Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

واللونية الفحص أن يقيس على وجه التحديد آخر باء granzyme متعلق ب التحلل البروتيني: التحلل من بوك علاء علاء-ASP-S-BZL

Published: November 28, 2014 doi: 10.3791/52419

Introduction

Granzymes هي عائلة من البروتياز سيرين وجدت في الجسيمات الحالة إفرازية من القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا والخلايا الليمفاوية التائية السامة (CTL) 1. وتوجد خمسة granzymes مختلفة في البشر (A، B، H، K وM)، وعشرة في الفئران (A - G، K، M و N) 2،3. Granzyme ألف وباء granzyme (GzmA، GzmB) هي الأكثر وفرة وتم التحقيق فيها على نطاق واسع في الإعداد البشري والقوارض.

وظيفة كلاسيكية من GzmB هو استحثاث موت الخلايا المبرمج في الخلايا المستهدفة تنفيذها بالتزامن مع البروتين perforin تشكيل المسام، مما يسمح للgranzyme للوصول إلى الخلية المستهدفة العصارة الخلوية (4). وعلى الرغم من GzmB التعبير وجدت بشكل لا لبس فيه في الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا، والدراسات الأخيرة تم معالجة مجموعة متنوعة من أنواع أخرى خلية، معربا عن GzmB، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على الخلايا الكيراتينية قعدات 6، 7 الخلايا البدينة، الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل والخلايا B 9، 10.وفي هذا السياق، تم الكشف عن وظائف GzmB غير أفكارك تتراوح من المشاركة في عمليات التهابات، وإعادة عرض الأنسجة وخصائص immunoregulatory أخرى 11-14.

وبالنظر إلى أن تم اقتراح دورا البيولوجي أوسع للGzmB مما اعتقد سابقا، تتطلب الباحثين أدوات محددة وموثوق بها للكشف لها. من ميزة هو شرط GzmB المحددة ليلتصق على الجانب الكربوكسيل من بقايا حمض الأسبارتيك، وهي خاصية فريدة من نوعها بين البروتياز سيرين حقيقية النواة 15. الماوس والبشرية وGzmB الفئران وهيكليا مشابهة جدا، ولكن خصوصية الركيزة طويلة من الماوس GzmB تختلف بمهارة من أن كل من الإنسان والفئران 16، وهو ما يعني أن بعض ركائز العامة مع آسيا والمحيط الهادئ في محطة (P1) يمكن المشقوق كفاءة من خلال GzmB من جميع الأنواع الثلاثة، في حين ركائز أخرى مع تسلسل أكثر تعقيدا من المنبع P1 قد تعطي نتائج متفاوتة على نطاق واسع. في كل من الماضي وأكثر من ذلك لى مؤخراterature، هذه الحقيقة قد تسبب ارتباك كبير وسوء فهم لأهمية بيولوجية لبعض النتائج التجريبية، على الرغم تسيطر عليها بعناية، سعت الدراسات الحركية لتصحيح الوضع 17.

في هذه الورقة سعينا لتوضيح هذه النقاط باستخدام اثنين من ركائز المتاحة تجاريا، وهي بوك علاء علاء-ASP-SBzl وN-أسيتيل-إيل-حمض الغلوتاميك-برو-ASP-P-nitroanilide. الكواشف اثنين لا تولد مختلف الجماعات المتفاعلة التالية الانقسام (أ sulphydryl مجانا مقابل paranitroanilide مجانا الفلورسنت)، ولكن هذا أي تأثير مهما على انشقاق بروتين. بروتوكول صفها هو التكيف الحديثة من بروتوكول قديمة جدا 18، ولكن ينبغي أن تساعد المحققين لاستخدام ركائز GzmB المختلفة بشكل مناسب، مع توفير إطار منهجي للكشف عن نشاط granzymes أخرى، مثل GzmA وGzmH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت الطحال كانت مستمدة من الفئران (6-10 أسابيع من العمر) وجميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية الحيوان مركز السرطان ماك كالام بيتر (E486): ملاحظة.

