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Chemistry

BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL의 가수 분해 : 색채 특히 그랜 자임 B 단백질 분해 활동를 측정 분석

doi: 10.3791/52419 Published: November 28, 2014

Introduction

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Granzymes 자연 킬러 (NK) 세포 및 세포 독성 T 림프구 (CTL) (1)의 분비 리소좀에서 발견되는 세린 프로테아제 패밀리이다. 다섯 가지 granzymes 인간 (A, B, H, K 및 M)에 존재하고, 마우스에서 십 (A - G, K, M 및 N) 2,3-. 그랜 자임과 그랜 자임 B (GzmA, GzmB)는 가장 풍부하고 광범위하게 인간과 설치류 설정에서 조사되었다.

GzmB의 고전 함수는 표적 세포 사이토 졸로 액세스 4 그랜 자임을 허용 기공 형성 단백질 퍼포과 함께 실행되는 표적 세포에서 아폽토시스의 유도이다. GzmB 발현 명백하게 세포 상해 성 림프구에서 발견되지만, 최근의 연구는 호염기구 (6), 비만 세포 (7) 형질 수지상 세포 (8) 및 B 세포 (9)를 포함하지만, 케 라티노 사이트 (5)에 한정되지 않고, 다른 GzmB 발현 세포 유형의 다양한 어드레싱되었습니다 10.이러한 맥락에서, 비 세포 사멸 GzmB 기능은 염증 과정, 조직 리모델링과 다른 면역 특성 11-14 참여에 이르기까지 드러났다.

폭 넓은 생물학적 역할이 이전에 의심보다 GzmB 제안 된 것을 감안할 때, 연구자는 검출 신뢰성과 특정 도구가 필요합니다. 이점 진핵 세린 프로테아제 (15) 사이에서 고유 아스파르트 산 잔기, 속성의 카복실 측 쪼개지 GzmB의 특정 요구 사항이다. 마우스는 인간과 쥐 GzmB 그러나 마우스 GzmB의 확장 기질 특이성 터미널 (P1)에서의 ASP와 특정 일반 기판 GzmB 효율적으로 절단 할 수 있음을 의미 모두 인간과 쥐 16과는 미묘하게 다른, 구조적으로 매우 유사 세 종, 상류 P1의 더 복잡한 시퀀스와 다른 기판 반면 널리 변수 결과를 제공 할 수 있습니다. 과거 최신 리튬 둘terature,이 사실은주의 깊게 통제에도 불구하고, 상당한 혼란과 일부 실험 결과의 생물학적 의미의 오해가 발생했습니다, 운동 연구는 상황 (17)를 해결하기 위해 노력했다.

이 논문에서 우리는 두 가지 상업적으로 이용 가능한 기판, 즉 BOC-알라 - 알라 -의 ASP SBzl 및 N- 아세틸 일드 서열 1 프로의 ASP-P-니트로 아닐리드를 사용하여 이러한 점을 설명하기 위해 노력했다. 이 시약은 분열 (형광 무료 paranitroanilide 대 무료 sulphydryl) 다음과 같은 서로 다른 반응 그룹을 생성 할 수 있지만,이 단백질 분해 분열에 영향 무엇이든이 없습니다. 기술 된 프로토콜은 매우 오래 프로토콜 (18)의 현대 적응이지만 또한 GzmA 및 GzmH 다른 granzymes의 활성을 검출하기위한 방법 론적 틀을 제공하면서 조사관, 적절히 다른 GzmB 기판을 사용하는 것이 도움이 될 것이다.

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Protocol

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참고 : 마우스에서 파생 된 비장 (나이 6-10 주) 모든 동물 실험은 피터 맥 칼럼 암 센터 (E486)의 동물 윤리 지침에 따라 수행 하였다.

샘플 1. 준비.

  1. 활성화 마우스 NK 세포의 준비.
    1. 시판되는 키트를 사용하여 음성 선별에 의해 (GzmB 유전자 NULL) 마우스 - / - C57BL / 6 또는 B6.GrzmB의 비장의 단일 세포 현탁액으로부터 기본 나이브 NK 세포를 분리.
    2. 제조 업체의 프로토콜을 따르십시오. 요약하면, 이러한 자기 T 및 B 세포, 수지상 세포, 과립구, 대 식세포, 및 특정 표면 마커에 대해 바이오틴 - 컨쥬 게이트 항체를 사용하여 적혈구 세포와 같은 "비 - NK"세포를 라벨. "비 NK"세포를 고갈 방지 비오틴 구슬 자기 분리를 사용합니다.
    3. 배양은 24 웰 플레이트에서 700,000 세포 / ml에서 IL-2 (1000 U / ㎖)를 함유하는 미디어 5-7 일간 NK 세포를 격리37   ° C.
    4. 대안 적 사용은 19 T 세포, OT1 T 세포 수용체 트랜스 제닉 마우스 (20)로부터 기본 항원 제한된 CTL이 CTL 분비 GzmB (19)의 행동을 결정하기 위하여 활성화 된 NK 세포로부터 혼합 림프구 배양 물 (21), 또는 상층 액에 생성 된 활성화.
  2. 인간 NK 세포주 및 일차 NK 세포의 분리의 유지.
    1. 10 % 우태 혈청으로 보충 된 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 배지에서 인간 NK 백혈병 (YT 세포)를 유지한다. 또한, 정상인의 말초 혈액에서 차 NK 세포를 정화하고 이전 22 설명 된 바와 같이 IL-2 100 U / ml의에서이 함유 배지 2 ~ 3 일 동안 자극한다.
  3. 세포 용 해물의 생성.
    1. PBS (PH 7.4)에 세포를 세 번 세척 한 후 Nonidet P-40 용해 버퍼에 일시 중단 (0.1 % NP-40, 250 mM의 염화나트륨, 25 mM의 헤 페스, 2.5 mM의 EDTA). 이상적으로는, 5 × 106의 최소 용해 7 T 세포>까지. 프로테아제 억제제를 추가하지 마십시오, 많은는 GzmA 취소 할 수없는 세린 프로테아제 억제제, 특히 tryptases에 있습니다. 얼음에서 20 분 동안 인큐베이션 한 후 10 분간 15,000 XG에 미세 원심에서 핵 펠렛. 핵 펠렛을 취소하고 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
  4. 해물의 단백질 농도를 결정합니다.
    1. 이러한 브래드 bicinchoninic 또는 산 (BCA)과 같은 선택의 시판 프로토콜을 사용하여 단백질 농도를 결정한다. 농도가 1 ~ 2 ㎎ / ㎖ 최소 있는지 확인하십시오. 필요한 때까지 -20 ° C에서 보관 용 해물 (그랜 자임 활동은 -20 ° C에서 몇 달 동안 안정).

2. 그랜 자임 B 활동 분석

  1. 시약의 조제
    1. DMSO에 기판 (BOC-AAD-S-BZL 또는 AC-IEPD-pNA를)의 10 mM의 주식을 준비합니다 (~ 5 ㎎ / ㎖) -20 & #에서 분취에 저장176; C. 갓 작업 희석을 준비하고 BOC-AAD-S-BZL 부분적으로 DMSO에 저장에 가수 분해로, 하루 후 폐기합니다.
    2. -20 ° C에서 250 밀리미터의 DMSO 비색 시약 (5,5'- 디티 오 - 비스 (2- 니트로 벤조산), DTNB)의 재고 (0.09 g / mL) 및 저장소를 준비한다. 매일 신선한 작업 희석을 준비합니다. 이 시약은 SBzl 표시가 아닌 그룹 pNA를 가진 기판이 필요합니다.
    3. 신선한 버퍼 (0.1M HEPES, 0.05 M의 MgCl 2, pH를 7.3) 2 ~ 3 주까지합니다.
  2. 실온으로 DTNB 및 합성 기판을 준비한다. 희석 기판 (1시 16분, 예를 들어 1.6 버퍼 용액에 100 μL)과 DTNB (1 : 250, 예를 들어 10 2.5 ml의 버퍼의 μL) 잘 섞는다.
  3. 160 μL의 최종 부피 버퍼에 각 시료 100 μg의 단백질 용 해물의 최소 희석. 멀티 채널 피펫을 사용하여 ''U ''바닥 비닐 96 웰 플레이트 (~ 33.3 ㎍ / 웰) 세중 잘 당 50 μl를 추가합니다."버퍼 전용"제어를 포함 (또한 세중).
  4. AC-IEPD-pNA를 사용하여 작업 할 때 샘플 / 버퍼 제어로 희석 DTNB 100 μl를 추가합니다 (이 단계를 생략합니다.
    참고 : GzmB에 의해 AC-IEPD-pNA를의 쪼개짐 직접 형광 pNA를 (그림 4B)를 발표한다.
  5. 빨리 다음 버퍼 부정적인 컨트롤로 시작하는 예상 양의 샘플을 마무리, 삼중의 각 세트로 희석 기판의 50 μl를 추가하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다.
  6. 플레이트 리더에서 접시를 놓습니다. OD 405 nm에서 마이크로 플레이트 리더에 BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL / AC-IEPD-pNA를 가수 분해하여 ASP를-ASE 활동을 측정한다. 25 판독, 매 15 초 (약 6 분 총 독서 시간)을 가지고, 운동 분석 프로토콜을 사용합니다.
  7. 플레이트 리더 (VMAX)의 소프트웨어에 대한 값을 생성 할 수없는 경우 직접 기판의 절단 속도를 계산하기 위해 각 시점에서 생성 흡광도 판독 값을 사용한다.

다 3. 분석타

참고 : 시간이 지남에 OD의 변화 (MOD / 분)로 정의 된 최대 속도로 제시됩니다 생성 된 데이터,.

  1. 데이터를 분석하는, 흡광도의 변화율로부터 산출되는 기판 절단의 최대 속도를 결정한다. 자동 일반적으로이 옵션이 플레이트 리더 소프트웨어를 사용하여이 작업을 수행합니다.
  2. 또는 수동으로 플레이트 리더에 운동 분석 중에 생성되는 흡광도의 변화의 운동 플롯을 본 후 가파른 직선을주는 데이터 포인트를 선택합니다. 대부분의 상기 분석 최대 레이트로는 분석의 제 2 분 이내에 달성된다.
  3. 시간 간격으로이 직선과 분열의 가장 높은 OD 독서에서 초기 OD 읽기를 뺍니다. 통계 분석 및 그래픽 디스플레이 용 Microsoft Excel / 그래프 패드에 원시 데이터를 전송합니다.

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Representative Results

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BOC-AAD-S-BZL 기판 GzmB에 대한 특정

세린 프로테아제 GzmB 세포 독성 림프구 (CTL 및 NK 세포)의 주요 구성 성분이며, 바이러스 감염 또는 형질 전환 세포와 같은 표적 세포에 빠른 세포 사멸 죽음을 유도 주로 담당하고 있습니다. 이 때문에 선택된 단백질의 특정 특정 아스파 테이트 잔류 후 분열에 대한 기판 선호도에 크게이며, 속성은 아스 파르 테이트 잔류 후 절단하지만 단백질 분해 효소의 다른 클래스, 시스테인 프로테아제 가족 15 인 카스파, 공유. 단백질 분해 메카니즘의 차이는 AAD-SBzl 어떤 카스파 의해 절단 될 수 없다는 것을 의미한다. GzmB 발현은 이들 세포 (도 1)에서 제조 된 세포 용 해물에서 모니터링 될 수있다 세포 독성 림프구 및 효소 활성의 활성화 다음 유도된다. 그랜 자임 유전자 녹아웃 마우스의 가용성은 우리가를 구축 할 수있다합성 펩티드 기질의 Ala-BOC-의 Ala-의 Asp (AAD) - thiobenzyl 에스테르 (S-BZL)는 구체적 GzmB 의해 가수 분해된다. 합성 견고한 기판의 절단은 기본 B6 NK 세포에서 세포 용 해물에서 측정 아니지만 B6.GrzmB에서 수 - / - NK 세포. N-α-L-CBZ 리신 (BLT)의 가수 분해에 의해 측정 트립신 등 (트립 타 아제) 기질 특이성을 갖고 두 해물에 존재 제어 GzmA의 단백 분해 활성과 같은 당량이었다 -S- BZL.

종 특이 GzmB 기판 인식 서열

이 마우스와 인간의 GzmB는 P1 아스파 테이트 (23)을 둘러싼 매핑을 잔류 물 많은 8-10로에 의해 결정됩니다 약간 변경 기판 인식 환경을 가지고 등장 할 때까지 GzmB에 의해 절단 잠재적 표적 세포 분자를 설명하는 초기 연구는 혼란을 일으켰습니다. 이 프로 사멸 BH3 전용의 분열을 조사 연구에서 특히 분명했다마우스 GzmB에 의해 훨씬 덜 효율적으로 인간에 의해 효율적으로 절단 할 수 있지만, 분자 입찰. 완전한 세포에서,이 차이는 직접 카스파 제 활성화를 통해 인간 미토콘드리아 경로를 통해 우선적으로 동작 GzmB 및 마우스 GzmB와 다른 세포 사멸 경로의 활성화를 초래한다. 테트라 서열의 분석은 인간이 아닌 마우스 GzmB 인간 및 마우스 입찰 (16) 모두에서 인식 서열과 일치하는 순서 IEPD, 후 절단 할 수있는 것으로 나타났습니다. 모두 문학과 상용 제품은 테트라 기판을 카탈로그에, AC-IEPD-pNA를가 GzmB 활동 (표 1)을 테스트하기 위해 일반적으로 사용되어왔다. 그것은 동안 인간과 마우스 모두 매우 유사한 효율, BOC-AAD-S-BZL을 절단 할 수있는 지금 분명하다, NK 세포 용 해물 마우스 GzmB (그림 2) 효율적으로 가수 분해 AC-IEPD-pNA를을에 실패합니다. 대조적으로, 30 내지 10 μg의 μg의 인간 NK로부터 YT 파쇄물의 양을 감소 여전히 resulte충분한 GzmB에서 d는 AC-IEPD-의 PNA 기판 (그림 3)을 가수 분해한다.

그림 1
도 1 :. 과립 효소 활성 뮤린 NK 세포 그랜 자임 B (상부 패널) 및 B6의 야생형 및 B6.GrzmB 녹아웃 마우스에서 NK 세포 용 해물에서 그랜 자임 (하판)의 활동에 따라 Boc- 가수 최대 속도에 의해 결정 하였다 알라 - 알라의 ASP-S-BZL 및 N-α-CBZ-L-- S-BZL 라이신 펩타이드 기질. 데이터는 세중 (N> 3)에서 수행 한 대표적인 실험을 묘사한다.

그림 2
그림 2 :. AC-IEPD- pNA를 기판 마우스 및 인간 GzmB의 종 - 특정 가수 분해 동일하게 BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL을 가수 분해하지만 인간의 GzmB는 AC-IEPD-pNA를 가수 분해. 인간의NK 세포주 및 일차 YT IL-2 활성화 된 마우스 NK는 GzmB의 공급원으로 사용 하였다. 막대 그래프는 (n은> 3) 세중의에서 수행 한 대표적인 실험을 보여줍니다.

그림 3
도 3 :. GzmB 활성을 파기하지 않은 단백질 농도의 감소는 인간에 의해 유도 GzmB AC-IEPD-pNA를 가수 분해의 속도는 YT NK 세포주 해물 감소 단백질 농도를 사용하여 비교 하였다. N> 3 실험 담당자.

그림 4
그림 4 :. 분석 원리의 그래픽 묘사 GzmB 클리브 BOC-AAD-S-BZL (A) 및 AC-IEPD-pNA를 (B) P1 아스 파르 테이트 후가함으로써 해제 기판 중 하나를 차례로와 상호 작용하는 벤질 메르 캅탄, 디TNB는 형광 3- 카르복시 -4- 니트로 페녹 시드 이온 (A)을 형성하거나, 직접 발색단 자체 (B)는 P-니트로 아닐리드를 빼내도. 이 두 분자의 형광 방출은 405 nm에서 검출 할 수있다.

세린 프로테아제 기판 활동
그랜 자임 N-α-CBZ-L - 라이신 (BLT) thiobenzyl 에스테르 (S-BZL) 트립 타제 (22)
그랜 자임 B 1. BOC-알라 - 알라 -의 ASP (AAD)는 -S-BZL을 ASPase (14)
2. N 아세틸 일드의 Glu-PRO-의 Asp (IEPD) -p 니트로 아닐리드 PNA ()
그랜 자임 H SUC - 프 - 레 - 프-S-BZL 카이 메이즈 (23)

표 1. GzmA의 그랜 자임 활성의 검출 가능한 기질에서 트립 타제 활성이 특정 N-α-CBZ-L- 라이신의 가수 분해 (BLT) thiobenzyl 에스테르에 의해 검출 될 수있다 (S-BZL) . GzmB 구체적 중 BOC-의 Ala-의 Ala-의 Asp (AAD)의 가수 분해에 의해 평가 될 수있다 아스파라긴산 잔기 (ASP-ASE), 후 절단하여이 -S-BZL을 (검출 마우스 및 인간 GzmB 활성) 또는 N 아세틸 Ile- 글루 - 프로의 ASP (IEPD) -p 니트로 아닐리드 PNA () (은 인간 GzmB 활동을 감지). GzmH의 카이 메이즈 활동은 SUC - 프 - 레 - 프-S-BZL의 분열에 의해 평가된다.

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Discussion

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역사적으로 granzymes은 표적 세포의 급속한 세포 사멸 죽음을 유도 할 수있는 세포 독성 림프구 (CTL 및 NK 세포)의 주요 이펙터 분자로 확인되었다. 이는 아스 파르 테이트 (D) 잔기에 타깃 기판 분자를 절단함으로써 그 하류 표적 여러뿐만 아니라, 모두 절단 프로 카스파하여 카스파 제 캐스케이드를 활성화 할 수 있었다 GzmB의 작용에 주로이었다. 그러나, 지금 GzmB 발현 림프구 세포 독성 세포에 국한되지 않고 그 기능이 아니라 타겟 셀 인식 및 세포 죽음을 넘어 연장 될 수 있다는 것을 이해할 수있다.

이 논문에서 우리는 하나의 간단한 비색 분석법을 이용하여 마우스와 인간의 CTL / NK 세포 모두에서 파생 된 세포 용 해물에서 활동 GzmB의 검출을 가능하게하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 응용 프로그램이 다른 소스로부터 세포 샘플에서 GzmB를 검사 할 수있는 다음과 같은 연구 결과에 의해 확인으로이 분석의 단순화와 특이도의. 그러나, 세포 용 해물을 적어도 2 ㎎ / ㎖의 단백질 농도를 가지고 있고, 적절한 양 및 음의 컨트롤 실험 프로토콜에 포함되는 것이 중요하다. 활동 (도 1)이 완전히 손실 그대로 GzmB 용 BOC-AAD-SBzl 시약의 특이성, GzmB 널 동물 유래의 분해물의 기판 절단 활성의 결여 분명하다. 향후 연구에서는 이러한 음성 대조군 (들. 프로토콜 섹션 1.1) 감지 된 활동이 GrzB에 대한 특정 있는지 확인하는 데 사용하는 것이 좋습니다. (주 : GRB 같은 카스파가 P1 위치에서 아스파 테이트 잔기의 절단의 절대 특이성을 갖지만 P4 아미노산도 특이성 (24)의 중요한 결정 인자이고, 바람직한 기판 tetrapepetides이다.). 재조합 물질을 알라닌 돌연변이 단백질 분해 효소 (활성 효소와 완전히 동일한 방법으로 제조 비활성 단백질 분해 효소)의 활성 부위 세린을 검사하는 내가해야ncluded, 이는 비 - 포유 동물 세포 용 해물, 효모 또는 세균 세포에서 특히을 분석 할 때 특히 중요하다.

포유류 세포의 분석을 위해 상기 프로토콜을 사용하여, GzmB 활성뿐만 아니라 유도 된 세포에서 활성 세포 독성 림프구 (CL) (25)에 상향 - 조절을 크게 할 수 내인성 동족 세린 프로테아제 억제제 (serpins)의 존재에 의해 감소되지 않는다 형질 전환 된 세포 (26)를 포함하여 비 면역 조직에서. 세포질 serpinB9, (이전 PI-9) 인간의 GzmB에 대한 매우 구체적인이다 그러나 마우스에서, 세르 핀의 B9, 또는 SPI-6 마우스 GzmB 27 상당한 저해 활성을 가지고있는 여러 레 가까운하지만 특정 orthologues있다. NP-40 용해 완충액은 37 ° C에서 GzmB 세르 핀과 인큐베이션 비가역 사이의 상호 작용을 생성하기위한 허용 가능하지만 최적의 착물 형성 (28)에 요구된다. 우리는 일의 복합체 형성을 검색 할 수없는단백질 분해 효소 활성의 손실이 발생할 것 웨스턴 블롯에 의해 전자 해물. 이 프로토콜은 전형적인 주위 실험실 온도에서 수행되는 ~ 22 ° C의 최대.

이러한 분석을 수행 경험 20 년 이상에서 우리는 BOC-AAD-SBzl 시약의 상업 소스가 일관 민감하고 신뢰할 수있는 결과를 얻기 위해 최상의 중요한 것으로 나타났습니다. 다른 상용 소스가 다른 granzymes의 활동을 감지하는 데 필요한 기판에 적합하지만 우리는, 우리가 참조하는 한 업체를 추천 할 것입니다. 이 논문에 설명 된 프로토콜을 쉽게하기 표 1에 열거 된 적절한 인식 서열과 합성 펩티드 기질의 가수 분해에 의해 다른 과립 세린 프로테아제의 프로테아제 활성을 측정하도록 구성 될 수있다. N-α-CBZ-L- 라이신-S- BZL 기판 CL 마우스에서 마우스 및 인간 CL 및 이론적 GzmK 모두 GzmA의 트립 타제 활성을 검출하는데 사용될 수있다. GzmK mRNA 발현이 인플루엔자 펩타이드 (29)에 응답 GzmAB 유전자 녹아웃 생쥐에서 생성 된 킬러 세포의 RT-PCR에 의해 설명 하였지만, 우리는 다른 생리 관련 문맥이 나보고 된 GzmK 프로테아제 활성 인식되지 않는다. 재조합 인간 GzmH 또는 NK 세포로부터 정제 한 프로테아제, 어느 하나의 활성으로 평가 될 수 SUC - 프 - 레 - 프-S-BZL 30, 그러나 특히이 그랜 자임의이 기판의 가수 분해를 돌리는 것은 불가능 세포 용 해물. 림프구는 또한 키모 트립신과 같은 (카이 메이즈) 활동을해야합니다 카 텝신로 다른 endolysosomal 프로테아제의 숫자가 포함되어 있습니다. 마우스에서 GzmH 유전자는 유전자 (Gzms CF)와 유사 (카이 메이즈) 활동을 예측 모든 클러스터에 의해 대체된다.

인간의 GzmB 효과적으로 따라서 입찰 BH3 전용 프로 - 세포 사멸 분자를 절단하고, 발견되었지만 직접 미토콘드리아 참여데스 통로 (31)는 외관상으로는 초기에 충돌하는 결과 마우스 GzmB 얻었다. 이러한 혼란은, 프로테아제 (16)의 전반적인 서열 유사성의 높은 수준 (~ 80 %)에도 불구하고, 바람직한 기판 인식 서열은 마우스 및 인간 (쥐) GzmB 차이에서도 판단 연구자들에 의해 우아한 연구에 의해 해결됐다 17, 23. 인간의 GzmB을위한 최적의 인식 서열은 / V, E가 / M / Q, P ​​/ Xaa는 I입니다 (S / T) 마우스 GzmB 것이 반면 P1 위치 및 D L / I / V, E, F / Y / Q, D 16, 17. 특히 P가 GzmB 기판 바인딩 분열에 의해 수용되지 않을 것이다 마우스 GzmB, 따라서 마우스 입찰 (IEPD 75) 절단 사이트에서 허용되지 않는 가장 큰 차이점은, P2 위치에 있었다. 또한, 합성 펩타이드 기질 정기적으로 GzmB에 대한 구체적인 설명 IEPD-pNA를, 및 IETD-pNA를가 제대로 마우스 GzmB에 의해 가수 분해된다. 우리는 또한 다른 사람 (23) 사용 재에 의해 발견을 통합 한combinant 인간 GzmB하지만, 마우스 NK와 CTL 가수 분해 IETD-pNA를하고 IEPD-는 PNA 존재 GzmB하지 않는 것이 granzymes. Kaiserman 등. (17)는 재조합 인간의 분열 활동을 비교 및 마우스 GRB는 AC-IETD-의 PNA 기판과 BOC-AAD-SBzl를 사용하여, 피 키아 파스 토리스에서 생산. 마찬가지로, 저자는 비교 효율, 마우스 GRB에 의해 AC-IETD-pNA를 가수 분해와 BOC-AAD-SBzl를 절단 모두 효소 동안 비효율적 30 배 것을 발견했다. P2 위치에 T와 P (뿐만 아니라 S)가 인간 GzmB에 의해 선호하는 동안, 그들은 마우스 GzmB을 허용하지 않습니다. 대조적으로, 우리는 분명히 더 일반적인 BOC-AAD-SBzl 시약을 사용하여 인간 및 마우스 NK 세포 용 해물 모두에서 비교 GzmB 활동을 보여 주었다. 그러나, 인간 GzmB 활성 IEPD-pNA를 시약 검출 할 수있다.

함께 이러한 연구 결과는 다른 종의 GzmB의 미세 특이성의 차이가 선택하는 방법에 큰 영향을 미칠 수 있다는 사실을 강조생체 외 분석을위한 적절한 기판. 마우스, 쥐 또는 인간 GzmB 활성의 검출이 조사되면 요약하자면, BOC-AAD-SBzl 선택의 기판이다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SMSB05 Granzyme B substrate (mouse and human)
Ac-IEPD-pNA  SM Biochemicals LLC, CA SMPNA009 Granzyme B substrate (only human)
N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl Sigma-Aldrich C3647 Granzyme A substrate
Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SB025 Granzyme H substrate
5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)  Sigma-Aldrich D8130 DTNB, Ellman’s Reagent
NK cell isolation kit II mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-096-892 negative selection kit
NK cell isolation kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-092-657 negative selection kit
Plate reader Biorad iMark Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3
Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate Corning, MA, USA 2797

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References

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BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL의 가수 분해 : 색채 특히 그랜 자임 B 단백질 분해 활동를 측정 분석
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Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).More

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).

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