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Chemistry

比色测定的具体措施颗粒酶B蛋白水解活动:水解的Boc-丙氨酸 - 丙氨酸-ASP-S-BZL的

Published: November 28, 2014 doi: 10.3791/52419

Introduction

粒酶是一类在自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的1的分泌溶酶体发现丝氨酸蛋白酶。在人类中(A,B,H,K和M)存在五种不同的颗粒酶和10小鼠(A - G,K,M和N)2,3。颗粒酶A和颗粒酶B(GzmA,GZMB)是最丰富的,并已被广泛研究,在人类和啮齿类动物的设置。

GZMB经典功能是细胞凋亡的诱导在与孔形成蛋白穿孔,其允许粒酶访问目标细胞胞质溶胶4一起执行靶细胞。虽然GZMB表达在细胞毒性淋巴细胞明确发现,最近的研究已经解决了各种其他GZMB表达的细胞类型,包括但不限于角质细胞5,嗜碱性粒细胞6,肥大细胞7,浆细胞样树突细胞8,和B细胞9, 10。在这种情况下,非凋亡GZMB功能进行了揭示,从参与炎症过程,组织重塑和其他免疫调节性质11-14。

鉴于一个更广泛的生物作用已被提议用于GZMB比先前怀疑,研究人员需要针对其检测可靠和专用工具。的优点是GZMB的具体要求来切割上的天冬氨酸残基,一个属性之间的真核丝氨酸蛋白酶15独特的羧基侧。小鼠,人和大鼠GZMB在结构上非常相似,但是小鼠GZMB的扩展的底物特异性不同巧妙地从人类和鼠16,这意味着某些通用基板用Asp在终端(P1)可以通过GZMB有效切割的所有三个品种,而其他底材具有更复杂的序列上游P1可能会给广泛不同的结果。在过去和最近的立terature,这一事实造成了相当大的混乱和一些实验结果的生物学意义的曲解,即使严格控制的,动力学研究试图纠正这种情况17。

在本文中,我们已经设法示出了这些点使用两个市售底物,即的Boc - 丙氨酸 - 丙氨酸 - 天冬氨酸 - SBzl和N-乙酰基异亮氨酸 - 谷氨酸 - 亲天冬氨酸 - 对硝基苯胺。的两种试剂做产生不同的反应基团以下裂解(游离巯与荧光游离对硝基酰苯胺),但这种不具有任何对蛋白水解裂解的影响。所描述的协议是一个非常古老的协议,18现代适应,但应该帮助调查人员适当地使用不同的GZMB基板,同时也提供了一个方法框架,用于检测其他颗粒酶,如GzmA和GzmH的活动。

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Protocol

注:脾脏衍生自小鼠(6-10周龄),所有动物实验均根据彼得MacCallum肿瘤中心(E486)的动物伦理准则进行。

1.准备样品。

  1. 准备激活小鼠NK细胞。
    1. / - - (GZMB基因为null)小鼠通过阴性选择使用市售的试剂盒,从C57BL / 6或B6.GrzmB的脾脏的单细胞悬液分离主幼稚NK细胞。
    2. 按照制造商的协议。简要地说,磁标签“非NK”细胞如T和B细胞,树突状细胞,粒细胞,巨噬细胞,并使用生物素缀合的抗体针对其特定的表面标记的红血细胞。使用磁分离与抗生物素珠粒耗尽“非NK”细胞。
    3. 培养在24孔板中分离NK细胞5-7天以含IL-2(1000单位/毫升)的介质以700000个细胞/ ml的在37   ℃。
    4. 可替代地,使用活化的T细胞19,初级抗原限制性CTL从OT1 T细胞受体转基因小鼠20,CTL在混合的淋巴细胞培养物21,或从上清液活化NK细胞产生的,以确定分泌GZMB 19的活性。
  2. 维护人类NK细胞和初级NK细胞的隔离。
    1. 维持人NK细胞白血病(YT细胞)在补充有10%胎牛血清罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI)培养基。可替代地,净化从健康受试者的外周血主NK细胞和刺激2-3天在培养基含IL-2,在100单位/毫升,如前所述22。
  3. 代细胞裂解物。
    1. 在PBS(pH7.4)中洗涤细胞三次,然后悬浮于的Nonidet P-40的裂解缓冲液(0.1%NP-40,250 mM氯化钠,25毫摩尔的Hepes,2.5mM的EDTA)中。理想的是,溶解至少5×10 6个7个T细胞在100μl缓冲液中。不添加蛋白酶抑制剂,因为许多丝氨酸蛋白酶的不可逆抑制剂,特别tryptases如GzmA。在冰上孵育20分钟,然后沉淀核在微量离心以15000×g离心10分钟。弃去核沉淀,上清液转移到新的管中。
  4. 确定的裂解物的蛋白质浓度。
    1. 使用市售的选择,例如,布拉德福德或二喹啉酸(BCA)的协议,并确定蛋白浓度。确保该浓度是〜2毫克/毫升最小。商店裂解物在-20℃下直到需要(粒酶的活性是稳定许多个月,在-20℃)。

2.颗粒酶B活性分析

  1. 试剂的制备
    1. 在DMSO准备基板(BOC-AAD-S-BZL或AC-IEPD-PNA)的10毫米股票(〜5毫克/毫升),并存储在分装在-20&#176℃。准备工作稀释新鲜和丢弃的每一天后,中银-AAD-S-BZL部分水解的存储DMSO。
    2. 准备的比色试剂(5,5'-二硫 - 双(2-硝基苯甲酸),DTNB)在DMSO中的250mM的股票(0.09微克/毫升),并存储在-20℃。每天准备一个新的工作稀释。该试剂只需要用于与SBzl指示符组,不pNA的衬底。
    3. 弥补了新鲜的缓冲液(0.1M HEPES,0.05M的氯化镁2,pH值7.3),每2-3周。
  2. 带来DTNB和合成底物至室温。稀基板(1:16 1.6 ml缓冲液100微升)和DTNB(1:250, 10微升于2.5毫升缓冲)拌匀。
  3. 稀至少在缓冲各样品的100微克蛋白质裂解物,以160微升的最终体积。使用多通道移液器以一式三份加入50微升每孔(〜33.3微克/孔)在一个“”U“”底部乙烯基96孔板。有一个“缓冲 - 只有”控制(也一式三份)。
  4. 加入100微升稀释DTNB到样品/缓冲控制AC-IEPD-PNA工作时(省略这一步。
    注:AC-IEPD-PNA由GZMB的裂解直接释放荧光PNA( 图4B)。
  5. 使用多道移液器快速添加50微升稀释基材每组一式三份,先从缓冲区那么任何负面的控制,预计阳性标本整理。
  6. 将板在板读数器。测量在酶标仪在OD 405nm处为Boc - 丙氨酸 - 丙氨酸 - 天冬氨酸 - S-BZL / AC-IEPD-pNA的水解天冬氨酸酶的活性。使用动力学分析方案,以25的读数,每隔15秒(约6分钟的总阅读时间)。
  7. 使用在每个时间点所产生的吸光率读数手动计算底物裂解的速率,如果板读取器的软件不能生成的Vmax值。

大3.分析TA

注意:产生被表示为最大速度的数据,定义为OD的变化随时间(MOD /分钟)。

  1. 分析数据,确定衬底解理,它是从吸光度变化率计算出的最大速度。自动使用平板阅读器软件,它通常有这个选项做到这一点。
  2. 观看吸光度变化,这是在酶标仪动力学实验过程中产生的动能地块,手动后或者选择数据点,给出最陡峭的直线。对于大多数试验的最大速率是该测定的前2分钟内实现。
  3. 减去初始OD读数从最高的OD读数在此直线和除以时间间隔。传输原始数据到Microsoft Excel /图板进行统计分析和图形显示。

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Representative Results

将Boc-AAD-S- BZL基板特异于GZMB

丝氨酸蛋白酶GZMB是细胞毒性淋巴细胞(CTL和NK细胞)的主要成分,是主要负责诱导快速凋亡性死亡的靶细胞,如病毒感染或转化的细胞。这主要是由于它的底物优先用于某些特定的天冬氨酸残基中选择的蛋白质后裂解,属性与胱天,这也裂解天冬氨酸残基后,但是从一个不同的类蛋白酶,半胱氨酸蛋白酶家族15共享。在蛋白水解机制这种差异意味着AAD-SBzl不能由任何蛋白酶切割。 GZMB表达诱导活化后的细胞毒性淋巴细胞和酶活性可在从这些细胞( 图1)中制备的细胞裂解物进行监测的。颗粒酶基因敲除小鼠的可用性使我们能够确立合成肽底物的Boc - 丙氨酸 - 丙氨酸 - 天冬氨酸(AAD) - 苄硫基酯(S-BZL)具体地由GZMB水解。合成底物的鲁棒裂解可在从B6初级NK细胞的细胞裂解物进行测量,而不是在B6.GrzmB - / - NK细胞。作为对照,GzmA的蛋白水解活性,其具有胰蛋白酶样(类胰蛋白酶)的底物特异性,并且存在于两个裂解物是当量,如由N-α-CBZ-L-赖氨酸(BLT)的水解测定-S- BZL。

物种特异性GZMB底物识别序列

早期的研究描述由GZMB裂解可能的目标小区的分子引起了一些混乱,直到它出现了小鼠和人GZMB具有略微改变的底物识别的偏好,这是由多达8-10残基的P1的天冬氨酸23周围的映射决定。这一点尤其体现在研究,探讨的促凋亡BH3-只有乳沟分子投标,其可以通过鼠标GZMB有效切割由人类,但远不及有效。在完整细胞中,这种差异会导致不同的细胞死亡途径的激活,经由直接caspase激活人类GZMB通过线粒体途径操作优先,和鼠标GZMB。四肽序列的分析表明,人类,但尚未小鼠GZMB可以在序列IEPD,它匹配于人和小鼠出价16中的识别序列后切割。在这两个文献和市售产品编目四肽底物,AC-IEPD-pNA的已使用的一般测试对于GZMB活性( 表1)。现在很清楚,虽然人和小鼠可切割的Boc-AAD-S- BZL,具有非常相似的效率,鼠标GZMB在NK细胞裂解物不能有效水解AC-IEPD-pNA的( 图2)。与此相反,从30微克至10微克降低人NK YT溶解物的量仍resulteD在足够GZMB以水解AC-IEPD-pNA底物( 图3)。

图1
图1:颗粒的酶活性在小鼠NK细胞粒酶B(上图)和粒酶A(下面板)活性从B6野生型和B6.GrzmB敲除小鼠的NK细胞裂解物由制备Boc-水解的最大速率来确定丙氨酸 - 丙氨酸天冬氨酸-S-BZL和N-α-CBZ-L-赖氨酸的S-BZL肽底物。数据描绘一式三份(N> 3)执行的一个代表性的实验。

图2
图2:AC-IEPD- pNA底物小鼠和人类GZMB 物种特异性水解水解的Boc -丙氨酸-丙氨酸-天冬氨酸- S-BZL相等,但只有人类GZMB水解AC-IEPD-pNA的。人类NK细胞系YT和初级的IL-2活化的小鼠NK用作GZMB的来源。条形图显示一式三份(N> 3)一名代表实验。

图3
图3:减少蛋白质浓度不废除GZMB活性诱导人GZMB AC-IEPD-pNA的水解率用减少蛋白质YT NK细胞系裂解物的浓度进行了比较。实验代表N> 3。

图4
图4:的测定原理的图形描绘 GZMB劈开基板的Boc-AAD-S-BZL(A)和AC-IEPD-pNA的(B)中的P 1天冬氨酸后,由此释放或者是苄基硫醇,这又与相互作用ðTNB以形成荧光3-羧基-4-硝基苯酚离子(A)中 ,或通过直接释放对硝基苯胺,它是一种发色团本身(B)中 。可在405nm处被检测到这两种分子的荧光发射。

丝氨酸蛋白酶 基板 活动
颗粒酶一 N-α-CBZ-L-赖氨酸(BLT)苄硫基酯(S-BZL) 22类胰蛋白酶
颗粒酶B 1.将Boc-丙氨酸 - 丙氨酸 - 天冬氨酸(AAD)-S- BZL ASPase 14
2. N-乙酰基异亮氨酸 - 谷氨酸 - 亲天冬氨酸(IEPD) - 对 - 硝基苯胺(PNA)
颗粒酶ħ SUC-苯丙氨酸 - 亮氨酸 - 苯丙氨酸-S-BZL 糜蛋白酶23

表1:可以由特定N-α-CBZ-L-赖氨酸的水解(BLT)苄硫基酯来检测GzmA的可用于检测粒酶活性的底物的列表类胰蛋白酶活性(S-BZL) 。 GZMB具体地说天冬氨酸残基(天冬氨酸酶),它可以通过将Boc-丙氨酸 - 丙氨酸 - 天冬氨酸(AAD)的水解进行评估后裂解-S-BZL(检测鼠和人GZMB活性),或N-乙酰基 - Ile-谷氨酸-PRO-ASP(IEPD)-p硝基苯胺(PNA)(只检测人类GZMB活动)。 GzmH的食糜酶的活性是通过琥珀酰 - 苯丙氨酸 - 亮氨酸 - 苯丙氨酸-S-BZL裂解评估。

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Discussion

在历史上,粒酶被鉴定为细胞毒性淋巴细胞(CTL和NK细胞)能够诱导快速的凋亡性死亡的靶细胞的关键效应分子。这主要是由于GZMB的动作,这裂解靶底物分子在天门冬氨酸(D)残基,因而能由这两种裂解亲胱天蛋白酶激活的胱天蛋白酶级联,以及若干的其下游目标。然而,现在认识到,GZMB表达并不局限于淋巴细胞毒性细胞,其功能可被扩展远远超出靶细胞识别和细胞死亡。

在本文中,我们描述了一个协议,允许从小鼠和人CTL / NK细胞使用一个简单的比色法源性细胞裂解液活跃GZMB的检测。此法是确定这些发现让这种协议的应用研究GZMB来自其他来源的细胞样品中的简单性和特异性秒。但是,重要的是,在蜂窝裂解物具有至少为2mg / ml的蛋白浓度,并适当阳性和阴性对照包括在实验方案。经Boc-AAD-SBzl试剂GZMB的特异性是由从GZMB空动物来源的溶胞产物的缺乏基板切割活性的明显,因为活性完全丧失( 图1)。在任何未来的研究中,建议这样的阴性对照组(第协议第1.1节)被用来验证检测到任何活性是特异于GrzB。 (注意:虽然象的GrB,胱天蛋白酶具有天冬氨酸残基,在P1的位置的绝对特异性裂解,优选的底物是tetrapepetides其中P4的氨基酸也是特异性24的一个关键因素。)。如果检查的重组材料的活性位点丝氨酸为丙氨酸突变体的蛋白酶(在完全相同的方式作为活性酶制备非活性蛋白酶)应该是我ncluded,这就是,如果测定非哺乳动物细胞裂解物,特别是那些来自酵母或细菌细胞中尤其重要。

采用上述协议,用于哺乳动物细胞的测定法,GZMB活动不被内源性的同源丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制剂)的存在下,它可以是大大上调活化的细胞毒性淋巴细胞(CL)25,以及在衍生细胞减少从非免疫组织中,包括转化的细胞26。胞质SERPINB9,(以前的PI-9)是高度特异于人GZMB;然而,在小鼠中,有几个接近,但莱特定直向同源物,其中丝氨酸蛋白酶抑制剂的b9,或SPI-6具有鼠标GZMB 27显著抑制活性。尽管溶解在NP-40的缓冲液可以是许可用于产生在37℃下GZMB和丝氨酸蛋白酶抑制剂,孵育之间的不可逆的相互作用是必需的以获得最佳的复合物形成28。我们不检测复合物的形成在第Ë裂解物通过免疫印迹,这将导致蛋白酶活性的丧失。该协议是在典型的实验室环境温度,高达〜22℃。

从20年以上的表演这些测定的经验,我们已发现,将Boc-AAD-SBzl试剂的商业来源是至上重要性用于获得一致的,灵敏和可靠的结果。我们将只建议我们已经引用的供应商,虽然其它商业来源也适用于检测其它粒酶的活性所需的底物。在本文中描述的协议可以很容易地适于确定的其他颗粒丝氨酸蛋白酶的蛋白酶活性通过与适当的识别序列的合成肽底物的水解,如表1中所列的N-α-CBZ-L-赖氨酸-S- BZL衬底可以被用来检测这两个GzmA的类胰蛋白酶活性在小鼠和人CL和理论上GzmK小鼠CL。虽然GzmK mRNA的表达已经在从GzmAB基因敲除小鼠响应于流感肽29产生杀手细胞被证明通过RT-PCR,我们不知道GzmK蛋白酶活性已报道在这个或任何其他生理相关上下文。任一的重组人GzmH,或从NK细胞纯化的蛋白酶,活性可与评估SUC-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸- S-BZL 30,但它不可能归于该基板的水解特异性到此粒酶中细胞裂解液。淋巴细胞包含许多其它溶酶体蛋白酶如组织蛋白酶,这也将具有胰凝乳蛋白酶样(食糜酶)的活性。在小鼠中,GzmH基因被替换为基因(Gzms CF)所有预测具有相似(食糜)活性的集群。

虽然人类GZMB被发现有效切割BH3-只有促凋亡分子投标,从而直接参与线粒体死亡通路31,显然是相互矛盾的结果,最初用鼠标GZMB获得。这种混乱已经解决由优雅的研究由许多研究者,其判断小鼠和人(和大鼠)GZMB之间的优选底物识别序列不同,尽管蛋白酶16的整体序列同源性的高度(〜80%), 17,23。人类GZMB最优识别序列是I / V,E / M / Q,P /的Xaa(S / T)和D在P1的位置,而对于鼠标GZMB它为L / I / V,E,F / Y / Q,D 16,17。主要的区别是在位置P2,为P尤其不是由鼠标GZMB,因此鼠标(IEPD 75)的切割位点的耐受性不会因GZMB底物结合裂隙被容纳。此外,合成的肽底物的IEPD-pNA的,通常被描述为特异性针对GZMB,和IETD-pNA的,通过鼠标GZMB水解很差。我们已经进一步巩固了这一发现被他人使用23发重combinant粒酶,人类GZMB,但不是GZMB存在于小鼠NK细胞和CTL水解IETD-pNA的和IEPD-pNA的。 Kaiserman 等人 17比较重组人的切割活性和小鼠的GrB产生在毕赤酵母,使用的Boc-AAD-SBzl随Ac-IETD-pNA的衬底。类似地,作者发现,尽管切割的Boc-AAD-SBzl具有可比的效率,AC-IETD-pNA的通过鼠标的GrB水解两种酶是30倍的效率较低。虽然T和P(以及S)中的P2位置是由人类GZMB优选的,它们不耐受小鼠GZMB。与此相反,我们清楚地表明在使用更通用的Boc-AAD-SBzl试剂人和小鼠NK细胞裂解物可比GZMB活性。然而,只有人类GZMB活动可以与IEPD-PNA试剂检测。

总之,这些研究结果强调一个事实,即不同物种的GZMB的精细特异性的差异对如何选择产生重大影响合适的底物用于体外分析。总之,如果检测小鼠,人或鼠GZMB活性进行了研究,将Boc-AAD-SBzl是选择的衬底。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SMSB05 Granzyme B substrate (mouse and human)
Ac-IEPD-pNA  SM Biochemicals LLC, CA SMPNA009 Granzyme B substrate (only human)
N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl Sigma-Aldrich C3647 Granzyme A substrate
Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SB025 Granzyme H substrate
5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)  Sigma-Aldrich D8130 DTNB, Ellman’s Reagent
NK cell isolation kit II mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-096-892 negative selection kit
NK cell isolation kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-092-657 negative selection kit
Plate reader Biorad iMark Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3
Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate Corning, MA, USA 2797

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References

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化学,第93,颗粒酶B,丝氨酸蛋白酶,肽硫酯,BOC-丙氨酸 - 丙氨酸-ASP-S-BZL,显色底物,水解,ASP酶的活性
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