1. إعداد العينات.

  1. إعداد تنشيط خلايا فأر NK.
    1. عزل خلايا NK ساذجة الأولية من وحيدة الخلية تعليق من الطحال من C57BL / 6 أو B6.GrzmB - / - (GzmB اغية الجينات) الفئران عن طريق الانتقاء السلبية باستخدام أدوات متوفرة تجاريا.
    2. اتبع بروتوكول الصانعين. لفترة وجيزة، مغناطيسيا تسمية "غير NK-" خلايا مثل T و B الخلايا، والخلايا الجذعية، المحببة، الضامة، وخلايا الدم الحمراء باستخدام الأجسام المضادة البيوتين مترافق ضد علامات سطح الخاصة. استخدام الفصل المغناطيسي مع حبات مكافحة البيوتين في استنزاف خلايا "غير NK".
    3. ثقافة معزولة خلايا NK لمدة 5-7 أيام في وسائل الإعلام التي تحتوي على IL-2 (1،000 U / مل) في 700،000 خلية / مل في 24 لوحات جيدةفي 37   ° C.
    4. بدلا من ذلك، تنشيط خلايا T استخدام 19، وتقييد مستضد الأساسي CTL من OT1 T مستقبلات الخلايا الفئران المعدلة وراثيا 20، ولدت CTL في الثقافات المختلطة اللمفاويات 21، أو supernatants من خلايا NK تنشيط لتحديد نشاط يفرز GzmB 19.
  2. صيانة الإنسان NK خط الخلية وعزل الخلايا NK الأولية.
    1. الحفاظ على سرطان الدم NK البشري (خلايا YT) في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) متوسطة تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين. بدلا من ذلك، تنقية الخلايا القاتلة الطبيعية الأولية من الدم المحيطي من المواضيع الصحية وتحفيز لمدة 2-3 أيام في المتوسط ​​تحتوي على IL-2 في 100 U / مل كما هو موضح سابقا (22).
  3. جيل من الخلية لست].
    1. غسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4)، ثم وقف في Nonidet P-40 تحلل العازلة (0.1٪ NP-40، 250 مم كلوريد الصوديوم، و 25 ملي HEPES، 2.5 ملي EDTA). من الناحية المثالية، ليز ما لا يقل عن 5 × 10 6 7 T الخلايا في 100 ميكرولتر عازلة. لا تقم بإضافة مثبطات الأنزيم البروتيني، وكثير وكذلك مثبطات البروتياز سيرين لا رجعة فيها، وعلى وجه الخصوص في tryptases مثل GzmA. احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة، ثم تكوير نوى في microcentrifuge في 15،000 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل بيليه النووي ونقل طاف لأنبوب جديد.
  4. تحديد تركيز البروتين من لست].
    1. استخدام بروتوكول المتاحة تجاريا من اختيار مثل برادفورد أو حمض bicinchoninic (BCA) وتحديد تركيز البروتين. تأكد من أن التركيز هو ~ 2 ملغ كحد أدنى / مل. متجر لست] في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة (النشاط granzyme مستقرة لعدة شهور في -20 ° C).

2. باء granzyme آخر الفحص

  1. إعداد الكواشف
    1. إعداد 10 ملي الأسهم من ركائز (بوك-AAD-S-BZL أو التيار المتردد-IEPD-السلطة الوطنية الفلسطينية) في DMSO (~ 5 ملغ / مل) وتخزينها في aliquots في -20 & #176، C. إعداد تخفيف العمل الطازجة وتجاهل بعد كل يوم، كما بوك-AAD-S-BZL hydrolyzes جزئيا على التخزين في DMSO.
    2. إعداد 250 ملي الأسهم من كاشف اللونية (5،5'-ثنائي ثيو؛ ديثيو مكرر (حمض 2-nitrobenzoic)، DTNB) في DMSO (0.09 جم / مل) وتخزينها في -20 ° C. إعداد التخفيف عمل جديدة كل يوم. مطلوب فقط هذا كاشف عن ركائز مع جماعات مؤشر SBzl، وليس السلطة الوطنية الفلسطينية.
    3. تشكل عازلة جديدة (0.1M HEPES، 0.05 M MgCl ودرجة الحموضة 7.3) كل 2-3 أسابيع.
  2. جلب DTNB وركائز الاصطناعية إلى درجة حرارة الغرفة. تمييع ركائز (1:16، على سبيل المثال 100 ميكرولتر في 1.6 مل من العازلة) وDTNB (1: 250، على سبيل المثال 10 ميكرولتر في 2.5 مل عازلة) وتخلط جيدا.
  3. تمييع ما لا يقل عن 100 ميكروغرام البروتين المحللة من كل عينة في المنطقة العازلة على الحجم النهائي من 160 ميكرولتر. باستخدام ماصة الأقنية إضافة 50 ميكرولتر لكل بئر في ثلاث نسخ (~ 33.3 ميكروغرام / جيد) في '' U '' الفينيل أسفل لوحة 96-جيدا.تشمل "العازلة فقط" التحكم (أيضا في ثلاث نسخ).
  4. إضافة 100 ميكرولتر من المخفف DTNB لسيطرة عينات / عازلة (حذفت هذه الخطوة عند العمل مع ميلان-IEPD-السلطة الوطنية الفلسطينية.
    ملاحظة: الشق من التيار المتردد-IEPD-السلطة الوطنية الفلسطينية من قبل GzmB النشرات مباشرة الفلورة السلطة الوطنية الفلسطينية (الشكل 4B).
  5. استخدام ماصة الأقنية لإضافة بسرعة 50 ميكرولتر من ركائز المخفف إلى كل مجموعة من يثلث، بدءا من المخزن المؤقت ثم أي ضوابط السلبية والتشطيب مع العينات الايجابية المتوقعة.
  6. وضع لوحة في قارئ لوحة. قياس النشاط آسيا والمحيط الهادئ-بورصة عمان من قبل التحلل من بوك علاء علاء-ASP-S-BZL / AC-IEPD-السلطة الوطنية الفلسطينية في القارئ صفيحة ميكروسكوبية OD 405 نانومتر. استخدام بروتوكول الفحص الحركي، ويستغرق 25 القراءات، كل 15 ثانية (حوالي 6 دقائق الوقت في القراءة الإجمالية).
  7. استخدام قراءات الامتصاصية ولدت في كل نقطة زمنية لحساب معدل الركيزة الانقسام يدويا إذا كان برنامج لوحة القارئ لا يمكن أن تولد قيمة للVMAX.

3. تحليل داتا

ملاحظة: البيانات التي تم إنشاؤها يرد كحد أقصى سرعة، الذي يعرف بأنه تغيير OD على مر الزمن (وزارة الدفاع / دقيقة).

  1. لتحليل البيانات، وتحديد الحد الأقصى لمعدل الانقسام الركيزة، والذي يحسب من معدل التغير في الامتصاصية. القيام بذلك تلقائيا باستخدام برنامج قارئ لوحة، التي لديها عادة هذا الخيار.
  2. بدلا من ذلك بعد عرض المؤامرات الحركية للتغيير في الامتصاصية، والتي يتم إنشاؤها أثناء الفحص الحركي على قارئ لوحة، يدويا تحديد نقاط البيانات التي تعطي أشد خط على التوالي. بالنسبة لمعظم المقايسات ويتحقق الحد الأقصى لمعدل داخل دقيقة 2 الأول من الفحص.
  3. طرح القراءة OD الأولية من أعلى قراءة OD على هذا الخط المستقيم والقسمة على الفاصل الزمني. نقل البيانات الخام إلى منصة مايكروسوفت اكسل / الرسم البياني للتحليل الإحصائي وعرض الرسوم البيانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الركيزة بوك-AAD-S-BZL هي محددة لGzmB

