Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Un dosage colorimétrique qui mesure spécifiquement l'activité protéolytique Granzyme B: hydrolyse de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Published: November 28, 2014 doi: 10.3791/52419
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Introduction

Granzymes sont une famille de sérine-protéases présentes dans les lysosomes sécrétoires de cellules tueuses naturelles (cellules NK) et de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) 1. Cinq granzymes différentes existent chez l'homme (A, B, H, K et M), et dix chez les souris (A - G, K, M et N) 2,3. Granzyme A et granzyme B (GZMA, GZMB) sont les plus abondants et ont été largement étudiées dans le contexte humain et de rongeur.

La fonction classique de GZMB est l'induction de l'apoptose dans des cellules cibles exécutées en conjonction avec la perforine protéine formant des pores, ce qui permet d'accéder à la granzyme cytosol de la cellule cible 4. Bien que l'expression GZMB est sans équivoque trouvée dans les lymphocytes cytotoxiques, des études récentes se sont penchés sur une variété d'autres types de cellules GZMB exprimant, y compris, mais sans s'y limiter, les kératinocytes 5, basophiles 6, les mastocytes 7, les cellules dendritiques plasmacytoïdes 8, et les cellules B 9, 10.Dans ce contexte, les fonctions de GZMB non apoptotiques ont été révélés allant de participation dans les processus inflammatoires, le remodelage des tissus et d'autres propriétés immunorégulatrices 11-14.

Étant donné qu'un rôle biologique plus large a été proposé pour GZMB qu'on ne le pensait, les chercheurs ont besoin d'outils fiables et spécifiques pour sa détection. L'avantage est de GZMB exigence spécifique pour cliver du côté carboxylique de résidus acide aspartique, une propriété unique parmi les serine proteases eucaryotes 15. Souris, humaines et GZMB de rat sont structurellement très similaires, mais la spécificité de substrat étendu de GZMB de souris diffère légèrement de celle de fois humaine et de rat 16, ce qui signifie que certains substrats génériques avec Asp à la borne (P1) peuvent être clivées efficacement par GZMB des trois espèces, alors que d'autres substrats avec des séquences plus complexes amont de P1 peuvent donner des résultats très variables. Dans le passé et li plus récenteterature, ce fait a causé de la confusion et une mauvaise interprétation de la signification biologique de certains résultats expérimentaux considérables, même si soigneusement contrôlée, des études cinétiques ont cherché à corriger la situation 17.

Dans cet article, nous avons cherché à illustrer ces points en utilisant deux substrats disponibles dans le commerce, à savoir Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl et N-acétyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilide. Les deux réactifs faire générer différents groupes réactifs après le clivage (un sulfhydryle libre par rapport à un paranitroanilide gratuitement fluorescent), mais cela n'a aucun effet sur le clivage protéolytique. Le protocole décrit est une adaptation moderne d'un protocole très vieux 18, mais devrait aider les enquêteurs à utiliser les différents substrats de GZMB appropriée, tout en fournissant un cadre méthodologique pour détecter l'activité d'autres granzymes, comme GZMA et GzmH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTE: Les rates ont été dérivées de souris (6-10 semaines d'âge) et toutes les expériences animales ont été réalisées conformément aux lignes directrices en matière d'éthique des animaux du Centre Peter MacCallum Cancer (E486).

1. Préparation des échantillons.

  1. Préparation de cellules NK activées souris.
    1. Isoler les cellules NK naïfs primaires à partir de suspensions unicellulaires des rates de souris C57BL / 6 ou B6.GrzmB - / - (GZMB gène null) souris par sélection négative en utilisant des kits disponibles dans le commerce.
    2. Suivez le protocole des fabricants. Brièvement, les cellules magnétiquement étiqueter "non-NK» tels que les cellules T et B, des cellules dendritiques, des granulocytes, des macrophages et des cellules rouges du sang en utilisant des anticorps conjugués à la biotine par rapport à leurs marqueurs de surface spécifiques. Utilisez séparation magnétique avec des perles anti-biotine à épuiser les cellules "non-NK».
    3. Culture isolée des cellules NK pendant 5-7 jours dans un milieu contenant IL-2 (1000 U / ml) à 700 000 cellules / ml dans des plaques à 24 puitsà 37   ° C.
    4. En variante, l'utilisation de 19 cellules T activées, l'antigène CTL primaire restreint OT1 de récepteur de cellule T de souris transgéniques 20, CTL générés dans des cultures mixtes de lymphocytes 21 ou de surnageants de cellules NK activées pour déterminer l'activité de GZMB 19 sécrétée.
  2. Maintien de lignée humaine de cellules NK et l'isolement des cellules NK primaires.
    1. Maintenir la leucémie humaine NK (cellules YT) dans Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal. En variante, les cellules NK purifier primaires à partir du sang périphérique de sujets sains et de stimuler pendant 2-3 jours dans un milieu contenant IL-2 à 100 U / ml comme décrit précédemment 22.
  3. Génération de lysats cellulaires.
    1. Laver les cellules trois fois dans du PBS (pH 7,4), puis à suspendre Nonidet P-40 tampon de lyse (0,1% de NP-40, 250 mM de NaCl, 25 mM de Hepes, 2,5 mM d'EDTA). Idéalement, lyser un minimum de 5 x 10 6 7 cellules T dans un tampon de 100 pi. Ne pas ajouter des inhibiteurs de protease, comme beaucoup sont des inhibiteurs irréversibles des protéases à sérine, et en particulier tels que les tryptases GZMA. Incuber sur de la glace pendant 20 min, puis sédimenter les noyaux dans une microcentrifugeuse à 15 000 xg pendant 10 min. Jeter le culot nucléaire et transférer le surnageant dans un nouveau tube.
  4. Déterminer la concentration en protéines des lysats.
    1. Utiliser un protocole de choix disponibles dans le commerce tels que, Bradford ou l'acide bicinchoninique (BCA) et déterminer la concentration en protéines. Assurez-vous que la concentration est ~ 2 mg / ml minimum. lysats de conserver à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire (activité de granzyme est stable pendant plusieurs mois à -20 ° C).

2. Granzyme B Dosage de l'activité

  1. Préparation des réactifs
    1. Préparer un mM 10 des substrats (Boc-AAD-S-Bzl ou Ac-IEPD-PNA) dans le DMSO (~ 5 mg / ml) et stocker à -20 & #176; C. Préparer une dilution de travail fraîchement et jeter après chaque jour, que Boc-AAD-S-Bzl hydrolyse partiellement sur le stockage dans le DMSO.
    2. Préparer un mM 250 du réactif colorimétrique (5,5'-dithio-bis (acide 2-nitrobenzoïque), DTNB) dans le DMSO (0,09 g / ml) et conserver à -20 ° C. Préparer une dilution de travail frais chaque jour. Ce réactif ne est nécessaire que pour les substrats avec des groupes d'indicateurs SBzl, pas ANP.
    3. Maquillage tampon frais (0,1 M HEPES, 0,05 M de MgCl2, pH 7,3) tous les 2-3 semaines.
  2. Amener DTNB et des substrats synthétiques à température ambiante. Diluer substrats (01:16, par exemple 100 pi de 1,6 ml de tampon) et DTNB (1: 250, par exemple 10 ul dans 2,5 ml de tampon) et bien mélanger.
  3. Diluer au moins 100 pg de protéine de lysat de chaque échantillon dans un tampon à un volume final de 160 ul. En utilisant une pipette multicanaux ajouter 50 pi par puits en trois exemplaires (~ 33,3 ug / puits) dans un '' U '' vinyl fond de plaque de 96 puits.Inclure un «tampon seulement» commande (également en trois exemplaires).
  4. Ajouter 100 pi de DTNB diluée au contrôle des échantillons / tampon (omettre cette étape lorsque vous travaillez avec Ac-IEPD-pNA.
    NOTE: Le clivage de Ac-IEPD-pNA par GZMB libère directement fluorogène pNA (figure 4B).
  5. Utilisez une pipette multicanaux pour ajouter rapidement 50 pi de substrats dilué à chaque ensemble de trois exemplaires, en commençant avec le tampon, puis tous les contrôles négatifs et de finition avec des échantillons positifs attendus.
  6. Placer la plaque dans le lecteur de plaque. Mesurer l'activité Asp-ase par hydrolyse de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA dans un lecteur de microplaques à une DO de 405 nm. Utilisez un protocole de dosage cinétique, prendre 25 mesures, toutes les 15 secondes (environ 6 min temps de lecture total).
  7. Utilisez les lectures d'absorbance générés à chaque point de temps pour calculer manuellement le taux de clivage du substrat si le logiciel du lecteur de plaques ne peut pas générer une valeur pour Vmax.

3. Analyse de Data

REMARQUE: Les données générées est présenté comme vitesse maximale, définis comme changement de DO au fil du temps (MOD / min).

  1. Pour analyser les données, déterminer le taux maximal de clivage du substrat, qui est calculée à partir du taux de changement d'absorbance. Pour ce faire automatiquement en utilisant le logiciel de lecteur de plaque, qui a généralement cette option.
  2. Alternativement après avoir vu les parcelles cinétiques de changement d'absorbance, qui sont générées pendant l'essai cinétique sur le lecteur de plaque, sélectionner manuellement les points de données qui donnent la ligne droite plus raide. Pour la plupart des essais, le taux maximum est atteint dans les 2 premières minutes de l'essai.
  3. Soustraire la valeur de DO initiale de la lecture la plus élevée de OD sur cette ligne droite et diviser par l'intervalle de temps. Transfert des données brutes vers Microsoft Excel / Graph Pad pour l'analyse statistique et l'affichage graphique.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Le substrat Boc-AAD-S-Bzl est spécifique pour GZMB

Le GZMB sérine-protéase est un constituant majeur des lymphocytes cytotoxiques (cellules CTL et NK) et est principalement responsable de l'induction de la mort apoptotique rapide dans les cellules cibles, telles que des cellules infectées par des virus ou transformée. Ce est en grande partie en raison de sa préférence de substrat pour le clivage après certains résidus aspartate spécifiques en protéines sélectionnées, un attribut partagé avec les caspases, qui clivent aussi après résidus aspartate mais qui sont une autre classe de protéases, la famille de cystéine protéase 15. Cette différence dans le mécanisme protéolytique signifie que AAD-SBzl ne peut pas être clivée par la caspase quelconque. GZMB expression est induite suite à l'activation des lymphocytes cytotoxiques et l'activité enzymatique peut être contrôlée dans les lysats cellulaires préparés à partir de ces cellules (figure 1). La disponibilité des souris knock-out du gène granzyme nous a permis d'établir quele substrat synthétique de peptide Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) - thiobenzyle ester (S-Bzl) est spécifiquement hydrolysé par GZMB. Robuste clivage du substrat synthétique peut être mesurée dans un lysat cellulaire à partir de cellules NK B6 primaires, mais pas dans B6.GrzmB - / - cellules NK. A titre de témoin, l'activité protéolytique de GZMA, qui a trypsine (tryptase) spécificité de substrat et est présent dans les deux lysats était équivalente, telle que mesurée par l'hydrolyse du N-α-CBZ-L-lysine (BLT) -S- Bzl.

Séquence de reconnaissance de substrat spécifique de l'espèce GZMB

Les premières études décrivant molécules potentiels de cellules cibles clivées par GZMB causé une certaine confusion jusqu'à ce que il est apparu que la souris et GZMB humaine ont une préférence de reconnaissance de substrat légèrement modifié, qui est dictée par le plus grand nombre 8-10 résidus cartographie entourant la P1 aspartate 23. Cela était particulièrement évident dans les études qui ont examiné le clivage de la pro-apoptotique BH3 seulementBid molécule, qui peut être clivée de manière efficace par des humains, mais beaucoup moins efficacement par GZMB de la souris. Dans des cellules intactes, cette différence se traduit par l'activation de différentes voies de la mort cellulaire, avec GZMB humain fonctionnant de préférence par la voie mitochondriale, et GZMB de la souris via l'activation des caspases direct. L'analyse des séquences a révélé que GZMB tétrapeptide de la souris humain mais ne peut pas cliver après la séquence IEPD, qui correspond à la séquence de reconnaissance à la fois humain et de souris 16 Bid. Tant dans la littérature et dans les catalogues de produit commercial le substrat de tétrapeptide, Ac-IEPD-pNA a été utilisé de façon générique pour tester l'activité de GZMB (tableau 1). Il est maintenant clair que tout à la fois humain et de souris peut cliver Boc-AAD-S-Bzl, avec une efficacité très similaire, GZMB de la souris dans les lysats de cellules NK ne efficacement hydrolyse Ac-IEPD-pNA (Figure 2). En revanche, la diminution de la quantité de lysat NK YT humain de 30 pg à 10 pg resulte toujoursd dans GZMB suffisante pour hydrolyser le substrat Ac-IEPD-pNA (Figure 3).

Figure 1
Figure 1:. L'activité enzymatique de granules dans les cellules NK murines granzyme B (panneau supérieur) et granzyme A (panneau inférieur) activité NK lysats cellulaires provenant de B6 de type sauvage et de souris knock-out B6.GrzmB a été déterminée par la vitesse maximale d'hydrolyse de la résine Boc- Ala-Asp-Ala-Bzl S et de N-α-CBZ-L-S-Bzl-lysine substrats peptidiques. Les données représentent une expérience représentative réalisée en trois exemplaires (n> 3).

Figure 2
Figure 2:. Hydrolyse espèces spécifiques de Ac-IEPD- pNA substrat Mouse et GZMB humaine hydrolysé Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl aussi mais seulement GZMB humaine hydrolysé Ac-IEPD-pNA. L'humainLignée de cellules NK YT primaire et l'IL-2 de souris NK activées ont été utilisés comme source de GZMB. Bar graphique montre une expérience représentative réalisée en trois exemplaires (n> 3).

Figure 3
Figure 3:. Réduction de la concentration en protéines ne ont pas abroger l'activité GZMB La vitesse d'hydrolyse de Ac-IEPD-pNA induite par GZMB humaine a été comparée en utilisant la diminution de la concentration en protéine YT lignée de cellules NK lysat. représentant de l'expérience pour n> 3.

Figure 4
Figure 4:. Représentation graphique du principe de dosage clive GZMB substrats Boc-AAD-S-Bzl (A) et Ac-IEPD-pNA (B) après l'aspartate de P1, libérant ainsi soit un mercaptan benzylique, qui à son tour interagit avec réTNB pour former un ion fluorogénique 3-carboxy-4-nitrophénolate (A), en libérant directement ou p-nitroanilide, qui est lui-même un chromophore (B). Les émissions de fluorescence de ces deux molécules peuvent être détectées à 405 nm.

Serine protease Substrat Activité
Un Granzyme N-α-CBZ-L-lysine (BLT) thiobenzyle ester (S-Bzl) Tryptase 22
Granzyme B 1. Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) -S-Bzl ASPase 14
2. N-acétyl-Ile-Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilide (pNA)
Granzyme H Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl Chymase 23

Tableau 1:. Liste de substrats disponibles pour la détection de l'activité de granzyme activité tryptase de GZMA peut être détectée par l'hydrolyse de la N-α-CBZ-L-lysine spécifique (BLT) thiobenzyle ester (S-Bzl) . GZMB clive spécifiquement après les résidus d'aspartate (Asp-ase), qui peuvent être évalués par l'hydrolyse de l'une Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) -s-Bzl (détecte la souris et l'activité GZMB humaine), ou la N-acétyl-Ile Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilide (PNA) (détecte seule activité de GZMB humaine). Activité chymase de GzmH est évaluée par clivage de Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Historiquement, les granzymes ont été identifiées en tant que molécules effectrices clés de lymphocytes cytotoxiques (cellules CTL et NK) capables d'induire une mort par apoptose rapide dans les cellules cibles. Ce est principalement due à l'action de GZMB, qui clivé molécules de substrat cibles au aspartate (D) résidus et a pu activer la cascade des caspases par les deux clivage pro-caspases, ainsi que plusieurs de leurs cibles en aval ainsi. Cependant, il est maintenant reconnu que les GZMB expression ne est pas limitée à des cellules lymphoïdes cytotoxiques et sa fonction peut être prolongée au-delà de la reconnaissance de la cellule cible et la mort cellulaire.

Dans cet article, on décrit un protocole qui permet la détection de GZMB actif dans des lysats cellulaires provenant de la souris et les cellules CTL / NK humaines en utilisant un test colorimétrique simple. La simplicité et la spécificité de ce test que déterminée par ces conclusions permettre l'application de ce protocole d'examiner GZMB dans les échantillons cellulaires de toute autre sources. Cependant, il est important que les lysats cellulaires ont une concentration en protéines d'au moins 2 mg / ml, et de témoins positifs et négatifs appropriés sont inclus dans le protocole expérimental. La spécificité du réactif Boc-AAD-SBzl pour GZMB est évident d'après le manque d'activité de clivage de substrat dans le lysat provenant de GZMB animaux nuls, que l'activité est complètement perdu (figure 1). Dans des études futures, il est recommandé qu'un tel contrôle négatif (s. De section du protocole 1.1) est utilisée pour vérifier que toute activité détectée est spécifique pour GrzB. (Remarque: Bien que comme GrB, caspases ont une spécificité absolue pour le clivage au niveau des résidus d'aspartate en position P1, les substrats préférés sont tetrapepetides où l'acide aminé P4 est également un facteur déterminant de spécificité 24.). Si l'analyse du matériel recombinant serine du site actif de la protease mutante alanine (protease inactive préparé exactement de la même manière que l'enzyme active) doivent être iNCLUS, et ceci est particulièrement important si le dosage de lysats de cellules non mammifères, en particulier ceux de la levure ou des cellules bactériennes.

En utilisant le protocole ci-dessus pour les dosages de cellules de mammifère, l'activité de GZMB ne est pas diminuée par la présence d'inhibiteurs de protéases à sérine apparentées endogènes (Serpins), qui peut être considérablement régulée à la hausse dans les lymphocytes cytotoxiques activés (CL) 25, ainsi que dans des cellules dérivées à partir de tissus non-immunitaires, y compris les 26 cellules transformées. Le SERPINB9 cytosolique, (anciennement PI-9) est hautement spécifique de GZMB humaine; Cependant, chez la souris, il existe plusieurs orthologues proches mais dont les particuliers b9 serpine, ou SPI-6 a une activité inhibitrice significative de la souris pour GZMB 27. Bien que la lyse NP-40 dans un tampon peut être permissive pour produire une interaction entre GZMB irréversible et serpine, incubation à 37 ° C est nécessaire pour la formation du complexe 28 optimale. Nous ne détectent pas la formation du complexe en ee par Western blot des lysats, ce qui aboutirait à une perte d'activité de protease. Ce protocole est mis en oeuvre à la température du laboratoire typique ambiante, jusqu'à ~ 22 ° C.

De plus de 20 ans d'expérience effectuer ces essais nous avons constaté que la source commerciale du réactif Boc-AAD-SBzl est de la plus haute importance pour obtenir des résultats cohérents, sensibles et fiables. Nous recommandons que le fournisseur nous avons référencé, bien que d'autres sources commerciales sont également appropriés pour les substrats nécessaires pour détecter l'activité d'autres granzymes. Le protocole décrit dans le présent document peut être facilement adapté pour déterminer l'activité de protease d'autres proteases granule de serine par l'hydrolyse de substrats peptidiques synthétiques avec une séquence de reconnaissance appropriée comme indiqué dans le Tableau 1. La N-α-CBZ-L-lysine-S- Bzl substrat peut être utilisé pour détecter l'activité de la tryptase à la fois chez la souris et GZMA CL humain et chez la souris théoriquement GzmK CL. Bien que l'expression GzmK ARNm a été démontrée par RT-PCR dans les cellules tueuses générés à partir de souris knock-out du gène GzmAB en réponse aux peptides de la grippe 29, nous ne connaissons pas de l'activité de protease GzmK ayant été rapportés dans la présente ou ne importe quel autre contexte physiologiquement pertinent. L'activité de l'une GzmH humaine recombinante, ou la protease purifiée à partir de cellules NK, peut être évaluée avec Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl 30, mais il ne est pas possible d'attribuer l'hydrolyse de ce substrat spécifique à cette granzyme en les lysats cellulaires. Les lymphocytes contiennent un certain nombre d'autres proteases telles que les endolysosomal cathepsines, ce qui aura également (chymase) l'activité de type chymotrypsine. Chez la souris, le gène GzmH est remplacé par un groupe de gènes (FC) Gzms tous devrait avoir (chymase) une activité similaire.

Bien GZMB humain a été trouvé pour cliver efficacement le BH3-seule molécule pro-apoptotique de candidature, et donc engager directement mitochondrialvoie de mort 31, apparemment des résultats contradictoires ont été initialement obtenue avec GZMB de la souris. Cette confusion a été résolu par des études élégantes par un certain nombre de chercheurs, qui a déterminé que la séquence de reconnaissance de substrat préféré différait entre les souris et l'humain (et rat) GZMB, malgré le degré élevé (~ 80%) d'homologie de séquence globale des protéases 16, 17,23. La séquence de reconnaissance optimale pour GZMB humain est I / V, E / M / Q, P / Xaa (S / T) et D dans la position P1 alors que pour GZMB de la souris, il est L / I / V, E, F / Y / Q, D 16,17. La différence majeure était à la position P2, comme P en particulier ne est pas tolérée par la souris GZMB, donc la souris Offre (IEPD 75) site de clivage ne ​​seraient pas logés par la fente de liaison substrat GZMB. De plus, les substrats peptidiques synthétiques IEPD-pNA, couramment dénommé spécifique pour GZMB, et IETD-pNA, sont mal hydrolysés par GZMB de la souris. Nous avons encore renforcé la constatation faite par d'autres 23 utilisant rerecombinant granzymes que GZMB humaine, mais pas GZMB présent dans NK de souris et CTL hydrolyse IETD-pNA et IEPD-pNA. Kaiserman et al. 17 a comparé l'activité de clivage de souris et humaine recombinante produite dans GrB Pichia pastoris, en utilisant Boc-AAD-SBzl avec les substrats Ac-IETD-pNA. De même, les auteurs ont constaté que, bien que les deux enzymes clivés Boc-AAD-SBzl avec une efficacité comparable, l'hydrolyse des Ac-IETD-pNA par la souris GrB était 30 fois moins efficace. Alors que T et P (ainsi que S) dans la position P2 sont préférés par GZMB humaine, ils ne sont pas tolérés GZMB de la souris. En revanche, nous avons démontré clairement l'activité de GZMB comparable dans les deux lysats de cellules NK humaines et de la souris en utilisant le plus générique réactif Boc-AAD-SBzl. Toutefois, seule l'activité de GZMB humain n'a pu être détectée avec le réactif IEPD-pNA.

Ensemble, ces conclusions en évidence le fait que les différences de la spécificité fine des GZMB de différentes espèces peuvent avoir un impact majeur sur la façon de choisirun substrat approprié pour l'analyse in vitro. En résumé, si la détection de la souris, l'activité de GZMB humain ou de rat est étudiée, Boc-AAD-SBzl est le substrat de choix.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SMSB05 Granzyme B substrate (mouse and human)
Ac-IEPD-pNA  SM Biochemicals LLC, CA SMPNA009 Granzyme B substrate (only human)
N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl Sigma-Aldrich C3647 Granzyme A substrate
Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SB025 Granzyme H substrate
5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)  Sigma-Aldrich D8130 DTNB, Ellman’s Reagent
NK cell isolation kit II mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-096-892 negative selection kit
NK cell isolation kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-092-657 negative selection kit
Plate reader Biorad iMark Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3
Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate Corning, MA, USA 2797

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).
  2. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).
  3. Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. , (2009).
  4. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).
  5. Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).
  6. Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).
  7. Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).
  8. Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. , (2009).
  9. Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).
  10. Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).
  11. Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).
  12. Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).
  13. Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).
  14. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).
  15. Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).
  16. Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).
  17. Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).
  18. Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
  19. Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).
  20. Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).
  21. Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).
  22. Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).
  23. Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).
  24. Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).
  25. Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).
  26. Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).
  27. Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).
  28. Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
  29. Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).
  30. Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).
  31. Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).

Tags

Chimie Numéro 93 Granzyme B la sérine protéase thioesters peptidiques BOC-Ala-Ala-Asp-S-Bzl substrat colorimétrique l'hydrolyse l'activité asp-ase
Un dosage colorimétrique qui mesure spécifiquement l'activité protéolytique Granzyme B: hydrolyse de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. … More

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter