עכברוש Heterotopic בטן לב / השתלת ריאה בודדת בתצורה טעונה נפח

Protocol

כל בעלי החיים שוכנו וטיפלו בהתאם הלאומי והנחיות מוסדיים לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. אישור אתיקה לפרוטוקול זה הוענק על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת הטיפול בבעלי חיים של קולומביה הבריטית. , חולדות זכרי Sprague-Dawley משקל בין 300-450 גר שמשו לפרוטוקול זה.

מבצע 1. התורם

1. יש כ 100 מיליליטר של cardioplegia (RT) בבקבוק גלילי מחובר ל( IV) צינורות צנתר לוריד ארוכים על ידי ברזלים 3-דרך. השתמש עמדה לרומם את הבקבוק לכ 80 סנטימטרים מעל פני השטח האופרטיביים, המאפשר משלוח cardioplegia על ידי כוח הכבידה.
2. כדי להמחיש את המבנים כראוי, להשתמש גם זוג loupes כירורגית או מיקרוסקופ לנתח.
   הערה: בשלב זה אנו משתמשים במיקרוסקופ הפעלה משקפת 3.4 - הגדלת 21.3X.
3. מניחים את התורם בתא הרדמה ולגרום להרדמה עם 4 - 5% isoflurane. העבר את העכבר לפלטפורמת הפעלה ולשמור על הרדמה על ידי האף-קונוס עם 1 - 2% isoflurane. החל משחה וטרינר לעיניו של בעל החיים למניעת יובש. לנהל midazolam (2 מ"ג / קילוגרם) תוך peritoneally עם מחט 25 G.
4. באמצעות קוצץ כירורגית, לגלח את התורם מxiphisternum ללסת תחתונה. לגלח אזור קטן של המפשעה השמאלית (לגישה הרביעית שלאחר מכן). החל סוכן depilating למשטחים האופרטיביים, לחכות כ 5 דקות, ולהסיר את השיער עם פיסת הגזה.
5. הכן את האתרים כירורגית עם פתרון המבוסס על chlorexidine povidone- יוד או (אנו משתמשים רק chlorhexidine). לחדור אתרי incisional עם 0.1 - 0.5% מתחת לעור לידוקאין.
6. Secure forelimbs וhindlimb שמאל לפלטפורמת ההפעלה עם דבק, עוזב את hindlimb תקין חינם לניטור של עומק הרדמה וסימנים חיוניים.
7. לאחר הבטחת עומק הרדמה מתאימה ידי קמצוץ דוושה, עושה חתך בקפל המפשעה השמאלי באמצעותאזמל 22-להב. על ידי נתיחה בוטה, לחשוף את וריד הירך הנפוץ עזב ולקבל גישה הרביעית כדלקמן:
   1. בעדינות לחזור בי הרקמה המכסה את וריד הירך, וcannulate את הווריד עם IV 24 G. חבר את IV לאורך קצר של צינורות IV מלוחים מלא, ולאבטח את הצינור במקום עם נייר דבק.
      הערה: הליך cannulation ורידי הירך בחולדות מתואר במקומות אחרים על ידי Jespersen ועמיתים ^14.
   2. חבר מזרק 10 מיליליטר מלוח מלאות לצינורות IV, ולשאוב בעדינות דם כדי להבטיח מיקום נכון של IV.
   3. הזרק 300-500 IU של הפרין unfractionated דרך צינורות IV, ולאחר מכן לשטוף את צינורות עם 3-5 מיליליטר של תמיסת מלח.
8. בשלב הבא, tracheotomize התורם כדלקמן:
   1. לעשות חתך קו האמצע ברקמות הרכות בין החריץ והלסת התחתון הצוואר באמצעות אזמל 22-להב. לחדור את הקפסולה של בלוטת התריס בקו האמצע באמצעות Metzenמספריים באום, ואונותיה נפרדות באמצעות נתיחה בוטה.
   2. באמצעות נתיחה בוטה, להפריד את שרירי רצועת הצוואר בקו האמצע כדי לחשוף את פני השטח הקדמי של קנה הנשימה.
   3. השתמש מלקחיים מעוקלים לנתח בצורה בוטה מטוס היקפי סביב קנה הנשימה. להקיף את קנה הנשימה עם עניבת משי 4-0.
   4. בעזרת המספריים איריס, לעשות חתך רוחבי בקנה הנשימה הקדמית, כ 5 מ"מ נחותים סחוס התריס. בעדינות להכניס הצינורית לקנה הנשימה (14 G IV) ולאבטח אותו במקום באמצעות עניבת משי 4-0.
   5. חבר את הצינורית לקנה הנשימה להנשמה מכאנית. הפניה זרימת החמצן וisoflurane דרך מעגל ההנשמה, ולאוורר את התורם בשיעור ונפח של גאות ושפל חזה לפי משקלה ^13.
9. עושה חתך בקו האמצע של החזה (באמצעות אזמל 22-להב), הארכת החתך בצוואר החריץ מתחת xipisternum.
10. להישאר בקו האמצע, בצע sternotomy חציון באמצעות חותך עצם. לחזור הקצוות של עצם החזה עם מפשק שמירה עצמית. הזן את קרום הלב והחללים pleural.
11. בצע thymectomy. זה הכי קל לחלק ראשון בבוטות התימוס בקו האמצע, ואז להפריד אותו ממבנים הסמוכים באמצעות שילוב של נתיחה בוטה וחדה.
    הערה: מקורו של העורקים החזי הפנימיים עלולה להיפצע כאשר לנתח התימוס מהקצוות sternal מעולים. כדי למנוע דימום, קליפים עוצר דמום ניתן להחיל לפני הסרת בלוטת התימוס בנקודות אלה.
12. בעזרת המספריים מצנבאום ו / או לאואר חד, לנתח פרי caval שומן מנחות הווריד הנבוב (IVC). ודא שIVC הוא חופשי יחסית של שומן ורקמת חיבור מצומת Cavo-פרוזדורי superiorly, לסרעפת inferiorly.
13. שימוש באואר חד, הווריד הנבוב מעולה circumferentially חופשי (SVC) ולהקיף אותו עם עניבת משי 4-0.
14. בשלב הבא, לנתח אתהשאיר וריד נבוב חופשי ממבנים סמוכים, ולקשור אותו proximally ו distally עם 4-0 עניבות משי. לכרות החלק להתערב קאווה לחשוף את העורק התת-השמאל.
15. Circumferentially בחינם כלי קשת אב העורקים באמצעות אואר חד. החל קליפים כירורגית הפרוקסימלי ודיסטלי לעורק innominate, ולחלק אותו בין קטעים. השאר את עורק תרדמה משותף שמאל ו- מקוטע האו"ם עורק subclavian השמאל.
16. בשלב הבא, cannulate SVC עם קטטר 24 G IV. Secure את הקטטר עם עניבת המשי הוצב בעבר 4-0.
17. היכונו לקציר שתל מועיל, אבל עדין.
18. בעזרת מספריים חדים, לחלק את IVC רק מעולה למשטח סרעפתית. מחלקים את SVC מעולה לאתר cannulation, על מנת להבטיח שמבנים סמוכים בדרכי נשימה לא נפגעו.
19. כבה את מכשיר ההנשמה ונתק את הצינורית לקנה הנשימה. Transect קנה הנשימה proximally.
20. לתפוס את קנה הנשימה transected עם מלקחיים, ולהסיר את הלבוריאות en-גוש. זה ידרוש מתיחה עדינה עם נתיחה חדה כמו שתל לב-הריאה הוסר. הפרד את קנה הנשימה מהוושט הבסיסי. להימנע מפגיעה באב העורקים היורדים, כך שחלק ממנה ארוך נותר בשלמותה לאחר קציר.

2. הכנה של הלב-הריאה השתל

הערה: בעת השלמת חלק זה של ההליך, עוזר צריך להיות הרדמה המכרסם הנמען והכנה להשתלת שתל.

1. מניחים את שתל לב-ריאה בגזה כירורגית עם המשטח הקדמי של הלב כלפי מטה. באמצעות נתיחה חדה, להסיר כל וושט שייר, הימנעות מפגיעה בדרכי הנשימה האחורית.
2. אתר את אב העורקים החזי יורדים ולהכניס צינורית קהה שקצה 16 G. אבטח את הצינורית במקום עם עניבת משי 4-0.
3. אתר את כלי קשת אב העורקים, ולהחיל קליפ כירורגית לעורק subclavian שמאל. השאר את העורק הראשי עזב בלתי מקוטעת למשנהדה-שידור שלאחר מכן.
4. לנהל את המנה הראשונה של cardioplegia על ידי חיבור צינורות cardioplegia לצינורית אב העורקים 16 G. העורק הראשי חייבים להיות occluded באופן זמני עם מלקחיים כדי להבטיח אספקה ​​נאותה של cardioplegia.
   הערה: יתרון לבעל צינורית אב העורקים המצורף היא שcardioplegia עשוי להינתן ברציפות ו / או לסירוגין כרצוי. למינון לסירוגין, אנחנו בדרך כלל להעביר cardioplegia כל 10 - 15 דקות ב 5 מיליליטר בולוס על 30 - 45 שניות.
5. בעזרת המספריים מצנבאום ו / או לאואר חד, לנתח שומן פרי-אב העורקים מאב העורקים. ודא שאב העורקים הוא חופשי יחסית של שומן ורקמת חיבור מהעורק השמאלי subclavian (קשת דיסטלי) לאתר cannulation.
6. בשלב הבא, לחשוף את סימפונות mainstem עזבו באמצעות אואר חד, ולקשור אותו proximally עם עניבת משי 4-0. Transect דיסטלי סימפונות השמאל לקשירה באמצעות מספריים איריס. בצע ריאה הותירה ligating הריאה השמאליתעורק לוריד עם 4-0 עניבות משי. Transect דיסטלי למייתר ולהסיר את הריאה השמאלית.
7. כאמור לעיל, להסיר את כל אונות הריאה האחרות למעט האונות העליונות ואמצעיות הנכונות. למנוע פציעת IVC בתהליך של ביצוע lobectomies.
8. חבר את צינורות cardioplegia לצינורית אב העורקים ולנהל cardioplegia הרציף תוך הנמען הוא להיות מוכן. מניחים את שתל לב-ריאה במכל סטרילי (למשל, כוס).

3. נמען מבצע

1. להרדים את הנמען כלפעולת תורם, לעיל. השתמש משחה וטרינר כדי להגן על עיניו של בעל החיים מיובש. לאשר הרדמה לעתים קרובות על ידי קמצוץ דוושה.
2. מקם את החיה כמו לכל הפעולה התורמת, זה זמן לעזוב את forelimb תקין החופשי כדי לפקח על סימנים חיוניים ועומק הרדמה.
3. לגלח את הבטן מxiphisternum לפין. לגלח אזור קטן של המפשעה השמאלית (לגישה הרביעית שלאחר מכן). החלdepilating סוכן למשטחים האופרטיביים, לחכות כ 5 דקות, ולהסיר את השיער עם פיסת הגזה.
4. הכן את האתרים כירורגית עם povidone- יוד או פתרון מבוסס chlorexidine. לחדור אתרי incisional עם 0.1 - 0.5% מתחת לעור לידוקאין.
5. Tracheotomize ולאוורר את הנמען כמכוון לעיל. לחלופין, לשמור על הנמען בהרדמה האף-קונוס.
6. להציג את צנתר לוריד הירך כפי שתואר לעיל. הזרק 300-500 IU של הפרין unfractionated דרך צינורות IV, ולאחר מכן לשטוף את צינורות עם 3-5 מיליליטר של תמיסת מלח.
7. בצע laparotomy על ידי ביצוע חתך בבטן קו האמצע עם אזמל 22-להב מxiphisternum לפין. לחזור דופן הבטן באמצעות מפשק שמירה עצמית. בשלב הבא, לחזור בו מהמעיים superiorly ולצד השמאלי של החולדה. לעטוף אותם בגזה חמה, ספוג מלוחה.
8. לחשוף את אב העורקים IVC ובטן על ידי חדות לנתח באמצעות שמעליה מחדששומן tro הצפק.
9. יש מהדק כלי מעוקל זמין ומוכן.
10. Circumferentially לשחרר את IVC ואב עורקי proximally ו distally ולהקיף אותם עם 4-0 עניבות משי. לא צריך להיות כ 2 - 3 סנטימטר של שטח בין אתרים אלה.
11. להחיל בזהירות את מהדק הכלי המעוקל, להבטיח כי חלק מספק של שני IVC ואב עורקים חשופים מעל הלסתות של המהדק.
12. עושה חתך בקיר הקדמי של IVC עם מחט 25 G מחוברת למזרק 1 מיליליטר מלוח מלא. להאריך את החתך עם מספריים פוטס כדי להתאים את אורכו של פתח IVC תורם.
13. הסר את שתל לב-ריאה מיכל שלו ונתק אותו מcardioplegia. מניחים את השתל בבטן של הנמען במיקום אופטימלי לביצוע ההשקה הוורידים.
    הערה: שתל לב-הריאה סופו של דבר להיות מכוון מעט באלכסון, עם ההצבעה השיא לקראת הבטן של רביע שמאלי תחתון.
14. אבטח את העקבובוהן מסתיימת בהשקה עם 9-0 תפר ניילון. לקשור קשר מאובטח בכל קצה, והשאיר את המחט מחוברת לזרוע של תפר ארוך, וקצה קצר של תפר להיות קשורה למאוחר יותר. לנהל מינון של cardioplegia.
15. בריצה אופנה, מחצית מקו התפר והעניבה לזרוע תפר הקצרה המנוגדות מלאה. לנהל מינון של cardioplegia.
16. השלם את המחצית השנייה של קו התפר ולקשור אותו. ההשקה הוורידים היא מלאה. לנהל מינון של cardioplegia
17. אוריינט שתל לב-ריאה עם הלב של הצבעה שיא לכיוון הבטן של רביע השמאלי תחתון. ודא שהשקת הוורידים אינה מפותלת או מעוות.
18. להעריך את אורכו של אב העורקים תורם שיידרש כדי להגיע לאב עורקי הנמען, שמירה על שני IVC וanastomoses אב העורקים בתצורות-מתח חופשי ובלתי מפותל.
19. מחלקים את אב העורקים היורדים (דיסטלי לעורק subclavian שמאל) עם איריס מספריים.
20. הפוך incision בקיר הקדמי של אב העורקים נמען עם מחט 25 G מחובר למזרק 1 מיליליטר מלוח מלא. להאריך את החתך עם מספריים פוטס כדי להתאים את אורכו של פתח אב העורקים תורם.
21. לעגן את הבוהן (היבט מעולה) של אב העורקים התורם למקבל אב העורקים באמצעות תפר 9-0 ניילון. לאחר מכן, להעביר את המחט להיבט המדיאלי של אב העורקים ולהשלים מחצית מההשקה בניהול אופנה.
22. בעקב של ההשקה אב העורקים, להפוך את הכיוון של קו התפר (מעבר בכיוון של תפרים), ולהשלים את מחצית הרוחב של ההשקה בניהול אופנה.
23. לאט לאט להסיר את הצנתר הרביעי בSVC, ולקשור SVC עם קליפ כירורגית.
24. דה-אוויר אב העורקים על ידי איתור עורק התרדמה משותפת-מקוטע של האו"ם עזב. החזק את העורק פתוח, בתנוחה זקופה שתאפשר אוויר להתפנות באופן חופשי.
25. בקצרה לפתוח את הלסתות של מהדק הכלי המעוגל ולאפשר את העורק הראשי לדמם (דדואר אוויר) 2 - 3 שניות. להחיל מחדש את מהדק הכלי.
26. החל קליפ כירורגית לעורק הראשי. הסר את מהדק הכלי המעוקל.
27. בדוק דימום בקווי התפר. אם הווה, להחיל דחיסה עדינה עם גזה או תיקון ניתוחי באורך של תפר 9-0 ניילון (בהתאם לחומרה של דימום).
28. לב התורם צריך לחדש את המכות בתוך דקות.
29. לשים לב לסימנים החיוניים של הנמען, עומק ההרדמה, ולנהל החייאת נפח בהתאם לצורך.
30. בהתאם לנקודתי הקצה הניסיוניים, או לסגור את הבטן של החיה ותן לזה להתאושש מהרדמה, או להכין את החיה להערכת לב וכלי דם.
    הערה: דוגמאות להערכת שתל כוללות באמצעים vivo של פרמטרים המודינמיים עומס תלוי ועומס-עצמאי, צעדים במבחנה של פונקציה בLangendorff ומצבי לב עובדים, ואקו (בניתוח הישרדות) או חקירות MRI.
31. בסוף ניסויי מסוף חריפים, בעלי חיים מומתים על ידי exsanguination.

Representative Results

טכניקת HAHLT שתוארה לעיל היא טכנית מאוד ודורשת תשומת לב לפרטים. טבלת 1 מדגיש חלק מהגורמים המרכזיים הקשורים להצלחה לעומת נהלים כושלים, ויכול לשמש כמדריך לפתרון בעיות בקשיים טכניים.

אחרי אב העורקים נמען unclamped, יש לראות עורקים הכליליים השתל למלא עם דם מחומצן. בהתאם לכך, שריר הלב צריך להיות ורוד וperfused היטב. בניסויים מוצלחים מבחינה טכנית, הלב מתחיל לפעום זמן קצר לאחר reperfusion השתל. השתל יש להשאיר במדינה טעון (עם הנמען IVC מהודק) לתקופה של לפחות 20 - 30 דקות, כדי לאפשר התאוששות פונקציונלית. בעקבות כך, תנאי הטעינה של השתל עשויים להשתנות כדי להתאים למטרות ניסוי. יותר מדדי כמותיים של תפקוד שתל (ותוצאה מוצלחת) יכולים להיות מועסקים כרצוי. כפי שצוין בפרוטוקול, in vivo ובמחקרי מבחנה פונקציונליים, כמו גם אקו וחקירות MRI יכול לספק מידע כזה. איורים 1 ו -2 הן דוגמאות במבחנת תחילת המחקר ולטעון מראש-חסימת נתוני לחץ-נפח שניתן להפיק בחריפות עם מתודולוגיה זו. נתונים המודינמית ממחקרים אלה יכולים לספק לחוקרים עם תפוקת לב, נפח פעימה, כרכים קאמריים, קצב לב, מקטע פליטה, elastance הסוף-סיסטולי, ולטעון מראש עבודת שבץ recruitable. ניתן לכמת כמה פרמטרים אחרים, כרצונכם.

נתונים לחץ-נפח 1. Baseline איור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1 מציג עיתונות בסיסיתנתונים יור-נפח במבחנת הערכת לב עבודה של תפקוד לב. EDV, סוף-דיאסטולי נפח; EDP, לחץ הדיאסטולי קצה; ESV, הסוף-סיסטולי נפח; ESP, לחץ הסיסטולי קצה.

2. נתונים לחץ-נפח Preload-חסימת איור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

נתוני איור 2 מראה preload-חסימת לחץ-נפח במבחנת הערכת לב עבודה של תפקוד לב. EDPVR, יחסי לחץ-נפח סוף דיאסטולי-; ESPVR, יחסי לחץ-נפח סוף-סיסטולי.

	נוהל מוצלח	נוהל לא מוצלח
תורם
יציבות תורם	יציב	לא יציב
ההכנה Dissection	יעיל, מוגבל	לא יעיל, מוגזם
איבוד דם	מינימאלי	מוגזם
זמן explant	ממוזער	ממושך
מעצר Cardioplegic	מהיר	מתעכב
שתל
סה"כ איסכמי זמן	<90 דקות	> 90 דק '
מעצר Cardioplegic	נשמר מעת לעת	שלם
נמען
יציבות נמען	יציב	לא יציב
ההכנה Dissection	יעיל	לא יעיל
קלאמפ טיימס	<45 דק '	> 45 דקות
השקה זמן	<30 דקות	> 30 דקות
איבוד דם	מינימאלי	מוגזם
השתל דה-שידור	נאות	לא מספיק
החייאת נפח	נאות	לא מספיק
Reperfusion המוצלח	כן	לא
שובו של תפקוד לב יציב	כן	לא

טבלה 1. מאפייני מוצלחים נגד נהלי HAHLT לא מוצלחים.

טבלת 1 </ Strong> מספק דוגמאות לגורמים הקשורים לתורם מוצלח ולא מוצלח, שתל, ופעולות נמען.

Discussion

הצלחה עם הטכניקה שתוארה כאן תהיה מבוססת על מספר גורמים. מפתח ביניהם יהיה הבטחת יציבות של שני חיות התורם והמקבל, אימוץ טכניקה ניתוחית קפדנית, כי הוא בטוח וקשור עם איבוד דם מינימאלי, על מנת להבטיח מעצר מלא cardioplegic עם קירור שתל אחיד, צמצום זמן איסכמי כולל, ושתל השידור-דה כראוי. כהודה לעיל, המורכבות הטכנית של הטכניקה היא המגבלה העיקרית שלה.

יש לנו מתקדם טכניקות HAHLT קודמות בכמה מובנים. השינויים שתוארו בפעילות תורמת והמקבל לספק אמצעי ביצוע צעדים אופרטיביים נחוצים באופן מבוקר ויעיל. פרוטוקול הגנת שריר הלב שתאר הוא אמצעי אידיאלי של מזעור פגיעה בתקופה איסכמי. התוצאה הסופית היא שתל HAHLT בי גיאומטריה כבר מותאמת, פציעה מוזערה, ותפקוד שתל פנימי כבר מראששימש למידה המרבית האפשרית.

הטכניקה שתוארה לעיל מניבה שתל HAHLT עם תנאי חדרית טעינה דינמיים ופוטנציאל כמעט פיסיולוגיים. ברגע שהטכניקה כבר שולטת, היתרי תצורת השתלה מלאים באפיון vivo של פונקצית שתל. כפי שצוין, ניתן לשנות את תנאי preload וafterload בחריפות או כרוני, וריאות תורם ניתן מחדש מאווררות בחריפות. חוקרים יכולים בקלות ורחבה ליישם מודל זה לחקר מצבים רפואיים רבים, תוך שמירה על היכולת ללמוד מבנה שתל ותפקוד.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Celsior Cardioplegic Soution	Genzyme		The solution is kept on ice throughout the procedure. We prepare our own solution, with slight modifications.
Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Vital Sign Monitor	Nonin	Model 9847V	Displays SpO2 and heart rate.
IV Cannulae	Jelco	3063	24 - 26 G x 3/4" cannulae.
IV Tubing	CareFusion	MP9259-C	Short-length connector tubing (18 cm).
Surgical Clips	Teleflex Medical	001204	Horizon titanium ligating clips.
Sutures	Ethicon, Sharpoint	LA54G, AK-0107	3-0 silk reel, and 9-0 prolene suture (single-armed, DR5 needle).
Surgical Instruments	Not Applicable	Not Applicable	The instruments used are generic, and can be purchased from any surgical supply company.