hasarı göstergeleri idi. Biz dijital tek tabaka kültürler üzerinde yapışmaz floresanlama T hücrelerinin göçünü gösteren yüzey yoğunluğu floresan haritalar yarattı. Biz de sitotoksisite Kaplanmış yapışmayan alloCTL küme oluşumundan sonra yapışık glioma hücre tabakasına yol açtığı kaydetti. Yanı sıra, glioma tek tabaka için alloCTL gelen RRV-EMD yatay transdüksiyon gözlendi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Slayt Hazırlama
- Sterilizasyon torbalar içine Hücre Sedimantasyon Manifold slaytlar yerleştirin ve otoklav bandı ile mühür. Kese kağıdı tarafı kuyuları plastik birikmeleri önlemek için slayt Teflon kaplı yan Yüz.
- 121 ° C'de 15 dakika süreyle otoklavlanmaktadır torbalar.
- Steril 150 x 15 mm steril Petri kabındaki bir biyogüvenlik kabini ve yerin içinde sterilizasyon kese slaytı çıkarın. Dört slaytlar kadar tabak başına sığabilir. Slaytlar yanında 35 x 10 mm Petri kabı yerleştirin. Nemlendirmeyi sağlamak için steril H2O 2-3 ml ilave edilir.
- Şekilde tüm karşılamak için yeterli hacmi kullanılarak 100 ug / ml poli-D-lisin ile önceden kat kayar. Oda sıcaklığında bir saat sonra, çözelti aspire edilerek kuyu yüzeyi üzerine 1x PBS pipetleme de iki yüzey yıkayın.
- İsteğe bağlı olarak, daha güçlü tümör hücre yapışmasını sağlamak için fibronektin veya diğer ECM bileşenleri ekleyin. Yeterli hacim tha 5 ug / ml fibronektin ekleKuyular t oda sıcaklığında zaman kısa bir süre içinde kuru olmaz.
- 1 saat sonra, artık bir çözüm aspire ve 1x PBS ile pipetleme ve aşağı iki kez yıkayın.
- Tümör kaplama için hazır olana kadar kuyular PBS tutun. Kullanım aynı gün slaytlar.
- Istenen yapışkan tümör hücre tipi bir birleşik bir şişe hasat edilir. Yeterli tamponlu büyüme ortamı; örneğin 5 x 10 6 hücre / ml'de ışık mikroskobu ve tekrar süspansiyon Tripan mavisi kullanılarak canlı hücre sayımı, Dulbecco minimum gerekli ortam,% 10 fetal sığır serumu ile (FCS) (FBS), L- glutamin ve sodyum piruvat.
- Yapışık hücre popülasyonunun floresan görüntüleme isteniyorsa, önemli bir flüoresan boya veya üretici tarafından sağlanan protokol izlenerek, bir hücre çoğalması boya ile yapışık hücre popülasyonu olarak etiketleyin.
- Sorunsuz wel içinde hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için slayt özen göstererek her kuyuya tam orta 10 ul pipetls, bu gibi üniforma tümör hücresi yapışmasını önleyebilirsiniz.
- Her bir sıra (Şekil 1A) ortama 2.5-5.0 x 10 4 hücrelerini (hücre süspansiyonu 5-10 ul) eklenir. Tümör hücre tipine ve arzu edilen büyüme gün sayısına bağlı olarak uygun sayıda ayarlayın. Büyük tümör hücreleri veya hızlı büyüyen hücreleri başlangıçta daha az hücre gerektirebilir. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için yukarı ve aşağı orta ve pipet ekleyerek 40 ul kadar iyi ses getirmek.
- Tüm oyuklar tohumlanmış olduktan sonra, tümör hücreleri, daha sonra oda sıcaklığında uygun yer kapak 150 x 15 mm Petri tabağına ve dikkatli bir şekilde en az 24 saat süreyle 37 ° C /% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör çanağı hareket etmesine izin verir.
- Günlük kültür ortamı değiştirin. Dikkatle tek tabaka harcanan ortamın bir bölümünü pipet ve taze tamamlanmış besiyeri ile değiştirin.
NOT: buharlaşma nedeniyle, daha fazla hacim dışarı alındı daha ilave edilmesi gerekecektir. Wells tahlil için ne zaman hazır olacağını daha, conflhücre uent tabaka mevcuttur. Bu 1-3 gün ilk tohumlama sonra genellikle. - Adım 1.4 tarif ve mono tabakalar isteniyorsa 2. adıma geçin, ya da tek tabaka ECM proteinleri ayıklamak için aşağıdaki 1,13 adıma olarak ya PBS ile hafifçe kez tek tabaka yıkayın.
- Komple ortam içinde% 0.5 Triton-X (h / h) çözeltisi oluşturunuz ve her bir oyuğa 30 ul ilave edin. Tek tabaka, daha sonra 2 dakika süre ile kaputu sindirimi, yukarıda anlatıldığı gibi pipetleme tam ortam ile iki kez yıkayın olsun.
NOT: ECM tabakası ışık mikroskobu (Şekil 2) ile görülebilir. Hemen slaytlar kullanarak, veya 1-2 gün süreyle nemlendirilmiş CO2 kuluçka makinesi içinde komple ortam içinde tutmak. Kuyular kurumasına izin vermeyin.
Slide üzerine Yapışmayan T hücrelerinin 2. sedimantasyon
- Yapışmayan hücre popülasyonunun floresan görüntüleme isteniyorsa, bu tür CFSE, hücre Takibi Kırmızı CMPTX veya eFluor olarak önemli bir floresan boya ile yapışkan olmayan hücre popülasyonları, etiketTahlilde önceden üreticisi, en az 1 saat tarafından sağlanan protokolleri takip ederek 670. Seçenek olarak ise, viral vektörler tarafından kodlanan floresan proteinleri ifade etmek için hücreleri manipüle.
- Yukarıda 1.2'de tarif edildiği gibi bir otoklav torbanın hücre sedimantasyon manifoldu otoklava.
- Biyolojik güvenlik kabininde kuvöz ve yerden Teflon kaplı slaytlar içeren nemlendirilmiş odasına çıkarın.
- Pipetleme 1x PBS ile yıkayın ve aşağı, daha sonra, en az% 10 serum içeren komple ortam içinde 45 ul ekle.
- Sterilizasyon zarf manifoldu çıkarın ve dikkatlice slayt (Şekil 1B) alt dokunur manifoldu sonunda 'kanca' kadar kuyularda üzerinde slayt.
- Kültür ortamı, her bir kanal görünür olduğundan emin olun. Hiçbiri görülürse, manifoldu çıkarmak ve iyi gelen daha fazla orta ekleyin, daha sonra değiştirin ve tekrar kontrol edin.
- Her chan için yineleyin 2.5nel manifold ya da birçok kuyu için arzu edildiği şekilde.
- En az / 5, 10 x 1.0-2.0 daha ul yıkanarak yapışmayan hücreler ve tekrar süspansiyon sayısı. Hücrelerin 1 ul çizin ve yavaş yavaş kanal (Şekil 1C) içine pipetle. Iyi istenen her yapın.
- Kanal hücreleri yerleşmek için izin 20-30 dakika süreyle biyo-kaput içinde, yani manifoldu ve slayt tüm hücre yüklü cihazı, bırakın.
- Fokal kuyularda (Şekil 1D) merkezinde seribaşı hücreleri rahatsız etmeyecek şekilde slayttan yukarı doğru kaldırarak hafifçe iki ucunu dokunarak ve manifoldu çıkarın.
- Yapışmayan hücreler başarılı bir şekilde iyi manifoldu kanalın çevresi içinde kalma merkezinde seribaşı olarak emin olmak için her iyi kontrol edin. yapışmayan hücreler ideal bir miktar, bu nedenle hafif hücre Pelle neden olmaz çevresinde slayt hareket tek tabaka veya ECM ve birbirine yapışırt dağıtmak için. Slayt jostle etmeyin.
3. Floresan Mikroskopi
- Sedimantasyon onaylandıktan sonra uygun deneysel donanımları ile, görüntüleme gerçekleştirmek. İdeal olarak, bir CO2 ve nem odası ile donatılmış bir mikroskop kullanılır. Kuyunun tamamı görülebilir, böylece birden fazla görüntü için izin vermek için, düşük güç, yani, 4X veya 10X, bir görüntü daha büyük bir alanı alınacak.
- Görüntü yakalama yazılımı kullanarak dijital görüntüler elde edin. Aydınlık ve / veya çok-kanallı floresan görüntüleme yapın.
- İstenirse, belirli bir alanda farklı kanallarda görüntü kaydetmek ya da nemlendirilmiş slayt tutmak ve 37 ° C /% 5 CO 2 inkübatör ve manuel (istenilen zaman noktalarında görüntü Şekil almaya bir time-lapse kurmak daha uzun bir zaman noktası için önerilen 1E & F).
4. Analiz ve Görüntü
- Resim düzenleme yazılımı kullanarak, ışık ve fl birleştirmebir katman birden çok hücre tipleri ve işaretleri içine uorescent görüntüleri aynı görüntüde görülebilir. Sürükle ve her programa renk ve istendiğinde, çoklu katmanlar ile bir görüntü dosyası oluşturmak için 'Katman ekle' seçeneğini görüntü dosyalarını bırakın.
- Yüksek büyütmede, almak hizalamak ve dijital birlikte kuyunun genelinde görüntüleri dikiş. İki görüntü arasında korunmuş bölgeler bakarak ve tam bir resim oluşturulur kadar üst üste bir görüntü kaplayan dosyaları hizalayın.
- Tek tek hücreler göç mesafeyi belirlemek için yakalama yazılımı kullanarak edinimi sırasında görüntülere mikron çubuklarını ekleyin.
- , Çeşitli zamanlarda hücre göçü belirleyen floresan T hücre agregasyonu veya zamana yayılmış ölçmek için, yani görüntü yazılımı, ImageJ ile yüzey yoğunluğu floresan haritaları yapmak için.
- Yüzey araziler oluşturmak adımda 4.1 ve Katmanlar pencerenin altında oluşturulan bir katmanlı görüntü çekmek için,İstediğiniz kanala karşılık gelen olanlar dışındaki tüm katmanları işaretini kaldırın. Bir yüzey arsa Merck tanımının görüntülenmesi arzu edildiği takdirde, örneğin, bu marker için kullanılan filtreye karşılık gelen, sadece 'yeşil' tabakalar görünür olmalıdır.
- Düzleştirilmiş görüntü ve programa görüntüyü (örn, .png) tanınan bir dosya biçiminde kaydedin ve yükleyin. Yüzey arsa üretmek için, 8-bit görüntü türünü değiştirmek arka plan azaltmak için gerektiği gibi parlaklık / kontrast değiştirmek ve '/ Yüzey Plot Analizi' seçeneğini seçin. Şekil 5 görüntüler 'Shade', 'Axis Beraberlik', 'Bir Poligon Başına Hattı', ve 'Smooth' onay kutularını işaretleyerek üretildi.
- Alternatif olarak, sıfır zamanında fokal hücre mevduat yarıçapını veya çapını kullanarak ölçümler almak ve farklı zamanlarda dış noktada hücrelere karşılaştırın. teflon kuyu çapı 6.0 mm'dir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Floresan proteinleri kodlayan viral vektörler ya da bunun yerine, floresan boya, bir ek olarak kullanılabilir. Viral transdüksiyon motilite deneyinin önceden yapılmalıdır. Hem yapışkan ve yapışkan olmayan hücre tipleri farklı şekilde etiketlenmiş olabilir. transdüksiyonu için protokol kullanılan vektör tipine bağlı olacaktır. Burada, 12 'de tanımlanan protokol kullanılarak gerçekleştirilen bir deneyde önceden Şekil RRV EMD ile birlikte 3, 5 ve 6, en az iki gün içinde alloCTL kalıt. Ayrıca mStrawberry kırmızı flöresanlı proteinin (Şekil 4) ifade etmek için, tümör hücreleri nakletmek için, bir lentiviral vektör CMV-Çilek-IRES-FLUC2 kullanılır. Bu iletim noktası, taze ortam ilave edildi, 48 saat boyunca hücre şişeye, vektörün eklenmesi ile gerçekleştirildi. Sınırlayıcı seyreltme, hücreler iki gün boyunca geri bırakıldıktan sonra% 100 transduse hücre popülasyonunu üretmek üzere gerçekleştirilmiştir.
(Şekiller 3 ve 5). floresan mikroskobu ilk olarak oyuk merkezinde serpilmiş hücreleri, zaman içinde merkezden uzak geçiş gösterilmektedir. alloCTL oluşumu 4 saat (Şekil 3, beyaz oklar) aktive T hücresi popülasyonları 13, IL-2 üreten sergilediği otokrin büyüme kalıplarının muhtemelen yansıtıcı sonra toplanır.
Başka bir deneyde, murin efektör alloCTL, B6C3F1 farelerden haplotip H-2d, Balb / c cevap splenositlerin ve haplotip lH-2b / k stimülatör splenositlerin kullanılarak tek yollu MLR TU-2449 gliom singeneik olan zorlanma yapılmıştır. Hemen t kanalıyla, tohumlamadan önceO tümör hücre mono tabakasının üzerine manifold, alloCTL eFluor 670. alloCTL (mor hücreleri) ile boyandı,% 100 CMV saman ile transduse edildi TU-2449 glioma hücrelerinin (kırmızı) yerleşik tek katmanların merkezine tohumlandı IRES-FLUC2 viral vektör ve kuyuların üzerine kaplama Şekil 4C ve D sayısallaştırılmış mor floresan dönüştürmek için ImageJ kullanılarak oluşturulan önce tahlil. 1 ve 48 saat aynı kuyunun aynı kadranda alınan. Şekil 4A ve B gösterisi mikroskobik görüntüleri günü Üç-boyutlu formatta görüntülenir kantitatif yüzey araziler içine yoğunlukları.
Son olarak, insan alloCTL MLTR metastatik göğüs tümör hücre çizgisi MDA-MB-231BR türetilen inaktive uyarıcısı, insan beyninin-tropik hücreleri ile yapılmıştır., Kısmen yapışkan olmayan CMPTX etiketli alloCTL süresi boyunca hafif ve floresan mikroskobu görüntülerini göstermektedir Şekil 6 , RRV-EMD ile transduced f ekstre ECM proteinleri üzerinde göçBu tümör hücrelerini rom. (A) parlak alan fotomikrograf hemen sedimantasyon sonrası alloCTL odak yerleşimi gösterir. (B ve F) parlak saha fotomikrografları 4 ve 8 saatte, sırasıyla, alloCTL radyal GİP'te göç göstermektedir. alloCTL yoğunluk kuyunun merkezinden uzaklaştıkça azalır (kuyu merkezi BI alanın sol üst köşesidir). Paneller (C ve G) gösterisi CMTPX ile lekelenmiş tüm alloCTL hazırlanması; (D ve H) (E ve I) 'Merck + T hücrelerinin, küçük sayılar ile gösterildiği gibi RRV-EMD alloCTL kısmi transdüksiyonunu göstermektedir ve RRV-EMD birleştirilmiş görüntüleri göstermek alloCTL transduse untransduced alloCTL birlikte GİP'te göç.
Şekil 2. Tümör hücre tekli ve ECM CSM slayt kuyuları üzerinde kaplama. Slayt kuyuların fotomikrograflarıdır hazırlananCoomassie mavisi boya ile boyanmış birleşik U 87mg çıkarılan (A) birleşik U-87MG glioma hücre mono tabakaları, veya (B) ECM proteinleri ile. Bar = 200 mikron. Bu rakamın daha büyük bir versiyonu için burayı tıklayınız.
Şekil 3. Göç ve merkezde RRV-EMD transduced lenfositlerin sitotoksisite ve zamanla hücre mevduat öncü. Ön kenarda ve yapışkan U-87MG glioma hücrelerinin bir tek tabaka üzerinde çökelme takip alloCTL-RRV EMD merkezinde çeşitli zamanlarda alınan floresan fotomikrograflarıdır. Tek hücre, yerleştirme 4 saat (beyaz oklar) içinde küresel kümeler oluştururlar gibi efektör alloCTL tohumlanır. Tek floresan-etiketli CTL iyi bir merkezinden göç etmişs Zaman ilerledikçe. 24 saat sonra, yapışık tek tabaka boş hücre yamalar muhtemelen tümör hedef hücrelerin sitolizi alloCTL (tire olan alan) bağlı görebilir. Bar = 200 mikron. Bu rakamın daha büyük bir versiyonu için burayı tıklayınız.
1 ve 48 saat sonra gösterilen mStrawberry etiketli glioma hücreleri ile eFluor 670 ile boyanmış sıçangil alloCTL Şekil 4. Radyal göç. (A), 1 saat ve (B) floresan çökelmesinden sonra 48 saat sonra, aynı kuyunun bir kadrana Floresan fotomikrograflarıdır TU-2449 glioma hücreleri, bir tek tabaka üzerine yapışkan olmayan alloCTL etiketli. Düşük güç fotomikrografları bir KCK kadranda iyi (yarıçap 3 mm) içinde bulunan alana yansıtacak. Yüksek güç (A ve B, takmalar) allo atCTL (beyaz oklar) yakın olarak gösterilmektedir ve tek tek tümör hücreleri ile ilişkilidir; bir parçalanmış çekirdekleri ile parçalanmış bir görünüme sahiptir ve apoptotik olduğunu. (C ve D) ilgili yüzey yoğunluğu floresan haritaları üç boyutlu grafik şeklinde sayısallaştırılmış mor floresan görüntülerin piksel değerlerini gösteren ImageJ yazılımı kullanılarak elde edilen ve iyi yarıçapı temsil eden bir ızgara üzerine yerleştirilir 3 mm. Bar = 500 mikron. Bu rakamın daha büyük bir versiyonu için burayı tıklayınız.
AlloCTL ve tümör hücrelerine transdüse alloCTL gelen RRV-EMD yatay yayılma Şekil 5. Göç. Floresan fotomikrograflar seri de kullanarak resim düzenleme yazılımı yarıçapını kapsayacak şekilde dikilir. RRV-EMD Göç transdükalloCTL (beyaz oklar) çökelme takip 0 ve 72 saat sonra, U-87MG tümör hücrelerin tek bir tabakası ile gösterilir. Tek tabaka olarak tümör hücrelerinin RRV-Merck transdüksiyon tümör hücrelerine lenfositlerden enfektif RRV yatay aktarım (beyaz kutu ve girinti) meydana geldiğini gösteren, EMD-kalıt alloCTL ilave edildikten sonra 72 saat sonra da açıktır. Bar = 200 mikron. Bu rakamın daha büyük bir versiyonu için burayı tıklayınız.
AlloCTL Şekil 6. Radyal göç RRV EMD ile transduse ve CellTracker kırmızı CMTPX ile boyanmıştır. Hücreleri MDA-MB-231BR hücrelerinden türetilen ECM özleri üzerine çöktürülmüştür. AlloCTL Göç 0, 4 ve 8 saat aydınlık alan ışık mikroskobu ile görüntülendi (A, B, sırasıyla, K sütun 1). FluoreCMPTX (kırmızı) koku ve görüntüler alloCTL (C, G, sütun 2) etiketli RRV-Merck (yeşil) alloCTL (D, lH, sütun 3) ve birleştirilmiş görüntü (E, I, sütun 4), transduse 4 ve 8 saat sonra gösterilmiştir. Barlar 200 mikron =; Bar görüntüleri CI için geçerli B'de gösterilen. Bu rakamın daha büyük bir versiyonu için burayı tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tek bir hücre süspansiyonu olarak tümör hücreleri Teflon-maskeli sürgü oyuklarına pipetle alındı. hücreler yapışmaya bırakıldı ve daha sonra bir nemlendirilmiş bir% 5 CO2, 37 ° C inkübatör (Şekil 1A) içinde tek-tabakalar oluşturulmuştur. Tek tabaka elde kurulan tek tabakalar ya da ECM proteinlerinin bu tahlillerde (Şekil 1B) hasat edilebilir. EMD kodlayan vektörler ile önemli bir floresan boya ile işaretlenmiş ya da transduse efektör T lenfositleri iyi bir CSM kullanarak merkezi içine ekilmiştir. zaman içinde tek-tabakalı ya da ECM proteinleri üzerinde geçirmek için yapışmayan efektör T lemfositlerinin yeteneği daha sonra değerlendirildi ve ışık ve floresan mikroskobu ile nicelleştirilmiştir. Burada, kısmen ilgili hedef U-87MG glioma hücrelerinin bir tek tabaka üzerinde yapışkan olmayan efektör alloCTL göçünü ve sitotoksisitesini değerlendirilmiştir (Şekil 3 ve 5). Sadece İnsan Lökosit Antijen bazı görüntüleyen Bu hedef hücreler,Orijinal uyarıcıları üzerinde bulunan (HLA) molekülleri (HLA-A2, B44) ilgili 13-06-MG hedef hücreleri (HLA-A1,2 ve B44 için alloCTL gösterilebilir olur güçlü litik aktivitesini azaltmak için kullanılmıştır , 57). Ayrıca, MDA-MB-231BR göğüs tümör hücrelerin tek bir tabakası (Şekil 6) hasat ECM üzerinde alloCTL hareketliliğini görülmektedir. alloCTL daha önce 9 yayınlanmış yöntemlere uygun olarak tek yönlü MLTR ile oluşturulmuştur. Efektör alloCTL tek yönlü MLTR sonra 4-5 gün sonra alınan ve (Şekiller 3 ve 5) veya RRV-ACE Merck (Şekil 6) 10,11 RRV-GS4 EMD transdükte edilmiştir. Daha yüksek iletim seviyesi amfotropik ACE vektörü ile daha jibon maymunu lösemi virüsü zarf kullanılarak GS4 vektörü ile elde edilmiştir. Bu radyal göç deneyi kullanılarak, her iki transduse ve floresan etiketli alloCTL göç kapasiteye sahip nontransduced kaydetti. Biz de Cyt için koruyabilenlerdir göstermekRRV transdüksiyonu için manipülasyonlar geçtikten sonra otoxic.
kemirgen alloCTL yeteneği de (Şekil 4) değerlendirildi göç. alloCTL TU-2449 hücreleri tarafından arzedilen haplotip lH-2b / k karşı duyarlı (Mor) eFluor 670 ile boyandı ve bir göç deneyi CMV saman IRES-FLUC2 (kırmızı) ile transduse TU-2449 kullanılarak yapıldı. Tam olarak ilgili hedef kullanıldığında, alloCTL efektör hücrelerin daha düşük sayıda tümör hücresi hedefleri hızlı lizizi önlemek için ekilmiştir. Bir temel olarak 1 saat kullanarak, T hücreleri, büyük ölçüde tek bir hücre süspansiyonu olarak kuyunun merkezinde yüksek yoğunlukta lokalizedir. 48 saat mikrograflar başlangıç yatağının yerinde tümör hücrelerinin tahrip edilmesi ile kolaylıkla görüleceği gibi kuyu ve alloCTL kümelenmesine dış kenarına doğru, T hücrelerinin yoğun bir şekilde bulaşma. TU-2449 hücrelerinin çoğalması etiketli hücreler de üzerinde yoğunluk artış mStrawberry olarak kanıtlanmıştır. Bu daha iyi bir yüzey görülürkuyularda mor hücreleri (Şekil 4, alt panel) dağılımını görselleştirmek için oluşturulan floresan araziler. AlloCTL hareketlilik çok daha belirgin 1 saat başlangıca göre 48 saatte kuyuda olduğunu. İnsan alloCTL ve glioma hücreleri kullanılarak deneylerde görülmüştür ne benzer şekilde, efektör başlangıç yatağının çevresi tümör hücrelerinin bir açıklık tümör hedef hücrelerin lizizi göstermektedir, 48 saat sonra fark edilir.
Bu deneyde kritik bir adım sağlıklı mono tabakaları ve 'iskelet' ECM sonraki hasat büyüme. 2.5 tümör hücrelerinin Tohum - 1,9 aşamasına göre oyuk başına 5.0 x 10 4 hücre, genellikle bu kullanılan tümör hücre tipleri için hemen hemen eşit bir tek tabaka ile sonuçlanmıştır. Bu, tümör hücreleri, oda sıcaklığında yapışmasının sağlanması için bu önemli bir kuyu merkezine doğru itecektir hücreleri 37 ° C 'de meydana gelir, aksi konveksiyon bulundu. Kuyu wi yanı, ön kaplamainci poli-D-lizin ve / veya büyük ölçüde başarı oranını arttırabilir fibronektin ya da kollajen gibi bir ECM proteini. Ayrıca, daha az güvenilir olduğunu kanıtladı bireysel ECM bileşenlerinin (yani., Fibronektin, kollajen), ile daha tek tabaka-türetilmiş 'iskelet' ECM kullanarak bu tahlillerde iyi bir başarı vardı. Bir de sedimantasyon manifoldu yoluyla yatırmak olmayan yapışık hücre sayısı ile deneme önemlidir, ve saf bir hücre türü kullanıyorsanız, bir teorik bu deneyde bir hareketlilik katsayısı tanımlamak mümkün olabilir. Oyuk hacmi, küçük ve orta biraz buharlaşma olduktan için, tek tabaka taze ortam her gün doldurulması gerekir. Medya değiştirme aynı zamanda toksik laktat birikimi hücreleri büyüdükçe ve bölme önler. Sağlıklı bir tek tabaka yetiştirmek için başarısızlık de yüzeyinden tek tabaka ya da ECM olan dökülme neden olabilir.
U-87MG glioma hücre li türetilen Coomassie mavi lekeli ECM proteinlerine, yukarıda Triton X-100 (Şekil 1B) ile sindirimden sonra kalan yapışkan, substrat tabakasının görsel örnek olarak gösterilmiştir 1.13 adıma göre yöntem. Bir göğüs karsinom hücre hattından ECM üretimi, MDA-MB-231BR hücreleri, genellikle daha az yapışkan ve bazen de tahlil sırasında sürgü kaldırılmış olan bir ECM tabakasının sonuçlanan dağınık ve ince. Tümör hücreleri sindirim önce 1-2 gün boyunca birleşik mono tabakaları olarak muhafaza edildiğinde slayt ECM proteini bağlılık geliştirilmiş. Süreç boyunca, kuyu çevresindeki teflon conta bakımı da önemliydi. Düşük hacim tutulması ve Triton-X100 çözüm Teflon maruz kalmasını asgariye teflon conta bütünlüğü zarar azaltılabilir.
Bu protokolün biri adaptasyon Ekim gömülü tümör dokusu 14 bölümden hasat üç boyutlu hücre dışı matriks kullanılması olabilir. Bununla birlikte, belirtilmelidir ki, yassı Bott mesafeslayt yüzeye iyi Omed sadece 1 mm; Böylece, bu kalınlığı aşan bölümler manifoldu yerleştirme ile bozulabilir. Ayrıca, yöntem, yapışkan olmayan hücreleri ihtiva eden ortam damlacık kabul doku hafif bir çapak deliği yapmak için tasarlanmış olması gerekir.
Sedimantasyon önceden efektör T lenfositlerinin iyi dağılmış tek bir hücre süspansiyonu hazırlanması da zorunluydu. Tek bir hücre süspansiyonu agrega dağıtmak için yapışmayan T hücrelerinin Nazik öğütme yoluyla sağ KCK kanallarına alloCTL yüklemeden önce önemli bir adım oldu. Gerekirse Enzimatik olmayan ayrıştırma tampon kullanımı kullanılmalıdır. Yukarıdaki adım 2.8 de tarif edildiği gibi, sedimantasyon 2.0 x 10 5 hücre / ml - Ayrıca, efektör lenfositlerin yoğunluğu yaklaşık 1.0 olmalıdır. Daha yüksek hücre sayısı taşırken bozmak için kullanımı kolay olan büyük bir para neden olurken, düşük hücre sayısı, herhangi bir çökelme ile sonuçlanabilirkaydırın. Ayrıca ortamda serum konsantrasyonu yayılma olasılığını azaltır pozitif menisküsün yeterli yüzey gerilimi temin etmek üzere, en az% 10 olması tavsiye edilir.
Floresan görüntüleme yetenekleri ve 4x veya 10x hedefleri ile ters ışık mikroskobu Bu deney için en uygunudur. görüntüleme için zaman noktaları bireysel deney öğrenmek ve hücre tiplerine göre belirlenebilir. Özellikle yapışmaz CTL hücre tek tabakalı (12-72 saat) üzerinde daha ECM proteinleri (4-8 saat) daha çabuk kuyunun kenarına doğru sedimantasyon merkezine göç. Kısmen MHC ilgili hedef hücreleri hareketlilik görselleştirme teşvik ve önemli göç oluşabilir önce mono tabakaları hücre-aracılı sitolizi azaltmak için alloCTL testi için ilgili hedeflerin tercih edildi; oranı da lizisini yavaşlatır hedef düşük efektör kullanımı. kısmen uyumlu hedefin kullanımı RRV daha iyi görselleştirme sağlargibi tümör hücrelerine karşı iletimi.
Ters döndürülmüş bir mikroskop kullanımı dik kapsamı üzerinde birden fazla avantaj elde edilir. Slaytlar, aynı zamanda hücreler için steril bir ortamı muhafaza ederken, rahatsız olmak zorunda değildir, böylece bir ters kapsamı nemlendirilmiş bölmesi boyunca görüntü sağlar. Ayrıca, odasının içinden görüntüleme insan kaynaklı dokusu 15 ile çalışırken biyogüvenlik düzeyi II (BSL II) prensiplerinin sağlayan, numune ve teknisyen arasında bir bariyer sağlar.
Dik kapsamı kullanıyorsanız, kuyunun pozitif menisküs bozmadan ulaşılabilir en yüksek büyütme 20x olduğunu. Menisküs bozulma genellikle iyi boyunca sedimente yapışmayan hücrelerin yayılmasını sonuçları Ne yazık ki, bir lamel, ya da hücre sedimantasyon manifolduna optik kiti aksesuarların kullanımı, tavsiye edilmez. Uzun süreler boyunca Görüntüleme med dikkatli ilave edilmesini gerektirebilirBu zaman atlamalı görüntüleme sırasında gerekli olması daha muhtemel olmasına rağmen, bu buharlaşma kaybı karşılamak üzere her bir oyuğa yum.
Bu protokol Zigmond Chambers 16,17 yapışık hücrelerin yatay hücre göçünü ölçmek yöntemlerden farklıdır, tasarım yapışmayan hücre göçü görünüm için izin vermez. Agar gibi bir alt-tabaka ile bir kemotaktik gradyanı doğru yatay geçiş değerlendirmek Diğer deneyler, genellikle, bir hücre tipi, 18-20 göçünü incelemek için kullanılır. CSM kullanımı birçok bu yöntemlere avantajların yanı sıra, Boyden oda veya Matrigel Transwell plakaları olarak kültürlenmiş hücreler, dikey göç / işgali ölçmek için yöntemler sağlar. İlk olarak, hücre-hücre temas efektör hücreler hedef-efektör hücre etkileşim ve yaralanma belirlenmesine izin verir. Başlangıçta Parti'nin için stimülatör 13-06-MG tümör hücreleri ile tek yönlü MLTR tarafından uyarılan alloCTL-RRV EMD sitolitik becerisiortağı MHC eşleştirilmiş U-87MG hücre çizgisi çökelme takip eden 24 ve 72 saat sonra tek tabakalı merkezinde belirgindir (Şekil 3 ve 5, kesik çizgiler). Yanı sıra, kemirgen alloCTL TU-2449 hücrelerinin yıkımı 48 saat sonrası sedimantasyon (Şekil 4) de görülebilir. tek tabaka alloCTL mevduat merkezinde oblitere, ama insan hücreleri 21 veya düşük tayinlerde 13-06-MG ve U-87mg HLA ifadesinde örtüşme ya nedeniyle, tek tabaka geri kalan üzerinden daha yavaş gerçekleşir kemirgen glioma için efektör hücrelerin sayısını başlangıç. Efektör uzak sedimantasyon sitesinden göç alloCTL olarak da, yoğunluğu hedef efektör azalır. Göç ve sitolizi ek olarak, bu protokol virüs kodlayan floresan protein transferini görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Burada, tümör hücrelerine karşı alloCTL gelen EMD için RRV kodlayan aktarım 72 saat (Şekil 5, ek), sonra belirgindir.
Bu modelin bir sınırlama göç sadece vivo göç gerçekten yansıtıcı olmayabilir vitro, değerlendirilebilir olmasıdır. Başka bir sınırlama kemokin / kemokin reseptör eğimleri modeli kullanılarak tesis edilemez olduğunu. ECM veya bireysel tümör hücreleri ile bağışıklık hücrelerinin etkileşimi hala ortaya çıkar ve bağlı olan hücreler salgıladıkları ne ya, bu hareketlilik eşek ifade olsa daay yapışmayan hücreler uzakta izole faktörlerden özellikle göç veya olup olmadığını sorulara cevap olmaz.
Bu deneyde bir avantajı, lenfositler ya transduse edilmemiş ve yapışmayan hücreler popülasyonu göç işlevselliğini korumak olmadığını belirlemek için yeteneğidir. Bizim örneğimizde, transdüse ICSI'nin EMD protein ekspresyonu ile görünür, ve göç işlevsellik bu populasyonda muhafaza açıktır. Daha geniş bir uygulama bir yapışkan immün hücre göçü etkili olabilecek maddeler ya da ilaçların çeşitli konsantrasyonlarının etkisini test etmek olabilir. Ayrıca, diğer hematopoietik hücreler, çeşitli yüzeyler veya normal dokudan türetilmiş yapışık hücreler üzerinde hareket için test edilebilir. Bu sağlayabilir, örneğin, yapışık hücre tipleri, stromal hücreleri ya da tümör ile bir dendritik hücre kombinasyonu tohumlama, burada yapılmaz, ancak son olarak, in vivo ortamda daha fazla kompleks yansıtıcı analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Hibe Numarası UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734 ve Joan S. Holmes Memorial Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. MJH ve GCO UCLA Joan S. Holmes Memorial Doktora Sonrası Bursu desteklenen aldı. CSM cihaz Yaratıcı Bilimsel Yöntemleri elde edilmiştir: www.creative-sci.com. Lentiviral vektör KÜR / P30 DK041301 tarafından desteklenen UCLA Vektör Core, alındı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μl Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μl Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μl pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
- Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
- Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
- Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. Determinants of human astrocytoma migration. Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).
- Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
- Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
- Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
- Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
- Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
- Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
- Prevention, C. fD. C. a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5 edn, Health and Human Services. (2009).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
- Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
- Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).