وGzmB سيرين البروتياز هو أحد المكونات الرئيسية من الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا (خلايا CTL وNK) وغالبية سكانها من المسؤول عن إحداث الموت أفكارك السريع في الخلايا المستهدفة، مثل الخلايا أو تحويلها المصابة بالفيروسات. هذا هو إلى حد كبير بسبب تفضيل ركيزة لها للانشقاق بعد بعض مخلفات اسبارتاتي محددة في البروتينات المختارة، سمة مشتركة مع caspases، الذي يلتصق أيضا بعد مخلفات اسبارتاتي ولكن هم من فئة مختلفة من البروتياز، والسيستين البروتيني الأسرة 15. هذا الاختلاف في آلية بروتين يعني أن AAD-SBzl لا يمكن المشقوق من قبل أي كاسباس. هو فعل GzmB التعبير التالي تفعيل الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا والنشاط الأنزيمي يمكن رصدها في الخلية لست] أعدت من هذه الخلايا (الشكل 1). وقد سمح توافر granzyme الجين الفئران خروج المغلوب لنا لإثبات أنيتحلل thiobenzyl استر (S-BZL) تحديدا GzmB - الببتيد الركيزة الاصطناعية بوك علاء علاء-ASP (AAD). انشقاق قوي من الركيزة الاصطناعية يمكن قياسها في المحللة خلية من خلايا NK الأولية B6، ولكن ليس في B6.GrzmB - / - الخلايا القاتلة الطبيعية. كعنصر تحكم، ونشاط بروتين من GzmA، التي لديها مثل التربسين (تريبتاز) الركيزة خصوصية وموجود في كل لست] كان ما يعادلها، مقاسا التحلل من N-α-CBZ-L-ليسين (BLT) -S- BZL.

تسلسل GzmB التعرف على الركيزة أنواع محددة

تسببت الدراسات المبكرة التي تصف جزيئات الخلية المستهدفة المحتملة المشقوق من قبل GzmB بعض الارتباك حتى اتضح أن الماوس وGzmB البشرية لديهم تفضيل التعرف على الركيزة تغير قليلا، وهو ما تمليه ما يصل إلى 8-10 مخلفات رسم الخرائط المحيطة P1 اسبارتاتي 23. وكان هذا واضحا بشكل خاص في الدراسات التي فحصت الانقسام من الموالي لأفكارك BH3 فقطالمزايدة جزيء، والتي يمكن المشقوق بكفاءة من قبل الإنسان، ولكن أقل بكثير بكفاءة عن طريق الماوس GzmB. في خلايا سليمة، وهذا الفرق يؤدي إلى تفعيل مختلف مسارات موت الخلايا، مع GzmB البشرية العاملة تفضيلي من خلال مسار الميتوكوندريا، والماوس GzmB عبر تفعيل كاسباس المباشر. وكشف تحليل تسلسل رباعي البيبتيد التي GzmB الماوس الإنسان ولكن لا يمكن أن يلتصق بعد تسلسل IEPD، والذي يطابق تسلسل الاعتراف في كل من الإنسان والفأر المزايدة 16. في كل من الأدب ومنتج تجاري كتالوجات الركيزة رباعي البيبتيد، وقد استخدم التيار المتردد-IEPD-السلطة الوطنية الفلسطينية بشكل عام لاختبار النشاط GzmB (الجدول 1). فمن الواضح الآن أنه بينما الفأر والإنسان على حد سواء يمكن أن يلتصق بوك-AAD-S-BZL، مع كفاءة مشابهة جدا، فشل GzmB الماوس في الخلية لست] NK أن يتحلمأ بكفاءة التيار المتردد-IEPD-السلطة الوطنية الفلسطينية (الشكل 2). في المقابل، خفض كمية البشري المحللة NK YT من 30 ميكروغرام إلى 10 ميكروغرام يزال resulteد في GzmB كافية ليتحلل الركيزة التيار المتردد-IEPD-السلطة الوطنية الفلسطينية (الشكل 3).

الشكل (1)
تم تحديد نشاط انزيم الحبيبية في خلايا NK الفئران باء granzyme (اللوحة العليا) وgranzyme ألف (اللوحة السفلى) النشاط في الخلية لست] NK من wildtype B6 وB6.GrzmB الفئران خروج المغلوب من الحد الأقصى لمعدل التحلل من Boc-: الشكل 1. علاء علاء الحية-S-BZL وN-α-CBZ-L-S-BZL يسين ركائز الببتيد. بيانات تصور واحد تجربة تمثيلية أجريت في ثلاث نسخ (ن> 3).

الشكل 2
الشكل 2: التحلل أنواع محددة من التيار المتردد-IEPD- السلطة الوطنية الفلسطينية الركيزة ماوس وGzmB الإنسان يتحلل بوك علاء علاء-ASP-S-BZL بالتساوي ولكن GzmB الإنسان فقط مائيا التيار المتردد-IEPD-السلطة الوطنية الفلسطينية. الإنساناستخدمت خط الخلية NK YT والأساسي IL-2 الماوس تنشيط NK كمصدر للGzmB. ويظهر شريط رسم بياني واحد تجربة تمثيلية أجريت في ثلاث نسخ (ن> 3).

الشكل (3)
الرقم 3: تخفيض تركيز البروتين لم إلغاء النشاط GzmB تمت مقارنة معدل التحلل من التيار المتردد-IEPD-السلطة الوطنية الفلسطينية الناجمة عن GzmB البشرية باستخدام تناقص تركيز البروتين من YT NK خط الخلية المحللة. ممثل التجربة لمدة n> 3.

الشكل (4)
الرقم 4: تصوير بياني لمبدأ المقايسة يشق GzmB ركائز بوك-AAD-S-BZL (A) و AC-IEPD-السلطة الوطنية الفلسطينية (B) بعد اسبارتاتي P1، وبالتالي الإفراج إما مركب البنزيل، الذي يتفاعل بدوره مع D TNB لتشكيل مولدات الفلورة أيون 3-كربوكسي-4-nitrophenoxide (A)، أو عن طريق الإفراج عن مباشرة ف nitroanilide، وهو حامل اللون نفسه (B). يمكن الكشف عن انبعاثات مضان من كل من هذه الجزيئات في 405 نانومتر.

سيرين البروتيني الركيزة نشاط
Granzyme A N-α-CBZ-L-ليسين (BLT) thiobenzyl استر (S-BZL) تريبتاز 22
باء granzyme 1. بوك علاء علاء-ASP (AAD) -S-BZL ASPase 14
2. N-أسيتيل-إيل-حمض الغلوتاميك-برو-ASP (IEPD) -p-nitroanilide (السلطة الوطنية الفلسطينية)
Granzyme H SUC-الفنيل ألانين-لوي-الفنيل ألانين-S-BZL كيماز 23

الصورة = "jove_content"> الجدول 1: يمكن الكشف عن قائمة من ركائز المتاحة للكشف عن النشاط granzyme النشاط تريبتاز من GzmA من قبل التحلل من معين N-α-CBZ-L-ليسين (BLT) thiobenzyl استر (S-BZL) . GzmB تحديدا يشق بعد مخلفات اسبارتاتي (ASP-بورصة عمان)، والتي يمكن تقييمها من قبل التحلل إما بوك علاء علاء-ASP (AAD) -S-BZL (بالكشف عن الماوس والنشاط GzmB البشري)، أو N-أسيتيل Ile- حمض الغلوتاميك-برو-ASP (IEPD) -p-nitroanilide (السلطة الوطنية الفلسطينية) (يكتشف الوحيد النشاط GzmB البشري). ويتم تقييم النشاط كيماز من GzmH من قبل انشقاق من SUC-الفنيل ألانين-لوي-الفنيل ألانين-S-BZL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تاريخيا تم تحديد granzymes كما الجزيئات المستجيب الرئيسية من الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا (خلايا CTL وNK) قادرة على إحداث الموت أفكارك السريع في الخلايا المستهدفة. جاء هذا الارتفاع نتيجة لعمل GzmB، التي المشقوق المستهدفة جزيئات الركيزة في اسبارتاتي (D) المخلفات وبالتالي كان قادرا على تفعيل تتالي كاسباس من قبل كل من الشق المؤيدة للcaspases، فضلا عن العديد من أهدافها المصب. ومع ذلك، وهي محط تقدير الآن أن GzmB التعبير لا يقتصر على الخلايا السامة للخلايا اللمفاوية وظيفتها يجوز تمديدها إلى ما وراء الاعتراف الخلية المستهدفة وموت الخلايا.

في هذه الورقة وصفنا البروتوكول الذي تمكن من الكشف عن GzmB تنشط في الخلية لست] المستمدة من كل من الفأر وخلايا CTL / NK الإنسان باستخدام أحد الفحص اللونية بسيط. بساطة وخصوصية هذا الاختبار كما تثبت ذلك هذه النتائج تسمح بتطبيق هذا البروتوكول لدراسة GzmB في عينات الخلوية من مصدر آخرالصورة. ومع ذلك، فمن المهم أن لست] الخلوية لديها تركيز البروتين من 2mg ما لا يقل عن / مل، وشملت الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة في بروتوكول تجريبي. خصوصية كاشف بوك-AAD-SBzl لGzmB هو واضح من عدم وجود نشاط الركيزة-انشقاق في المحللة المستمدة من GzmB الحيوانات فارغة، والنشاط هو ضائع تماما (الشكل 1). في أي دراسات المستقبلية فمن المستحسن أن مثل هذه السيطرة السلبية (ق. بروتوكول القسم 1.1) ويستخدم للتحقق من أي نشاط الكشف هو محدد لGrzB. (ملاحظة: على الرغم من أن مثل GRB، caspases لها خصوصية مطلقة للانشقاق في مخلفات اسبارتاتي في موقف P1، ركائز فضل هي tetrapepetides حيث الحامض الأميني P4 هو أيضا عامل حاسم من خصوصية 24). إذا فحص المواد المؤتلف الموقع سيرين نشطة لالبروتيني متحولة ألانين (البروتيني غير نشط أعدت تماما بنفس الطريقة التي يعامل بها إنزيم النشطة) ينبغي أن يكون طncluded، وهذا مهم بشكل خاص إذا يعاير لست] خلية غير الثديية، وخاصة تلك التي من الخميرة أو الخلايا البكتيرية.

باستخدام بروتوكول أعلاه لفحوصات من خلايا الثدييات، لا تقلص النشاط GzmB من خلال وجود الداخلية وما شابه ذلك مثبطات الأنزيم البروتيني سيرين (serpins)، التي يمكن أن تكون كبيرة تصل التنظيم في الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا تفعيلها (CL) 25، وكذلك في الخلايا المشتقة من الأنسجة غير محصنة، بما في ذلك الخلايا تحولت 26. وserpinB9 عصاري خلوي، (سابقا PI-9) غير محددة للغاية لGzmB الإنسان؛ ولكن في الماوس، وهناك عدة orthologues معينة قريبة ولكن ليه منها B9 السربين، أو SPI-6 والنشاط المثبطة كبير للماوس GzmB 27. على الرغم من أن تحلل في NP-40 عازلة يمكن أن يكون متساهل لتوليد التفاعل لا رجعة فيه بين GzmB والسربين، الحضانة عند 37 درجة مئوية هو مطلوب لتكوين معقد الأمثل 28. نحن لا كشف عن تشكيل تعقيدا في عشرلست] ه من قبل وصمة عار الغربية، التي من شأنها أن تؤدي إلى فقدان النشاط البروتيني. ويتم هذا البروتوكول بها في درجة حرارة المختبر نموذجية المحيطة، ويصل إلى ~ 22 ° C.

من أكثر من 20 عاما من الخبرة في تنفيذ هذه المقايسات وجدنا أن المصدر التجاري للكاشف بوك-AAD-SBzl له أهمية يفنات للحصول على نتائج متسقة وحساسة وموثوقة. نود أن نوصي فقط المورد قمنا المشار إليها، على الرغم من أن المصادر التجارية الأخرى هي أيضا مناسبة لركائز اللازمة للكشف عن نشاط granzymes الأخرى. بروتوكول صفها في هذه الورقة يمكن أن تتكيف بسهولة لتحديد نشاط الأنزيم البروتيني الأخرى البروتياز الحبيبية سيرين من قبل التحلل من ركائز الببتيد الاصطناعية مع تسلسل الاعتراف المناسب كما هو موضح في الجدول 1. وN-α-CBZ-L-يسين-S- BZL الركيزة يمكن استخدامها للكشف عن النشاط تريبتاز كل من GzmA في الماوس وCL البشري ونظريا GzmK في الماوس CL. وعلى الرغم من GzmK التعبير مرنا أثبتت RT-PCR في الخلايا القاتلة الناتجة عن GzmAB الفئران بالضربة القاضية جين ردا على الببتيدات أنفلونزا 29، ونحن لسنا على علم GzmK نشاط الأنزيم البروتيني بعد أن تم الإبلاغ عنها في هذا أو أي سياق آخر ذي صلة من الناحية الفسيولوجية. النشاط إما المؤتلف GzmH الإنسان، أو البروتيني تنقيته من الخلايا القاتلة الطبيعية، ويمكن تقييم مع SUC-الفنيل ألانين-لوي-الفنيل ألانين-S-BZL 30، ومع ذلك فإنه ليس من الممكن أن نعزو التحلل من هذه الركيزة خصيصا لهذا granzyme في لست] الخلية. الخلايا الليمفاوية تحتوي على عدد من البروتياز endolysosomal أخرى مثل cathepsins، والتي سيكون لها أيضا مثل كيموتربسين (كيماز) النشاط. في الماوس، يتم استبدال الجينات GzmH من قبل مجموعة من الجينات (Gzms CF) عن توقع أن يكون مماثلا (كيماز) النشاط.

وعلى الرغم من وجدت GzmB البشرية ليلتصق بشكل فعال BH3 فقط جزيء الموالية للأفكارك المزايدة، وبالتالي إشراك الميتوكوندريا مباشرةمسار الموت 31، على ما يبدو نتائج متضاربة تم الحصول عليها في البداية مع الماوس GzmB. تم حل هذه البلبلة التي كتبها دراسات أنيقة من قبل عدد من المحققين، الذي قرر أن تسلسل التعرف على الركيزة المفضل اختلف بين الفأر والإنسان (والفئران) GzmB، على الرغم من درجة عالية (~ 80٪) من التماثل تسلسل العام للالبروتياز 16، 17،23. تسلسل الاعتراف الأمثل لGzmB الإنسان هو I / V، E / M / Q، P / XAA (S / T) وD في موقف P1 في حين فأرة الحاسوب GzmB فمن L / I / V، E، F / Y / Q، D 16،17. كان الفارق كبيرا في موقف P2، وعلى وجه الخصوص P امر لا يمكن تحمله عن طريق الماوس GzmB، وبالتالي الماوس المزايدة (IEPD 75) الموقع الانقسام لن يتم استيعابها من قبل شق GzmB الركيزة ملزمة. وعلاوة على ذلك، فإن ركائز الببتيد الاصطناعية IEPD-السلطة الوطنية الفلسطينية، وصفت بشكل روتيني كما محددة لGzmB، وIETD-السلطة الوطنية الفلسطينية، وتحلل سيئة عن طريق الماوس GzmB. ونحن كذلك عززت النتيجة التي أدلى بها الآخرين 23 إعادة استخدامcombinant granzymes أن GzmB الإنسان، ولكن لا GzmB موجودة في الماوس NK وCTL يتحلل IETD-السلطة الوطنية الفلسطينية وIEPD-السلطة الوطنية الفلسطينية. Kaiserman وآخرون. 17 مقارنة النشاط انشقاق البشرية المؤتلف وأنتجت الماوس GRB في Pichia pastoris، وذلك باستخدام بوك-AAD-SBzl مع ركائز ميلان-IETD-السلطة الوطنية الفلسطينية. وبالمثل، وجد الباحثون أنه بينما كل من الانزيمات المشقوق بوك-AAD-SBzl مع الكفاءة قابلة للمقارنة، التحلل من التيار المتردد-IETD-السلطة الوطنية الفلسطينية عن طريق الماوس GRB كان 30 أضعاف أقل كفاءة. بينما يفضل T وP (وكذلك S) في موقف P2 التي كتبها GzmB البشرية، لا يتم التسامح مع أنهم الماوس GzmB. على النقيض من ذلك، أثبتنا بوضوح النشاط GzmB مماثل في كلا لست] خلية الإنسان والفأر NK باستخدام أكثر عمومية بوك-AAD-SBzl كاشف. ومع ذلك، يمكن أن يتم الكشف عن النشاط الوحيد GzmB البشري مع كاشف IEPD-السلطة الوطنية الفلسطينية.

معا هذه النتائج تسلط الضوء على حقيقة أن الخلافات لخصوصية رائعة من GzmB من مختلف الأنواع يمكن أن يكون لها تأثير كبير على كيفية اختيارالركيزة المناسبة لتحليل في المختبر. وباختصار، إذا تم التحقيق كشف عن الماوس، والنشاط البشري GzmB أو الفئران، بوك-AAD-SBzl هو الركيزة في الاختيار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SMSB05 Granzyme B substrate (mouse and human)
Ac-IEPD-pNA  SM Biochemicals LLC, CA SMPNA009 Granzyme B substrate (only human)
N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl Sigma-Aldrich C3647 Granzyme A substrate
Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SB025 Granzyme H substrate
5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)  Sigma-Aldrich D8130 DTNB, Ellman’s Reagent
NK cell isolation kit II mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-096-892 negative selection kit
NK cell isolation kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-092-657 negative selection kit
Plate reader Biorad iMark Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3
Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate Corning, MA, USA 2797

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).
  2. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).
  3. Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. , (2009).
  4. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).
  5. Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).
  6. Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).
  7. Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).
  8. Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. , (2009).
  9. Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).
  10. Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).
  11. Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).
  12. Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).
  13. Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).
  14. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).
  15. Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).
  16. Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).
  17. Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).
  18. Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
  19. Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).
  20. Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).
  21. Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).
  22. Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).
  23. Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).
  24. Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).
  25. Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).
  26. Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).
  27. Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).
  28. Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
  29. Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).
  30. Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).
  31. Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).

Tags

الكيمياء، العدد 93، باء granzyme، البروتياز سيرين، thioesters الببتيد، BOC علاء علاء-ASP-S-BZL، الركيزة اللونية، التحلل، والنشاط آسيا والمحيط الهادئ-بورصة عمان
واللونية الفحص أن يقيس على وجه التحديد آخر باء granzyme متعلق ب التحلل البروتيني: التحلل من بوك علاء علاء-ASP-S-BZL
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. More

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter