Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

En kolorimetrisk analyse som spesifikt Måler granzyme B Proteolytisk aktivitet: Hydrolyse av Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Published: November 28, 2014 doi: 10.3791/52419

Introduction

Granzymes er en familie av serin-proteaser som finnes i de sekretoriske lysosomer av naturlige dreper (NK) celler og cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) 1. Fem forskjellige granzymes eksistere hos mennesker (A, B, H, K og M), og ti i mus (A - G, K, M og N) 2,3. Granzyme A og granzyme B (GzmA, GzmB) er den mest tallrike og har blitt grundig undersøkt i den menneskelige og gnager setting.

Den klassiske funksjonen til GzmB er induksjon av apoptose i målceller som utføres i forbindelse med den pore-dannende protein perforin, som tillater granzyme å få tilgang til målcellen cytosol 4. Selv GzmB uttrykk er utvetydig funnet i cytotoksiske lymfocytter, har nyere studier er adressering en rekke andre GzmB-uttrykke celletyper, inkludert men ikke begrenset til keratinocytter 5, basofile 6, mastceller 7, plasmacytoid dendrittiske celler 8 og B-celler 9, 10.I denne sammenheng ble ikke-apoptotiske GzmB funksjoner avslørt alt fra deltakelse i inflammatoriske prosesser, vev ombygging og andre immunregulerende egenskaper 11-14.

Gitt at en bredere biologiske rolle har blitt foreslått for GzmB enn tidligere mistenkt, forskere krever pålitelige og konkrete verktøy for deteksjon sin. Av fordel er GzmB spesifikke krav for å spalte på karboksylsiden av asparaginsyrerester, bolig unike blant eukaryote serinproteaser 15. Mus, menneske og rotte GzmB er strukturelt svært like, men det utvidede substrat spesifisitet mus GzmB forskjellig diskret fra den til både human og rotte 16, noe som betyr at visse generelle substrater med Asp på terminalen (P1) kan spaltes effektivt ved GzmB fra alle tre arter, kan mens andre substrater med mer kompliserte sekvenser oppstrøms av P1 gi allment variable resultater. I både fortid og nyere literature, har dette faktum forårsaket betydelig forvirring og feiltolkning av den biologiske betydningen av noen eksperimentelle funn, selv om nøye kontrollert, har kinetiske studier søkt å rette opp situasjonen 17.

I denne artikkelen har vi forsøkt å illustrere disse punkter ved bruk av to kommersielt tilgjengelige substrater, nemlig Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl og N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilid. De to reagenser gjøre generere ulike reaktive grupper etter cleavage (en gratis sulfhydryl versus et fluorescerende gratis paranitroanilide), men dette har ingen effekt uansett på proteolysespalting. Den beskrevne protokollen er en moderne tilpasning av en svært gammel protokoll 18, men skal hjelpe etterforskerne å bruke de ulike GzmB underlag hensiktsmessig, samtidig gir en metodisk rammeverk for å oppdage aktiviteten til andre granzymes, for eksempel GzmA og GzmH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Milter ble avledet fra mus (6-10 ukers alder) og alle dyreforsøk ble utført i henhold til de dyreetiske retningslinjer Peter MacCallum Cancer Centre (E486).

1. Klargjøring av prøver.

  1. Fremstilling av aktiverte NK-celler mus.
    1. Isolere primære naive NK-celler fra encellede suspensjoner av milten av C57BL / 6 eller B6.GrzmB - / - (GzmB genet null) mus ved negativ seleksjon ved bruk av kommersielle kits.
    2. Følg produsentens protokoll. I korthet, magnetisk etikett "ikke-NK" celler som T- og B-celler, dendrittiske celler, granulocytter, makrofager og røde blodceller ved hjelp av biotin-konjugert antistoff mot deres spesifikke markører overflate. Bruk magnetisk separasjon med anti-Biotin perler å utarme "ikke-NK" celler.
    3. Kultur isolert NK-celler i 5-7 dager i medium inneholdende IL-2 (1000 U / ml) ved 700.000 celler / ml i 24-brønners platerved 37   ° C.
    4. Alternativt bruk aktiverte T-celler, 19 primære antigen-begrenset CTL fra OT1 T-celle-reseptor-transgene mus 20, CTL som genereres i blandede lymfocyttkulturer 21, eller supernatanter fra aktiverte NK-celler for å bestemme aktiviteten av utskilt GzmB 19.
  2. Vedlikehold av human NK-cellelinje og isolering av primære NK-celler.
    1. Opprettholde humane NK leukemi (YT-celler) i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium supplementert med 10% føtalt kalveserum. Alternativt rens primære NK-celler fra perifert blod fra friske forsøkspersoner og stimulerer i 2-3 dager i medium inneholdende IL-2 ved 100 U / ml som tidligere beskrevet 22.
  3. Generasjon av cellelysater.
    1. Vask cellene tre ganger i PBS (pH 7,4), og deretter suspendere i Nonidet P-40 lyseringsbuffer (0,1% NP-40, 250 mM NaCl, 25 mM Hepes, 2,5 mM EDTA). Ideelt lyserer et minimum av 5 x 10 6 7 T-celler i 100 ul buffer. Ikke legg proteasehemmere, som mange er irreversible hemmere av serin proteaser, og særlig tryptases som GzmA. Inkuber på is i 20 min, og deretter pellet kjernene i en mikrosentrifuge ved 15.000 xg i 10 min. Kast den nukleære pelleten og Overfør supernatanten til et nytt rør.
  4. Bestem proteinkonsentrasjonen av lysatene.
    1. Bruk en kommersielt tilgjengelig protokoll av valget som, Bradford eller bicinchoninic syre (BCA) og bestemme proteinkonsentrasjonen. Sikre at konsentrasjonen er ~ 2 mg / ml minimum. Oppbevar lysater ved -20 ° C inntil behov (granzyme aktivitet er stabil i flere måneder ved -20 ° C).

2. granzyme B aktivitetsanalyse

  1. Fremstilling av reagenser
    1. Forberede en 10 mm lager av substrater (Boc-AAD-S-Bzl eller Ac-IEPD-pNA) i DMSO (~ 5 mg / ml) og butikk i delmengder ved -20 & #176; C. Forberede en fungerende fortynning fersk og kast etter hver dag, som Boc-AAD-S-Bzl hydrolyzes delvis på lagring i DMSO.
    2. Forberede en 250 mM lager av kolo reagens (5,5'-ditio-bis (2-nitrobenzosyre), DTNB) i DMSO (0,09 g / ml) og oppbevar ved -20 ° C. Forberede en fersk arbeids fortynning hver dag. Denne reagensen er bare nødvendig for substrater med SBzl indikatorgrupper, ikke PNA.
    3. Sminke frisk buffer (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl2, pH 7,3) hver 2-3 uke.
  2. Bring DTNB og syntetiske substrater til romtemperatur. Fortynne underlag (01:16, f.eks 100 ul i 1,6 ml buffer) og DTNB (1: 250, f.eks 10 pl i 2,5 ml buffer) og bland godt.
  3. Fortynn minst 100 ug protein lysat av hver prøve i buffer til et sluttvolum på 160 ul. Ved hjelp av en multikanal pipette tilsett 50 ul per brønn i triplikat (~ 33,3 ug / brønn) i en '' U '' bunn vinyl- 96-brønns plate.Inkluder en "buffer-only" kontroll (også i tre eksemplarer).
  4. Tilsett 100 mL fortynnet DTNB til prøvene / buffer kontroll (utelate dette trinnet når du arbeider med Ac-IEPD-pNA.
    MERK: Spalting av Ac-IEPD-pNA av GzmB utgivelser direkte fluorogent pNA (Figur 4B).
  5. Bruk en multikanalspipette å raskt legge til 50 mL av utvannet underlag til hvert sett med tre paralleller, starter med buffer deretter eventuelle negative kontroller og etterbehandling med forventede positive prøver.
  6. Plassere platen i plateleser. Mål Asp-ase-aktivitet ved hydrolyse av Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA i en mikroplateleser ved OD 405 nm. Bruk en kinetisk undersøkelse protokollen, ta 25 opplesninger, hvert 15 sek (ca. 6 min total lesing tid).
  7. Bruk avlesninger som genereres ved hvert tidspunkt for å manuelt beregne hastigheten for substrat spalting dersom den plateleser programvaren ikke kan generere en verdi for Vmax.

3. Analyse av DaTA

MERK: Dataene som genereres er presentert som maksimal hastighet, definert som endring av OD over tid (MOD / min).

  1. For å analysere dataene, bestemmer den maksimale hastighet på substratet spaltning, som er beregnet fra hastigheten av endring i absorbans. Gjør dette automatisk ved hjelp av plateleser programvare, som vanligvis har dette alternativet.
  2. Alternativt kan etter å ha vist kinetiske diagrammer av endring i absorbans, som genereres i løpet av den kinetiske analysen på plate-leser, manuelt velge de datapunkter som gir den bratteste rette linje. For de fleste analyser maksimal hastighet er oppnådd i løpet av de første 2 minutter av analysen.
  3. Trekker du den opprinnelige OD lesing fra det høyeste OD lesing på dette rett linje og dividere med det tidsintervallet. Overføre rådata til Microsoft Excel / Graf pad for statistisk analyse og grafisk display.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den Boc-AAD-S Bzl-substrat er spesifikk for GzmB

Serin protease GzmB er en viktig bestanddel av cytotoksiske lymfocytter (CTL og NK-celler), og er hovedsakelig ansvarlig for å indusere hurtig apoptotisk død i målceller, slik som virus-infiserte eller transformerte celler. Dette skyldes i stor grad sin underlaget preferanse for spalting etter visse spesifikke aspartat rester i utvalgte proteiner, delte et attributt med kaspaser, som også spalter etter aspartat rester men er fra en annen klasse av proteaser, den cysteinprotease familien 15. Denne forskjell i den proteolytiske mekanisme betyr at AAD-SBzl ikke kan bli spaltet av en hvilken som helst caspase. GzmB ekspresjon induseres etter aktivering av cytotoksiske lymfocytter og enzymatisk aktivitet kan overvåkes i cellelysatene fremstilt fra disse cellene (figur 1). Tilgjengeligheten av granzyme genet knockout mus har tillatt oss å fastslå atdet syntetiske peptidsubstrat Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) - tiobenzyl ester (S-Bzl) er spesielt hydrolysert av GzmB. Robust spaltning av det syntetiske substratet kan måles på et cellelysat fra B6 primære NK-celler, men ikke i B6.GrzmB - / - NK-celler. Som en kontroll ble den proteolytiske aktivitet av GzmA, som har trypsin-lignende (tryptase) substrat-spesifisitet og er tilstede i begge lysatene var tilsvarende, som målt ved hydrolyse av N-α-CBZ-L-lysin (BLT) -S- Bzl.

Artsspesifikke GzmB substrat gjenkjennelsessekvens

Tidlige studier som beskriver potensielle mål celle molekyler spaltes ved GzmB forårsaket noen forvirring før det kom fram at mus og menneskelig GzmB har en litt endret substrat anerkjennelse preferanse, som er diktert av så mange som 8-10 rester kartlegging rundt P1 aspartat 23. Dette var spesielt tydelig i studier som undersøkte spalting av pro-apoptotiske BH3-onlymolekyl Bud, som kan spaltes effektivt av mennesker, men langt mindre effektivt ved muse GzmB. I intakte celler, resulterer denne forskjellen i aktivering av forskjellige celledødsveier, med human GzmB opererer fortrinnsvis gjennom den mitokondrielle veien, og mus GzmB via direkte kaspase-aktivering. Analyse av tetrapeptid sekvenser avslørte at menneskelig, men ikke mus GzmB kunne holde seg etter sekvensen IEPD, som samsvarer med gjenkjenningssekvensen i både menneskelig og mus Bud 16. I både litteraturen og i kommersiell produktkataloger tetrapeptidet substrat, har Ac-IEPD-pNA blitt brukt generelt til å teste for GzmB aktivitet (tabell 1). Det er nå klart at mens både human og mus kan spalte Boc-AAD-S-Bzl, med svært lik effektivitet, svikter mus GzmB i NK-cellelysatene for å effektivt hydrolyserer Ac-IEPD-pNA (figur 2). I motsetning til dette å minske mengden av human NK YT lysat fra 30 ug til 10 ug fortsatt resulted i tilstrekkelig GzmB å hydrolysere Ac-IEPD-pNA-substrat (figur 3).

Figur 1
Fig. 1: Granulatenzymaktivitet i murine NK-celler granzyme B (øvre panel) og granzyme A (nedre panel) aktivitet i NK-cellelysatene fra B6 villtype og B6.GrzmB knockout-mus ble bestemt ved den maksimale hastighet på hydrolyse av Boc- Ala-Ala Asp-S-Bzl og N-α-CBZ-L-lysin-S-Bzl peptidsubstrater. Data viser en representativt eksperiment utføres i triplikat (n> 3).

Figur 2
Fig. 2: art-spesifikke hydrolyse av Ac-IEPD- pNA-substrat mus og humant GzmB hydrolysert Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl like, men bare human GzmB hydrolysert Ac-IEPD-pNA. Den menneskeligeNK-cellelinje YT og primær IL-2-aktiverte NK-mus ble anvendt som en kilde for GzmB. Søylediagram viser én representant eksperiment utført i tre eksemplarer (n> 3).

Figur 3
Fig. 3: Reduksjon i proteinkonsentrasjon ikke oppheve GzmB aktivitet Hydrolysehastigheten av Ac-IEPD-pNA indusert av human GzmB ble sammenlignet ved bruk av avtagende proteinkonsentrasjon på YT NK-cellelinje lysat. Eksperiment representant for n> 3.

Figur 4
Fig. 4: Grafisk fremstilling av analyseprinsipp GzmB spalter substratene Boc-AAD-S-Bzl (A) og Ac-IEPD-pNA (B) etter at P1 aspartat, som dermed frigjør enten et benzylmerkaptan, som i sin tur interagerer med DTNB å danne et fluorogent 3-karboksy-4-nitrofenoksyd ion (A), eller ved direkte å frigi p-nitroanilid, som er en kromofor selv (B). Kan påvises fluorescensemisjoner fra begge disse molekyler ved 405 nm.

Serin protease Substrat Aktivitet
Granzyme A N-α-CBZ-L-lysin (BLT) tiobenzyl ester (S-Bzl) Tryptase 22
Granzyme B 1. Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) -S-Bzl ASPase 14
2. N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilid (pNA)
Granzyme H Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl Chymase 23

Tabell 1:. Liste over substrater er tilgjengelige for påvisning av granzyme tryptase-aktivitet aktivitet av GzmA kan detekteres ved hydrolyse av den spesifikke N-α-CBZ-L-lysin (BLT) tiobenzyl ester (S-Bzl) . GzmB spesifikt spalter etter aspartat rester (Asp-ASE), som kan vurderes ved hydrolyse av enten Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) -S-Bzl (detekterer mus og human GzmB aktivitet), eller N-acetyl-Ile- Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilide (PNA) (registrerer bare menneskelig GzmB aktivitet). Chymase-aktivitet av GzmH bestemmes ved spalting av Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Historisk har granzymes ble identifisert som viktige effektor molekyler av cytotoksiske lymfocytter (CTL og NK-celler) som er i stand til å indusere en hurtig apoptotisk død i målceller. Dette skyldes i hovedsak virkningen av GzmB, som kløyvde mål substratmolekyler på aspartat (D) rester og dermed var i stand til å aktivere caspase kaskade av begge spalte pro-kaspaser, samt flere av sine nedstrøms mål. Imidlertid er det nå forstås at GzmB ekspresjon ikke er begrenset til lymfoide cytotoksiske celler, og dens funksjon kan utvides godt utover målcelle anerkjennelse og celledød.

I denne beskrivelsen beskriver vi en protokoll som muliggjør deteksjon av aktiv GzmB i cellelysater avledet fra både mus og humane CTL / NK-celler ved hjelp av en enkel kolorimetrisk analyse. Enkelhet og spesifisitet av denne analysen som konstatert ved disse funnene tillater anvendelsen av denne protokollen for å undersøke GzmB i cellulære prøver fra annen kildes. Det er imidlertid viktig at de cellulære lysater har en proteinkonsentrasjon på minst 2 mg / ml, og passende positive og negative kontroller er inkludert i den eksperimentelle protokollen. Spesifisiteten av Boc-AAD-SBzl reagens for GzmB fremgår av mangelen på substrat-spalting aktivitet i lysat avledet fra GzmB null dyr, som aktiviteten er helt tapt (figur 1). I eventuelle fremtidige studier anbefales det at en slik negativ kontroll (s. Protokoll avsnitt 1.1) brukes til å bekrefte at enhver aktivitet oppdages er spesifikk for GrzB. (Merk: Selv liker GrB, kaspaser har en absolutt spesifisitet for spalting ved aspartat rester i P1 stilling, foretrukne substrater er tetrapepetides der P4 aminosyren er også en kritisk faktor for spesifisitet. 24). Ved å undersøke rekombinant materiale det aktive setet serin til alanin mutant protease (inaktiv protease fremstilt på nøyaktig samme måte som den aktive enzym) bør være included, og dette er spesielt viktig dersom analysering av ikke-pattedyrcellelysatene, spesielt de fra gjær eller bakterieceller.

Ved hjelp av den ovennevnte protokoll for analyser av pattedyrceller, er GzmB aktivitet ikke redusert ved nærværet av endogene beslektede serin-protease-inhibitorer (Serpins), som kan være sterkt oppregulert i aktiverte cytotoksiske lymfocytter (CL) 25, så vel som i celler avledet fra ikke-immune vev, inkludert transformerte celler 26. Den cytosolisk serpinB9, (tidligere PI-9) er svært spesifikk for menneskelig GzmB; men i mus, er det flere tett men les bestemte orthologues hvorav serpin B9, eller SPI-6 har betydelig inhibitorisk aktivitet for mus GzmB 27. Selv lysis i NP-40 buffer kan være ettergivende for å generere en irreversibel interaksjon mellom GzmB og serpin, inkubering ved 37 ° C er nødvendig for optimal kompleksdannelse 28. Vi trenger ikke oppdage kompleks formasjon i the lysater ved Western blot, noe som ville resultere i tap av proteaseaktivitet. Denne protokollen ble utført ved vanlig omgivelseslaboratorietemperatur, opp til ~ 22 ° C.

Fra mer enn 20 års erfaring utfører disse analysene har vi funnet ut at det kommersielle kilden til Boc-AAD-SBzl reagens er av største betydning for å oppnå konsistente, følsomme og pålitelige resultater. Vi vil bare anbefale leverandøren vi har referert til, selv om andre kommersielle kilder er også egnet for de substrater som er nødvendige for å påvise aktiviteten av andre granzymes. Den protokoll som er beskrevet i denne artikkelen lett kan tilpasses for å bestemme proteaseaktivitet andre granulat serinproteaser ved hydrolyse av syntetiske peptidsubstrater med en passende gjenkjenningssekvens som er oppført i tabell 1. N-α-CBZ-L-lysin-S- Bzl substrat kan benyttes for å detektere tryptase-aktivitet av både GzmA i mus og human CL og teoretisk GzmK i mus CL. Selv GzmK mRNA uttrykket har blitt demonstrert av RT-PCR i drepeceller generert fra GzmAB genet knockout mus som svar på influensa peptider 29, er vi ikke klar over GzmK protease aktivitet har blitt rapportert i denne eller noen annen fysiologisk relevant sammenheng. Aktiviteten av enten rekombinant humant GzmH eller protease renset fra NK-celler, kan vurderes med Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl 30, men det er ikke mulig å tilskrive hydrolyse av dette substrat spesifikt til denne granzyme i cellelysater. Lymfocytter inneholde en rekke andre endolysosomal proteaser slik som katepsin, som også vil ha chymotrypsin-lignende (chymase) aktivitet. I mus, er GzmH genet erstattet av en klynge av gener (Gzms CF) alle antas å ha lignende (chymase) aktivitet.

Selv om menneskelig GzmB ble funnet å effektivt spalter BH3-bare pro-apoptotisk molekyl Bud, og dermed direkte engasjere mitokondriedødsveien 31, tilsynelatende motstridende resultater ble først oppnådd med musen GzmB. Denne forvirring ble løst ved elegante undersøkelser av en rekke forskere, som fastslått at den foretrukne substrat gjenkjennelsessekvens forskjellig mellom mus og menneske (og rotte) GzmB, til tross for den høye grad (~ 80%) av den totale sekvenshomologi av proteasene 16, 17,23. Den optimale gjenkjennelsessekvens for human GzmB er I / V, E / M / Q, P / Xaa (S / T) og D i P1-posisjonen, mens det for mus GzmB det er L / I / V, E, F / Y / Q, D 16,17. Den største forskjellen var i P2 posisjon, som P i særdeleshet ikke tåles av mus GzmB, derav mus Bud (IEPD 75) spaltingssete ikke ville kunne opptas av GzmB substratbindende kløft. Videre de syntetiske peptidsubstrater IEPD-PNA, rutinemessig beskrevet som spesifikke for GzmB, og IETD-PNA, er dårlig hydrolysert av mus GzmB. Vi har befestet funn gjort av andre 23 bruker recombinant granzymes at menneskelig GzmB, men ikke GzmB stede i mus NK og CTL hydrolysert IETD-pNA og IEPD-pNA. Kaiserman et al., 17 i forhold til spalting aktivitet av rekombinant, humant og mus GrB produsert i Pichia pastoris ved bruk av Boc-AAD-SBzl med Ac-IETD-pNA substrater. Tilsvarende forfatterne fant at mens begge enzymene spaltede Boc-AAD-SBzl med sammenlign effektivitet, hydrolyse av Ac-IETD-pNA av mus GrB var 30 ganger mindre effektiv. Mens T og P (så vel som S) i P2 posisjonen er foretrukket av human GzmB, er de ikke tolereres mus GzmB. Derimot, vi tydelig demonstrert sammenlign GzmB aktivitet både menneskelige og mus NK cellelysater ved hjelp av mer generisk Boc-AAD-SBzl reagens. Imidlertid kunne bare human GzmB aktivitet påvises med IEPD-pNA-reagens.

Sammen disse funnene markere det faktum at forskjellene i den fine spesifisitet GzmB av ulike arter kan ha stor innvirkning på hvordan du skal velgeet passende substrat for in vitro analyse. I sammendraget, hvis påvisning av mus, menneskelig eller rotte GzmB aktivitet er undersøkt, er Boc-AAD-SBzl underlaget av valget.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SMSB05 Granzyme B substrate (mouse and human)
Ac-IEPD-pNA  SM Biochemicals LLC, CA SMPNA009 Granzyme B substrate (only human)
N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl Sigma-Aldrich C3647 Granzyme A substrate
Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SB025 Granzyme H substrate
5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)  Sigma-Aldrich D8130 DTNB, Ellman’s Reagent
NK cell isolation kit II mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-096-892 negative selection kit
NK cell isolation kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-092-657 negative selection kit
Plate reader Biorad iMark Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3
Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate Corning, MA, USA 2797

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).
  2. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).
  3. Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. , (2009).
  4. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).
  5. Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).
  6. Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).
  7. Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).
  8. Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. , (2009).
  9. Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).
  10. Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).
  11. Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).
  12. Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).
  13. Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).
  14. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).
  15. Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).
  16. Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).
  17. Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).
  18. Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
  19. Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).
  20. Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).
  21. Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).
  22. Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).
  23. Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).
  24. Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).
  25. Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).
  26. Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).
  27. Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).
  28. Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
  29. Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).
  30. Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).
  31. Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).

Tags

Chemistry granzyme B serin protease peptid tioestere BOC-Ala-Ala-Asp-S-Bzl kolorimetrisk substrat hydrolyse asp-ase-aktivitet
En kolorimetrisk analyse som spesifikt Måler granzyme B Proteolytisk aktivitet: Hydrolyse av Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. More

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter