Protocol
Alle dyrene ble plassert og omsorg i samsvar med nasjonale og institusjonelle retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr. Etikk godkjenning for denne protokollen ble gitt av University of British Columbia Animal Care Committee. Hann, Sprague-Dawley-rotter som veier mellom 300-450 g ble anvendt for denne protokollen.
1. Donor Operation
- Har ca. 100 ml kardioplegi (RT) i en sylindrisk kolbe koblet til lang intravenøs (IV) kateterrøret ved en tre-veis stoppekran. Bruke et stativ for å heve kolben til omtrent 80 cm over den operative overflate, slik at kardioplegi levering av tyngdekraften.
- For å visualisere strukturer tilstrekkelig, enten bruke et par av kirurgiske luper eller en disseksjonsmikroskop.
MERK: For tiden bruker vi en kikkert operasjonsmikroskop med 3,4 - 21.3X forstørrelse. - Plasser donor i en bedøvelse kammer og indusere anestesi med 4-5% isofluran. Overfør rotte til en driftsplattform og opprettholde anestesi ved nese-membran med 1 - 2% isofluran. Påfør veterinæren salve til dyrets øyne for å hindre tørrhet. Administrer midazolam (2 mg / kg) intra-peritonealt med en 25 G nål.
- Ved hjelp av kirurgiske clippers, barbere donor fra xiphisternum til kjeven. Barbere et lite område av venstre lyske (for etterfølgende IV tilgang). Påfør en depilating middel til de operative flater, vent ca 5 min, og fjerner hår med et stykke gasbind.
- Prep kirurgiske områder med en povidon-jod eller chlorexidine-basert løsning (vi bruker kun klorheksidin). Infiltrere såret nettsteder med 0,1 - 0,5% lidokain subkutant.
- Fest forbein og venstre bakben til driftsplattform med teip, forlater den rette bakben fri for overvåkning av anestesidybde og vitale tegn.
- Etter å sikre hensiktsmessig anestesidybden ved pedal knipe, gjør et snitt i venstre lyske krøll hjelpen 22-blad skalpell. Av stump disseksjon, utsett igjen felles femoralvenepunksjon og få IV tilgang på følgende måte:
- Forsiktig trekke vevet liggende lårvenen, og cannulate venen med en 24 G IV. Koble IV til en kort lengde av salt-fylt IV rør, og sikrer slangen på plass med klebebånd.
MERK: Fremgangsmåten for lårbens venøs kanylering hos rotter er beskrevet andre steder av Jespersen og kolleger 14. - Koble en salt-fylt 10 ml sprøyte til IV-rør, og forsiktig suge blod for å sikre korrekt posisjonering av IV.
- Injisere 300-500 IE ufraksjonert heparin gjennom IV rør, og deretter skylle slangen med 3-5 ml saltvann.
- Forsiktig trekke vevet liggende lårvenen, og cannulate venen med en 24 G IV. Koble IV til en kort lengde av salt-fylt IV rør, og sikrer slangen på plass med klebebånd.
- Deretter tracheotomize giver som følger:
- Lag en midtlinjen snitt i det myke vevet mellom vena hakk og kjeven ved hjelp av en 22-blad skalpell. Trenge inn i kapselen i skjoldbruskkjertelen i midtlinjen ved hjelp MetzenBaum saks og eget sine lapper bruker stump disseksjon.
- Ved hjelp av stump disseksjon, skille stropp musklene i nakken i midtlinjen for å avdekke fremre overflate av luftrøret.
- Bruk en buet pinsett til å rett ut dissekere en omkrets flyet rundt luftrøret. Omringe luftrøret med en 4-0 silkeslips.
- Ved hjelp av iris saks, lage en tverrgående snitt i fremre luftrøret, ca 5mm dårligere til skjoldbrusk brusk. Forsiktig introdusere trakealkanyle (en 14 G IV) og fest den på plass med 4-0 silkeslips.
- Koble trakeal kanyle til en mekanisk ventilator. Omdirigere strømmen av oksygen og isofluran gjennom ventilator krets, og ventilere donor med en hastighet og tidevolum spådd av sin vekt 13.
- Lag et snitt i midtlinjen av brystet (ved hjelp av en 22-blad skalpell), som strekker snittet i halsgropen til under xipisternum.
- Bor i midtlinjen, Utfør en median sternotomi bruker et bein cutter. Trekk kantene av sternum med en selv beholde retractor. Tast hjerteposen og pleurahule.
- Utfør en tymektomi. Det er enklest å først bluntly dele thymus i midtlinjen, og deretter skille den fra omkringliggende strukturer ved hjelp av en kombinasjon av stump og skarp disseksjon.
MERK: Opprinnelsen til de interne thorax arteriene kan bli skadet når dissekere thymus bort fra den overlegne sternale kantene. For å forhindre blødninger, kan hemostatiske klipp brukes før du tar av thymus på disse punktene. - Bruke Metzenbaum saks og / eller en skarp Lauer, dissekere peri-cava fett fra nedre vena cava (IVC). Kontroller at IVC er relativt fri for fett og bindevev fra Cavo-atrial veikryss overlegent, til membranen inferiorly.
- Bruk en skarp Lauer, perifert gratis superior vena cava (SVC) og omringe det med en 4-0 silkeslips.
- Deretter dissekerevenstre vena cava fri fra omkringliggende strukturer, og ligate det proksimalt og distalt med 4-0 silkeslips. Resect den mellomliggende del av cava å eksponere venstre arteria subclavia.
- Perifert gratis aortabue fartøy ved hjelp av en skarp Lauer. Påfør proksimale og distale kirurgiske klemmer til innominate arterien, og dele det mellom klippene. La den venstre halspulsåre og venstre subclavia un-klippet.
- Deretter cannulate SVC med en 24 G IV-kateter. Fest kateteret med tidligere plassert 4-0 silkeslips.
- Forbered deg på en hensiktsmessig, men milde pode innhøsting.
- Ved hjelp av skarpe sakser, dele IVC bare overlegen til magen overflaten. Dele SVC overlegen sin kanylering nettstedet, slik at nærliggende luftveis strukturer ikke blir skadet.
- Slå av ventilator og koble fra trakealkanyle. Transekt luftrøret proximally.
- Ta tak i transektert trachea med pinsett, og fjern hjertetog lunger eget blokken. Dette vil kreve skånsom trekkraft med skarp disseksjon som hjerte-lunge-transplantat fjernes. Separer luftrøret fra den underliggende spiserøret. Unngå å skade den synkende aorta, slik at en stor del av det forblir intakt etter høsting.
2. Utarbeidelse av Hjerte-lunge Graft
MERK: når du skal fylle denne delen av prosedyren, bør en assistent være bedøvelse mottaker gnager og forbereder for pode implantasjon.
- Plasser hjerte-lunge-pode på kirurgisk kompress med den fremre overflaten av hjertet vendt ned. Bruke skarp disseksjon, fjerne eventuelle rester av spiserøret, unngå skade på bakre luftveiene.
- Finn synkende thorakalaorta og sette inn en 16 G butt spiss kanyle. Fest kanylen på plass med en 4-0 silkeslips.
- Finn aortabue fartøyer, og bruke en kirurgisk klipp til venstre arteria subclavia. La den venstre halspulsåren un-klippet for subfølgende de-lufting.
- Administrere den første dosen av kardioplegi ved å koble kardioplegi slangen til 16 G aortic kanyle. Karotidarterien må midlertidig tilstoppet med pinsett for å sikre tilstrekkelig levering av kardioplegi.
MERK: En fordel å ha aorta kanyle festet er at kardioplegi kan gis kontinuerlig og / eller periodisk som ønsket. For periodisk dosering, vi vanligvis leverer kardioplegi hvert 10 - 15 min i 5 ml bolusene Over 30 - 45 sek. - Ved hjelp av Metzenbaum saks og / eller en skarp Lauer, dissekere peri-aorta fett bort fra aorta. Kontroller at aorta er relativt fri for fett og bindevev fra venstre arteria subclavia (distal arch) til sin cannulation nettstedet.
- Deretter utsett venstre mainstem bronkie med en skarp Lauer, og ligate det proksimalt med en 4-0 silkeslips. Transekt venstre bronkie distal til ligaturen ved hjelp av iris saks. Utfør en forlatt pneumonectomy ved å ligere venstre lungearterie og vene med 4-0 silkeslips. Transektet distal til ligatur og fjerne venstre lunge.
- Som over, fjern alle andre lungelapper med unntak av høyre øvre og midtre fliker. Unngå å skade den IVC i ferd med å utføre lobectomies.
- Koble kardioplegi slangen til aorta kanylen og administrere kontinuerlig kardioplegi mens mottakeren er under utarbeidelse. Plasser hjerte-lunge-transplantat i en steril beholder (for eksempel et beger).
3. Mottaker Drift
- Bedøve mottakeren i henhold til donor operasjonen, ovenfor. Bruk veterinæren salve for å beskytte øynene til dyr fra tørrhet. Bekreft anestesi ofte av pedal klemme.
- Plasser dyret som per donor operasjon, denne gangen forlater retten forbena fri til å overvåke vitale tegn og anestesidybde.
- Barbere magen fra xiphisternum til penis. Barbere et lite område av venstre lyske (for etterfølgende IV tilgang). Påfør endepilating middel til de operative flater, vente ca. 5 min, og fjerner hår med en bit gasbind.
- Prep kirurgiske områder med en povidon-jod eller chlorexidine-basert løsning. Infiltrere såret nettsteder med 0,1 - 0,5% lidokain subkutant.
- Tracheotomize og lufte mottakeren som anvist ovenfor. Alternativt opprett mottakeren under nesen-membran anestesi.
- Innføre et kateter i den femorale vene, som beskrevet ovenfor. Injisere 300-500 IE ufraksjonert heparin gjennom IV rør, og deretter skylle slangen med 3-5 ml saltvann.
- Utfør en laparotomi ved å lage en midtlinjen abdominal snitt med en 22-blad skalpell fra xiphisternum til penis. Trekk bukveggen ved hjelp av en selv beholde retractor. Deretter trekke tarmer overlegent og rotta venstre side. Pakk dem i varmt saltvann-gjennomvåt gasbind.
- Utsett IVC og abdominal aorta ved kraftig dissekere gjennom liggende retro-peritoneal fett.
- Ha en buet fartøy klemme tilgjengelig og klar.
- Perifert frigjøre IVC og aorta proksimalt og distalt og omringe dem med 4-0 silkeslips. Det bør være ca 2-3 cm mellomrom mellom disse områdene.
- Nøye bruke den buede fartøyet klemmen, slik at en tilstrekkelig del av både IVC og aorta blir eksponert over kjevene på klemmen.
- Gjøre et snitt i fremre vegg av IVC med en 25 G nål koblet til en salt-fylt 1 ml sprøyte. Utvid snittet med Potts saks for å matche lengden av donor IVC åpningen.
- Ta av hjerte-lunge-transplantat fra beholderen og koble den fra kardioplegi. Plasser pode i mottakerens magen i en optimal posisjon til å utføre vene anastomose.
MERK: hjerte-lunge-transplantat til slutt vil bli orientert litt på skrå, med spissen pekende mot magen sin venstre nedre kvadrant. - Sikre hælenog tå ender av anastomose med 9-0 nylon sutur. Bind sikker knute i hver ende, slik at nålen er festet til en arm av sutur, og en kort ende av suturen for å være knyttet til senere. Administrere en dose av kardioplegi.
- I løpende mote, komplett halvparten av sutur linje og slips til å motsette kort sutur arm. Administrere en dose av kardioplegi.
- Fullfør den andre halvdelen av sutur linje og bind den ned. Den venøse anastomose er fullført. Administrere en dose av kardioplegi
- Orienter hjerte-lunge pode med hjertets apex peker mot magen sin venstre nedre kvadrant. Sørg for at den venøse anastomosen ikke er bøyd eller vridd.
- Vurdere lengden av donor aorta som vil være nødvendig for å nå mottakeren aorta, opprettholde både IVC og aorta anastomoser i spenning-fri og un-knekk konfigurasjoner.
- Dele synkende aorta (distal til venstre arteria subclavia) med en iris saks.
- Gjør et incisioN i den fremre vegg til mottakeren aorta med en 25 G nål koblet til en salt-fylt 1 ml sprøyte. Utvid snittet med Potts saks for å matche lengden av donor aortic åpningen.
- Forankre tå (superior aspekt) av donor aorta til mottakeren aorta ved hjelp av en 9-0 nylon sutur. Deretter passerer nålen til den mediale aspektet av aorta og fyller halvparten av anastomosen i å kjøre måte.
- Ved hælen av aorta anastomosen, reversere orienteringen av sutur-linjen (en overgang i retning av sømmen), og fullfører den laterale delen av anastomose i å kjøre måte.
- Sakte fjerne IV kateter i SVC, og ligate SVC med en kirurgisk klipp.
- De-luft aorta ved å finne un-klippet venstre halspulsåre. Holder arterien åpen, i en oppreist stilling som vil tillate luft å bli fritt evakuert.
- I korthet åpne kjevene til den buede fartøyet klemmen og la karotidarterie for å blø (de-luft) for 2 - 3 sek. Påfør fartøyet klemmen.
- Påfør en kirurgisk klippet til halspulsåren. Fjern den buede fartøyet klemmen.
- Sjekk for blødning på sutur linjer. Hvis til stede, bestemt mot kompresjon med kirurgisk gas eller reparasjon med en lengde på 9-0 nylon sutur (avhengig av hvor alvorlig blødning).
- Donor hjerte bør fortsette å slå i løpet av minutter.
- Følg nøye med på mottakerens vitale tegn, anestesidybden, og administrere volum gjenoppliving etter behov.
- Avhengig av eksperimentelle endepunkter, enten lukke dyrets mage og la den komme fra anestesi, eller forberede dyret for hjerte- vurdering.
MERK: Eksempler på pode Vurderingen omfatter in vivo tiltak av lastavhengig og lastuavhengig hemodynamics, in vitro kor funksjon i Langendorff og arbeids hjerte moduser, og (i overlevelse kirurgi) ekkokardiografi eller MR undersøkelser. - Påenden av akutte terminal forsøk ble dyrene avlivet ved blodtapping.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den HAHLT teknikken beskrevet ovenfor er svært teknisk og krever nøye på detaljer. Tabell 1 viser noen av de viktigste faktorer assosiert med vellykket versus mislykkede prosedyrer, og kan brukes som en guide for feilsøking tekniske problemer.
Etter mottakeren aorta er unclamped bør pode koronararteriene bli sett å fylle med oksygenrikt blod. Følgelig bør hjertemuskelen bli rosa og godt perfusert. I teknisk vellykkede forsøk, blir hjertet begynner å slå kort tid etter pode reperfusjon. Transplantatet bør være i ubelastet tilstand (med mottaker IVC fastklemt) i en periode på minst 20 til 30 min for å muliggjøre funksjonell bedring. Etter det, kan pode er belastningsforhold endres for å passe eksperimentelle mål. Flere kvantitative målinger av organfunksjon (og et vellykket resultat) kan anvendes som ønsket. Som nevnt i protokollen, in vivo in vitro funksjonelle studier, samt ekkokardiografisk og MR undersøkelser kan gi slik informasjon. Figur 1 og 2 er eksempler på in vitro baseline og preload-okklusjon trykk-volumdata som kan utledes akutt med denne metoden. Hemodynamiske data fra disse studiene kan gi etterforskerne med minuttvolum, slagvolum, kammervolum, hjertefrekvens, ejeksjonsfraksjon, end-systolisk elastance, og preload recruitable hjerneslag arbeid. Flere andre parametere kan kvantifiseres, som ønsket.
Figur 1. Baseline Trykkdatavolumet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 1 viser baseline trykkure volum data fra en in vitro arbeider hjertet vurdering av hjertefunksjon. EDV, end-diastolisk volum; EDP, end-diastolisk blodtrykk; ESV, end-systolisk volum; ESP, end-systoliske trykket.
Figur 2. Preload-okklusjonstrykk volum data. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 viser preload-okklusjon trykk-volumdata fra en in vitro arbeider hjertet vurdering av hjertefunksjon. EDPVR, end-diastolisk trykk-volum forhold; ESPVR, end-systoliske trykket volum forholdet.
| Vellykket Prosedyre | Mislykket Prosedyre | |
| Donor | ||
| Donor Stabilitet | Stabil | Ustabil |
| Forberedende Dissection | Effektiv, Limited | Ineffektiv, Overdreven |
| Blood Loss | Minimal | Overdreven |
| Tid for å Eksplanter | Minimert | Langvarig |
| Kardioplegiske Arrest | Rapid | Forsinket |
| Graft | ||
| Total iskemisk Tid | <90 min | > 90 min |
| Kardioplegiske Arrest | Vedlikeholdes med jevne mellomrom | Ufullstendig |
| Mottaker | ||
| Mottaker Stabilitet | Stabil | Ustabil |
| Forberedende Dissection | Effektiv | Ineffektiv |
| Clamp Times | <45 min | > 45 min |
| Anastomose Tid | <30 min | > 30 min |
| Blood Loss | Minimal | Overdreven |
| Graft De-lufting | Tilstrekkelig | Mangel |
| Volume Resuscitation | Tilstrekkelig | Mangel |
| Vellykket Reperfusjon | Ja | Nei |
| Retur av Stable Hjertefunksjon | Ja | Nei |
Tabell 1. Karakteristika for Successful Versus mislykkede HAHLT prosedyrer.
Tabell 1 </ Strong> gir eksempler på faktorer assosiert med vellykket og mislykket donor, pode, og mottaker operasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Suksess med den teknikk som er beskrevet her vil være betinget av flere faktorer. Key blant dem vil være å sikre stabilitet i både giver- og mottaker dyr, vedta nitid operativ teknikk som er trygt og assosiert med minimal blodtap, som sikrer komplett kardioplegiske arrest med uniform pode kjøling, minimere total iskemisk tid, og tilstrekkelig de-lufting pode. Som anerkjent ovenfor, er teknikken tekniske kompleksiteten sin sjef begrensning.
Vi har avansert tidligere HAHLT teknikker på flere måter. De modifikasjoner som er beskrevet i giver- og mottakeroperasjoner tilveiebringe et middel for å utføre nødvendige operative trinn i en kontrollert og effektiv måte. Hjerteinfarkt beskyttelse protokollen beskrevet er en ideell måte å minimere skader under den iskemiske perioden. Sluttresultatet er en HAHLT pode der geometri har blitt optimalisert, har skaden blitt minimert, og egenverdi organfunksjon er forhåndsservert i størst mulig grad.
Teknikken er beskrevet ovenfor gir en HAHLT pode med dynamiske og potensielt nær-fysiologiske ventrikkel-belastningsforhold. Når teknikken er mestret, de transplantasjon konfigurasjons tillatelser komplett in vivo karakterisering av organfunksjon. Som nevnt, kan preload og afterload forholdene endres akutt eller kronisk, og donor lunge kan bli akutt re-ventilert. Etterforskerne kan lett og bredt bruke denne modellen til studiet av mange medisinske tilstander, og samtidig beholde muligheten til å studere pode struktur og funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Mark J. Kearns mottar støtte fra UBC Klinisk Investigator Program (tildelt gjennom Royal College of Physicians og kirurger i Canada), og UBC 4YF Doctoral Fellowship.
John H. Boyd er et nasjonalt Sanitorium Association og Michael Smith Foundation for Health Research Scholar. Finansiering gjennom CIHR. Forfatterne ønsker å takke Dr. M. Allard og Richard Wamboldt for deres hjelp med oppsett og vedlikehold av perfusjon utstyr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Celsior Cardioplegic Soution | Genzyme | The solution is kept on ice throughout the procedure. We prepare our own solution, with slight modifications. | |
| Rodent Ventilator | Harvard Apparatus | Model 683 | |
| Vital Sign Monitor | Nonin | Model 9847V | Displays SpO2 and heart rate. |
| IV Cannulae | Jelco | 3063 | 24 - 26 G x 3/4" cannulae. |
| IV Tubing | CareFusion | MP9259-C | Short-length connector tubing (18 cm). |
| Surgical Clips | Teleflex Medical | 001204 | Horizon titanium ligating clips. |
| Sutures | Ethicon, Sharpoint | LA54G, AK-0107 | 3-0 silk reel, and 9-0 prolene suture (single-armed, DR5 needle). |
| Surgical Instruments | Not Applicable | Not Applicable | The instruments used are generic, and can be purchased from any surgical supply company. |
References
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S. A technique for heart transplantation in the rat. Arch Surg. 89 (1964), 649-652 (1964).
- Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Exp Clin Transplant. 9 (2), 128-133 (2011).
- Wiedemann, D., Boesch, F., Schneeberger, S., Kocher, A., Laufer, G., Semsroth, S. Graft function after heterotopic rat heart transplant with an isolated reperfused working heart: a methodic consideration. Exp Clin Transplant. 10 (2), 154-157 (2012).
- Chen, Z. H., Xia, S. S. The technique of heterotopic heart-lung transplantation in the rat. J Tongji Med Univ. 6 (2), 67-70 (1986).
- Ibrahim, M., Navaratnarajah, M., et al. Heterotopic abdominal heart transplantation in rats for functional studies of ventricular unloading. J Surg Res. 179 (1), e31-e39 (2013).
- Asfour, B., Hare, J. M., et al. A simple new model of physiologically working heterotopic rat heart transplantation provides hemodynamic performance equivalent to that of an orthotopic heart. J Heart Lung Transplant. 18 (10), 927-936 (1999).
- Figueiredo, J. -L., Nahrendorf, M., Sosnovik, D. E., Weissleder, R. MRI of a novel murine working heart transplant model. Circ Heart Fail. 2 (3), 272-274 (2009).
- Wen, P., Wang, X., et al. A simple technique for a new working heterotopic heart transplantation model in rats. Transplant Proc. 45 (6), 2522-2526 (2013).
- Didié, M., Biermann, D., et al. Preservation of left ventricular function and morphology in volume-loaded versus volume-unloaded heterotopic heart transplants. A.Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (4), H533-H541 (2013).
- Galiñanes, M., Zhai, X., Hearse, D. J. The effect of load on atrophy, myosin isoform shifts and contractile function: studies in a novel rat heart transplant preparation. J Mol Cell Cardiol. 27 (1), 407-417 (1995).
- Yokoyama, H., Ohmi, M., Murata, S., Nakame, T., Tabayashi, K., Mohri, H. Proposal of a working left heart model with a heterotopic transplantation technique in rats. J Heart Lung Transplant. 14 (4), 706-712 (1995).
- Maruyama, T., Swartz, M. T., McBride, L. R., Pennington, D. G. Working heart model of heterotopic heart-lung transplantation in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 107 (1), 210-215 (1994).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J Vis Exp. (59), 3496-3410 (2012).
- Habertheuer, A., Kocher, A., et al. Innovative, simplified orthotopic lung transplantation in rats). J Surg Res. 185 (1), 419-425 (2013).
