Introduction
グランザイムは、ナチュラルキラー（NK）細胞および細胞傷害性Tリンパ球（CTL）1の分泌リソソームに見出されるセリンプロテアーゼのファミリーである。五つの異なるグランザイムは、ヒト（A、B、H、KとM）で存在し、そしてマウスにおける10（A - G、K、M及びN）2,3。グランザイムAおよびグランザイムB（GZMA、GZMB）が最も豊富であり、広範囲に人間と齧歯類の設定で研究されてきた。
GZMBの古典的な機能は、標的細胞の細胞質ゾル4にアクセスするためのグランザイムを可能にする孔形成タンパク質、パーフォリンと組み合わせて実行される、標的細胞におけるアポトーシスの誘導である。 GZMB発現が明確に細胞傷害性リンパ球において見出されているが、最近の研究では、好塩基球6、肥満細胞7、形質細胞様樹状細胞8、およびB細胞9を含むが、ケラチノサイト5に限定されるものではなく、他のGZMBを発現する種々の細胞型に対処されてきた、 10。この文脈では、非アポトーシスGZMB機能は炎症プロセス、組織リモデリングおよび他の免疫調節特性11-14の参加の範囲が明らかになった。
より広範な生物学的役割は、以前に疑われるよりもGZMBのために提案されていることを考えると、研究者は、その検出のための信頼性の高い、特定のツールが必要です。有利なのアスパラギン残基のカルボキシル側で切断するGZMBの特定の要件、真核生物のセリンプロテアーゼ15の中でユニークな特性である。マウス、ヒトおよびラットGZMBしかしマウスGZMBの拡張された基質特異性端子（P1）のAspを有する特定のジェネリック基質は、GZMBによって効率的に切断することができることを意味し、ヒトおよびラット16の両方とは微妙に異なるが、構造的に非常に類似しているすべての3種から、上流のP1のより複雑な配列をもつ他の基材に対し、広く多様な結果を与える可能性があります。過去と最近の李両方でterature、この事実は、注意深く制御、動態試験状況17を修正しようとしているにもかかわらず、いくつかの実験結果の生物学的意義のかなりの混乱や誤解を引き起こした。
本論文では、2つの市販の基板、すなわちのBoc-ALA-ALA-Aspを-SBzlとN-アセチルイルのGlu-Proの-ASP-p-ニトロアニリドを使用して、これらのポイントを説明しようとしてきた。 2つの試薬は、切断（蛍光無料パラニトロアニ対遊離スルフヒドリル）以下の異なる反応基を生成行いますが、これはタンパク質分解的切断には影響何もありません。記載されているプロトコルは、非常に古いプロトコル18の近代的な適応ですが、また、そのようなGZMAやGzmHなど他グランザイム、の活性を検出するための方法論的な枠組みを提供しながら、研究者は、適切に異なるGZMB基板を使用するように助けるべきである。
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Protocol
注：脾臓をマウス（6〜10週齢）に由来し、すべての動物実験は、ピーター·マッカラム癌センター（E486）の動物倫理ガイドラインに従って行った。
サンプルの調製。
- 活性化したマウスNK細胞の調製。
- 市販のキットを用いたネガティブ選択により（GZMB遺伝子ヌル）マウス- / - C57BL / 6またはB6.GrzmBの脾臓の単一細胞懸濁液からの一次ナイーブなNK細胞を単離する。
- メーカーのプロトコルに従ってください。簡単に説明すると、磁気的TおよびB細胞、樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、およびそれらの特定の表面マーカーに対するビオチン標識抗体を用いて赤血球などの「非NK」細胞を標識する。 「非NK」細胞を枯渇させる抗ビオチンビーズと磁気分離を使用してください。
- 培養物を24ウェルプレートに70万細胞/ mlのIL-2（1,000 U / ml）を含む培地中で5~7日間、NK細胞を単離する37時 °C。
- あるいは、使用は19 T細胞、OT1 T細胞受容体トランスジェニックマウス20からの一次抗原制限CTLは、CTL分泌GZMB 19の活性を決定するために、活性化NK細胞からの混合リンパ球培養21、または上清中に生成された活性化した。
- ヒトNK細胞株および一次NK細胞の単離の維持。
- 10％ウシ胎児血清を補充したロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地中のヒトNK白血病（YT細胞）を維持する。代替的に、健康な被験者の末梢血から一次NK細胞を精製し、以前に22を説明したように100 U / mlのIL-2を含む培地中で2~3日間刺激する。
- 細胞溶解物を生成する。
- PBS（pH7.4）中で細胞を3回洗浄し、次いで、ノニデットP-40溶解緩衝液に懸濁（0.1％NP-40、250のNaCl、25mMのヘペス、2.5mMのEDTA）。理想的には、5×10 6の最小値を溶解7 T細胞>アップ。多くはセリンプロテアーゼの不可逆的阻害剤であるように、プロテアーゼ阻害剤を追加して、そのようなGZMAなどの特定のトリプターゼでしないでください。 20分間氷上でインキュベートし、次いで10分間15000×gで微量で核をペレット化。核ペレットを廃棄し、新しいチューブに上清を移す。
- 溶解物のタンパク質濃度を決定します。
- そのようなブラッドフォードやビシンコニン酸（BCA）、などの選択肢の市販のプロトコルを使用して、タンパク質濃度を決定する。濃度が〜2 mg / mlの最小であることを確認してください。必要になるまで-20℃で保存溶解物（グランザイム活動は-20℃で何ヶ月も安定している）。
2.グランザイムB活性アッセイ
- 試薬の調製
- -20＆＃でアリコートに10 mMのDMSO（〜5 mg / mlの）における基板の株式（のBoc-AAD-S-BzlのまたはAC-IEPD-PNA）とストアを準備する176; C。たての作業希釈液を調製及びBoc-AAD-S-Bzlのは、部分的に、DMSO中のストレージに加水分解するとして、それぞれの日の後に捨てる。
- -20℃で250 mMのDMSO中の比色試薬（5,5'-ジチオ - ビス（2-ニトロ安息香酸）、DTNB）の株式（0.09グラム/ ml）およびストアを準備します。毎日新鮮な作業希釈を準備します。この試薬は、のみSBzlインジケータグループ、しないのpNAを有する基板に必要です。
- 新鮮な緩衝液（0.1M HEPES、0.05 MのMgCl 2、pH7.3）で2〜3週間毎を構成している。
- 室温にDTNBと合成基質を持参してください。基質（1：16、 例えばバッファの1.6ミリリットルで100μl）を希釈し、DTNB（1：250、 例えば 2.5ミリリットルバッファ内の10μl）を、よく混ぜる。
- 160μlの最終容量までバッファ内の各サンプルの100μgのタンパク質溶解物の最低希釈する。マルチチャンネルピペットを使用すると、 '' U ''底のビニール96ウェルプレートに（〜33.3 /ウェル）三重にウェルあたり50μlを添加する。（また、三重で）「バッファ専用」コントロールを含めます。
- のAc-IEPD-PNAを扱う際のサンプル/バッファ制御に希釈しDTNB100μlのを追加します（この手順を省略します。
注：GZMBにより交流-IEPD-pNAの切断は、直接蛍光性PNA（ 図4B）をリリースします。 - その後緩衝液を用いて任意の負の制御を開始し、期待陽性サンプルを終え、すぐに三重の各セットに希釈した基質50μlのを追加するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。
- プレートリーダーでプレートを置きます。 OD 405 nmでマイクロプレートリーダーでのBoc-ALA-ALA-Aspを-S-Bzlの/ AC-IEPD-pNAの加水分解によるのAspアーゼ活性を測定する。 25の測定値、15秒毎（約6分の合計読み取り時間）を取る、運動アッセイプロトコルを使用してください。
- プレートリーダーのソフトウェアがVmaxの値を生成できない場合、手動で基質切断の速度を計算するために、各時点で生成された吸光度測定値を使用する。
ダ3.分析TA
注：生成されたデータは、時間（MOD /分）を超えるODの変化として定義された最大速度として提示される。
- データを分析するために、吸光度の変化率から計算される基質切断の最大速度を決定する。通常は、このオプションを持って、プレートリーダーソフトウェアを使用して、これを自動的に行う。
- 代わりに手動で、プレートリーダー上で動的アッセイ中に生成される吸光度の変化の速度論的プロットを、表示した後に最も急な直線を与えるデータポイントを選択します。ほとんどのアッセイの最大レートは、アッセイの最初の2分以内に達成される。
- 時間間隔によって、この直線と除算で最高OD読み取りから初期ODの読みを引く。統計分析およびグラフィック表示のためのMicrosoft Excel /グラフパッドに生データを転送します。
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Representative Results
のBoc-AAD-S-Bzlの基板は、GZMBに特異的である
セリンプロテアーゼGZMBは細胞傷害性リンパ球（CTLおよびNK細胞）の主成分であり、そのようなウイルス感染または形質転換細胞などの標的細胞に迅速なアポトーシス死を誘導するのに主に責任がある。これはまた、アスパラギン残基の後に切断するが、プロテアーゼの異なるクラス、システインプロテアーゼファミリー15から選択されたタンパク質中の特定のアスパラギン残基後に切断のための基質優先、カスパーゼと共有属性、によるところが大きい。タンパク質分解機構の違いは、AAD-SBzl任意カスパーゼによって切断されないことを意味する。 GZMB発現が誘導される細胞傷害性リンパ球の酵素活性の活性化の後、これらの細胞（ 図1）から調製した細胞溶解物においてモニターすることができる。グランザイム遺伝子ノックアウトマウスの利用可能性は、私たちはそれを確立することができました合成ペプチド基質のBoc-ALA-ALA-Aspを（AAD） - チオベンジルエステル（S-Bzlの）は、具体的GZMBによって加水分解される。合成基質の強固な切断はなくB6.GrzmBで、B6主要NK細胞からの細胞溶解物中で測定することができる- / - NK細胞は。コントロールとして、トリプシン様（トリプターゼ）を有するGZMAの、タンパク質分解活性、基質特異性及びN-α-CBZ-L-リジン（BLT）-S-の加水分解によって測定されるように、同等の両方の溶解物中に存在しているBZL。
種特異GZMB基質認識配列
それは、マウスおよびヒトGZMBがP1アスパラギン酸23を囲むマッピング残基などの多く8-10ようによって決定され、わずかに改変された基質認識嗜好を持つことが明らかにされるまでGZMBによって開裂可能な標的細胞分子を記述する初期の研究は、いくつかの混乱を引き起こした。これはプロアポトーシスBH3のみの切断を調べた研究で特に明らかであったマウスGZMBによってはるかに少ない効率的に人間によって効率的に切断することができるが、分子入札、。無傷の細胞では、この差は、直接カスパーゼ活性化を介してヒトのミトコンドリア経路を介して優先的に動作させるGZMB、マウスGZMBで、異なる細胞死経路の活性化をもたらす。テトラペプチド配列の分析は、人間ではなく、マウスGZMBはヒトとマウスの入札16の両方で認識配列に一致するシーケンスIEPD、後に切断できることを明らかにした。文学や市販製品の両方がテトラペプチド基質をカタログには、AC-IEPD-PNAはGZMB活性（ 表1）をテストするために一般的に使用されてきた。これは、ヒトおよびマウスの両方が非常に類似した効率でのBoc-AAD-S-Bzlのを切断することができる一方で、NK細胞溶解物中のマウスGZMBを効率的に加水分解のAc-IEPD-pNAを（ 図2）に失敗したことが明らかである。対照的に、30から10μgのヒトNK YT溶解物の量を減少させるまだresulteのAc-IEPD-pNAを基質を加水分解するのに十分なGZMB中のd（ 図3）。
図1：B6野生型とB6.GrzmBノックアウトマウス由来のNK細胞溶解物におけるマウスNK細胞での顆粒の酵素活性グランザイムB（上パネル）およびグランザイムA（下のパネル）の活性はのBoc-の加水分解の最大速度によって決定されたのAla-AlaでのAsp-S-BzlのおよびN-α-CBZ-L-リジン-S-Bzlのペプチド基質。データは、トリプリケート（nは> 3）で実行される1つの代表的な実験を示す。
図2：交流- IEPD-のpNA基質マウスおよびヒトGZMB の種特異的加水分解が均等にのBoc-ALA-ALA-Aspを-S-Bzlのを加水分解しますが、人間だけGZMBは、AC IEPD-PNAを加水分解した。人間NK細胞株YTプライマリIL-2活性化したマウスNKはGZMBの供給源として使用した。棒グラフ（nは> 3）三連で実行される1つの代表的実験を示す。
図3：GZMB活性を阻害しなかったタンパク質濃度の減少は、人間GZMBによって誘導されるのAc-IEPD-pNAの加水分解速度は、YT NK細胞株溶解物の減少タンパク質濃度を用いて比較した。 N> 3のための実験の代表。
図4：アッセイ原理のグラフィカルな描写 GZMBを切断基質のBoc-AAD-S-Bzlの（A）とのAc-IEPD-PNA（B）P1アスパラギン酸の後に、それによって今度はと相互作用ベンジルメルカプタン、どちらを解放する。 DTNB蛍光3-カルボキシ-4-ニトロフェノキシドイオン（A）を形成する、または直接発色団自体（B）のp-ニトロアニリドを放出することができる。両方のこれらの分子の蛍光発光を405nmで検出することができる。
| セリンプロテアーゼ | 基板 | アクティビティ |
| グランザイムA | N-α-CBZ-L-リジン（BLT）チオベンジルエステル（S-Bzlの） | トリプターゼ22 |
| グランザイムB | 1.のBoc-ALA-ALA-Aspを（AAD）が-S-Bzlのを | ASPase 14 |
| 2. N-アセチルイルのGlu-Proの-ASP（IEPD）-pニトロアニリド（PNA） | ||
| グランザイムH | のSuc-Pheを-Leuの-Pheを-S-Bzlの | キマーゼ23 |
表1：グランザイム活性の検出に利用可能な基質のリスト GZMAのトリプターゼ活性はチオベンジルエステル（S-Bzlの）特定のN-α-CBZ-L-リジン（BLT）の加水分解によって検出することができる。のBoc-Alaを-Alaを-Aspを（AAD）は（マウスおよびヒトGZMB活性を検出する）、Bzlの-S、またはN-アセチル - Ile-いずれかを加水分解することにより評価することができるアスパラギン残基（アスパラギンアーゼ）、後GZMBを特異的に切断するのGlu-Proの-ASP（IEPD）-pニトロアニリド（PNA）は（人間だけGZMBアクティビティを検出）。 GzmHのキマーゼ活性があるSuc-Pheを-LEU-Pheの-S-Bzlのの切断によって評価される。
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Discussion
歴史的にグランザイムは、標的細胞の急速なアポトーシス死を誘導することができる細胞傷害性リンパ球（CTLおよびNK細胞）の重要なエフェクター分子として同定された。これは主に、アスパラギン酸（D）残基で標的基質分子を切断し、したがって両方の切断プロカスパーゼによってカスパーゼカスケードを活性化することができるだけでなく、それらの下流の標的のいくつかあったGZMBの作用によるものであった。しかし、現在GZMB発現はリンパ細胞傷害性細胞に限定されず、その機能が十分に標的細胞認識および細胞死を超えて拡張できることを理解されたい。
本論文では、つの単純な比色アッセイを用いてマウスおよびヒトCTL / NK細胞の両方に由来する細胞溶解物中のアクティブなGZMBの検出を可能にするプロトコルを記述します。これらの知見によって確認されるように、このアッセイの単純さと特異性は、このプロトコルのアプリケーションが他のソースからの細胞試料にGZMBを調べることができるようにS。しかし、それは細胞溶解物は、少なくとも2mgの/ mlのタンパク質濃度を有し、適切な陽性および陰性対照を実験プロトコルに含まれていることが重要である。アクティビティが（ 図1）完全に失われるようGZMBためのBoc-AAD-SBzl試薬の特異性は、GZMBヌル動物由来の溶解物中の基質切断活性の欠如から明らかである。今後の研究では、このようなネガティブコントロール（S。プロトコルセクション1.1）が検出された活動がGrzBに特異的であることを確認するために使用されることをお勧めします。 （注：のGrBのように、カスパーゼは、P1位置におけるアスパラギン残基での切断のための絶対的な特異性を持っているが、好ましい基質は、P4のアミノ酸はまた、特異24の重要な決定要因であるtetrapepetidesである。）。組換え材料のアラニン変異体プロテアーゼ活性部位セリンを調べる場合（不活性プロテアーゼが活性酵素と全く同じ方法で調製した）のiであるべきであるncluded、および非哺乳動物細胞溶解物、酵母または細菌細胞から、特にそれらをアッセイする場合、これは特に重要である。
哺乳動物細胞アッセイのために上記のプロトコルを使用して、GZMB活性をアップレギュレート活性化細胞傷害性リンパ球（CL）25、並びに由来の細胞で大きくすることができる内因性コグネイトセリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）の存在によって減少しない形質転換された細胞26を含む非免疫組織から。細胞質ゾルserpinB9、（以前PI-9）は、ヒトGZMBための高度に特異的である。しかし、マウスでは、セルピンのb9、またはSPI-6は、マウスGZMB 27のための有意な阻害活性を有するいくつかのレ近いが特定のオルソログがある。 NP-40バッファーで溶解がGZMBとセルピン間の不可逆的な相互作用を発生させるための許容することができますが、37℃でのインキュベーションは、最適な複合体形成28のために必要とされる。私たちは、目の中に複合体形成を検出しないプロテアーゼ活性の喪失をもたらすウェスタンブロットによる電子溶解物。このプロトコルは、22°C〜まで、典型的な周囲実験室温度で行われる。
これらのアッセイを行う20年以上の経験から、我々はのBoc- AAD-SBzl試薬の商業的供給源は、一貫性のある高感度かつ信頼性の高い結果を得るためにupmost重要であることを見出した。他の市販の供給源は、他のグランザイムの活性を検出するのに必要な基材に適していますが、私たちは、私たちが参照したサプライヤーをお勧めします。この論文に記載されたプロトコルを容易に、表1に記載されているように、適切な認識配列を有する合成ペプチド基質の加水分解により、他の顆粒セリンプロテアーゼのプロテアーゼ活性を決定するために適合させることができる。N-α-CBZ-L-リジン-S- Bzlの基板は、CLマウスにおけるマウスおよびヒトCL理論的GzmKの両方GZMAのトリプターゼ活性を検出するために使用することができ。 GzmK mRNA発現は、インフルエンザペプチドに応答して29 GzmAB遺伝子ノックアウトマウスから生成されたキラー細胞においてRT-PCRによって実証されてきたが、我々はこのまたは任意の他の生理学的に関連する文脈で報告されたGzmKプロテアーゼ活性を認識していない。組換えヒトGzmH、またはNK細胞から精製されたプロテアーゼのいずれかの活性を評価することができるのSuc-Pheを-Leuの-Pheを-S-Bzlの30が 、しかし、それは特にこのグランザイムにおいて、この基質の加水分解を帰することはできない細胞溶解物。リンパ球はそのようなこともキモトリプシン様（キマーゼ）活性を持つことになりますカテプシン、などの他のエンドリソソームプロテアーゼの数が含まれている。マウスでは、GzmH遺伝子は遺伝子のクラスター（Gzms CF）によって置換され、すべての類似した（キマーゼ）活性を有すると予測される。
人間GZMBを効果的にBH3のみアポトーシス促進性分子入札を切断、したがって、直接ミトコンドリアに係合することが見出されたが、死経路31は 、明らかに矛盾する結果は、最初にマウスGZMBが得られた。この混乱は、プロテアーゼ16の全体的な配列相同性の高い（〜80％）にも関わらず、好ましい基質認識配列は、マウスおよびヒト（およびラット）GZMB間で異なっていると判断多くの研究者によってエレガントな研究によって解決した17,23。マウスGZMBことはL / I / V、Eであるのに対し、ヒトGZMBための最適認識配列/ F / Y、P1位にE / M / Q、P / Xaaは（S / T）とD、I / VであるQ、D 16,17。特に、Pは、GZMB基質結合溝に収容されないマウスGZMB、従ってマウス入札（IEPD 75）切断部位によって許容されないように大きな違いは、P2位置であった。さらに、合成ペプチド基質日常GZMBための具体的なとして記述IEPD-PNA、およびIETD-PNAは、不十分マウスGZMBによって加水分解される。私たちは、さらに再使用して他の人23による発見を統合していますcombinantは人間GZMBが、マウスNKおよびCTL加水分解IETD-PNAとIEPD-PNAに存在GZMBしないことをグランザイム。 Kaiserman ら17のAc-IETD-pNAを基質とのBoc-AAD-SBzlを用いて、ピキア·パストリスで産生された組換えヒトおよびマウスのGrBの切断活性を比較した。同様に、著者らは両酵素ながら同等の効率でのBoc-AAD-SBzlを切断されたことを発見し、マウスのGrBにより交流-IETD-pNAの加水分解は、30倍以下で効率的であった。 P2位置でのTおよびP（並びにS）は、人間のGZMBによって好まれる一方で、それらはマウスGZMB許容されない。対照的に、我々は明らかに、より一般的なのBoc-AAD-SBzl試薬を用いて、ヒトおよびマウスのNK細胞溶解物の両方に匹敵するGZMB活性を示した。しかし、人間だけGZMB活性IEPD-pNAの試薬を用いて検出することができた。
まとめると、これらの知見は、異なる種のGZMBの優れた特異性の違いが選択する方法に大きな影響を持つことができることを強調インビトロ分析のための適切な基質。マウス、ヒトまたはラットGZMB活性の検出が検討されている場合要するに、のBoc-AAD-SBzlは、選択の基板である。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SMSB05 | Granzyme B substrate (mouse and human) |
| Ac-IEPD-pNA | SM Biochemicals LLC, CA | SMPNA009 | Granzyme B substrate (only human) |
| N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl | Sigma-Aldrich | C3647 | Granzyme A substrate |
| Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SB025 | Granzyme H substrate |
| 5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Sigma-Aldrich | D8130 | DTNB, Ellman’s Reagent |
| NK cell isolation kit II mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-892 | negative selection kit |
| NK cell isolation kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-657 | negative selection kit |
| Plate reader | Biorad iMark | Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3 | |
| Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate | Corning, MA, USA | 2797 |
References
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