Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Een colorimetrische test waarmee specifiek Granzyme B proteolytische activiteit: Hydrolyse van Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Published: November 28, 2014 doi: 10.3791/52419

Introduction

Granzymen zijn een familie van serine proteasen in de secretoire lysosomen van natural killer (NK) cellen en cytotoxische T-lymfocyten (CTL) 1. Vijf verschillende granzymen aanwezig in mensen (A, B, H, K en M) en tien muizen (A - G, K, M en N) 2,3. Granzyme A en Granzyme B (GzmA, GzmB) zijn de meest voorkomende en zijn uitgebreid onderzocht in de mens en knaagdieren setting.

De klassieke functie van GzmB is de inductie van apoptose in doelcellen uitgevoerd in samenhang met de porievormende eiwit perforin, die granzyme om de doelcel cytosol 4 toelaat. Hoewel GzmB expressie ondubbelzinnig in cytotoxische lymfocyten, hebben recente studies over uiteenlopende andere GzmB expressie celtypen, waaronder maar niet beperkt tot keratinocyten 5, 6 basofielen, mestcellen 7, plasmacytoïde dendritische cellen 8, B-cellen en 9, 10.In dit verband, werden niet-apoptotische GzmB functies geopenbaard variërend van deelname ontstekingsprocessen, weefsel remodellering en andere immuunregulerende eigenschappen 11-14.

Aangezien een breder biologische rol is voorgesteld voor GzmB dan vroeger werd gedacht, onderzoekers vereisen betrouwbare en specifieke instrumenten voor de detectie. Van voordeel is GzmB's specifieke eis aan te hangen aan de car- kant van asparaginezuurresiduen, een eigenschap uniek onder eukaryote serineproteases 15. Muis, mens en rat GzmB structureel zeer vergelijkbaar, maar de uitgebreide substraat specificiteit van muis GzmB subtiel verschilt van die van menselijke en rat 16, hetgeen betekent dat bepaalde algemene substraten met een Asp in de terminal (P1) efficiënt kan worden gesplitst door GzmB van alle drie de soorten, terwijl andere substraten met meer gecompliceerde sequenties stroomopwaarts van P1 kunnen sterk wisselende resultaten geven. Zowel in het verleden en meer recente literature, dit feit aanzienlijke verwarring en misinterpretatie van de biologische betekenis van sommige experimentele resultaten veroorzaakt, hoewel zorgvuldig gecontroleerde hebben kinetische studies getracht om de situatie te 17 corrigeren.

In dit document hebben wij getracht deze punten met twee commercieel beschikbare substraten, namelijk Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl en N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilide illustreren. De twee reagentia genereren verschillende reactieve groepen na splitsing (vrije sulfhydrylgroep versus een fluorescerende vrij paranitroanilide), maar dit heeft geen gevolg van proteolytische splitsing. De beschreven protocol is een modern aanpassing van een zeer oud protocol 18, maar moet helpen onderzoekers verschillende substraten GzmB passende wijze gebruik en ook een methodologisch kader voor het detecteren van de activiteit van andere granzymen, zoals GzmA en GzmH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: milten werden afgeleid van muizen (6-10 weken oud) en alle dierproeven werden uitgevoerd volgens het dier ethische richtlijnen van de Peter MacCallum Cancer Centre (E486).

1. Voorbereiding van de monsters.

  1. Bereiding van muizen geactiveerde NK-cellen.
    1. Isoleer primaire naïeve NK-cellen uit eencellige suspensies van de milt van C57BL / 6 of B6.GrzmB - / - (GzmB gen null) muizen door negatieve selectie met behulp van in de handel verkrijgbare kits.
    2. Volg protocol van de fabrikant. Kort magnetisch label "niet-NK" cellen zoals T- en B-cellen, dendritische cellen, granulocyten, macrofagen en rode bloedcellen met biotine geconjugeerde antilichamen tegen hun specifieke oppervlakte merkers. Gebruik magnetische scheiding met anti-biotine beads "niet-NK" cellen te verminderen.
    3. Geïsoleerde cultuur NK cellen gedurende 5-7 dagen in medium bevattende IL-2 (1000 U / ml) bij 700.000 cellen / ml in platen met 24 putjesbij 37   ° C.
    4. Alternatief gebruik geactiveerde T-cellen 19, primaire antigeen-beperkte CTL van OT1 T-celreceptor transgene muizen 20, CTL gegenereerd in gemengde lymfocytculturen 21 of supernatanten van geactiveerde NK-cellen de activiteit van uitgescheiden GzmB 19 bepalen.
  2. Onderhoud van menselijke NK-cellijn en isolatie van primaire NK-cellen.
    1. Handhaaf humane NK leukemie (YT-cellen) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum. Alternatief zuiveren primaire NK-cellen uit het perifere bloed van gezonde proefpersonen en stimuleren 2-3 dagen in medium dat IL-2 bij 100 U / ml zoals eerder beschreven 22.
  3. Generatie van cellysaten.
    1. Was de cellen drie keer in PBS (pH 7,4), daarna schorsen Nonidet P-40 lysis buffer (0,1% NP-40, 250 mM NaCl, 25 mM Hepes, 2,5 mM EDTA). Idealiter lyseren minste 5 x 10 6 7 T-cellen in 100 pl buffer. Gebruik proteaseremmers niet toevoegen, zoals velen irreversibele remmers van serine proteasen, in het bijzonder tryptasen zoals GzmA. Incubeer op ijs gedurende 20 min en vervolgens pellet de kernen in een microcentrifuge bij 15.000 xg gedurende 10 min. Gooi de nucleaire pellet en breng het supernatant naar een nieuwe buis.
  4. Bepaal de eiwitconcentratie van de lysaten.
    1. Gebruik een in de handel verkrijgbaar protocol van keuze, zoals, Bradford of bicinchoninezuur (BCA) en bepalen van de eiwitconcentratie. Zorg ervoor dat de concentratie is ~ 2 mg / ml minimum. WINKEL lysaten bij -20 ° C totdat ze nodig waren (granzyme activiteit stabiel gedurende vele maanden bij -20 ° C).

2. Granzyme B Activity Assay

  1. Bereiding van reagentia
    1. Bereid een 10 mM voorraadoplossing van de substraten (Boc-AAD-S-Bzl of Ac-IEPD-pNA) in DMSO (~ 5 mg / ml) en bewaar in monsters bij -20 & #176; C. Bereid werkverdunningen vers en gooi deze na elke dag, zoals Boc-AAD-S-Bzl gedeeltelijk hydrolyseert op opslag in DMSO.
    2. Bereid een 250 mM voorraad van de colorimetrische reagens (5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoëzuur), DTNB) in DMSO (0,09 g / ml) en bewaar bij -20 ° C. Bereid een frisse werkende verdunning elke dag. Dit reagens is alleen vereist voor ondergronden met SBzl indicator groepen, niet pNA.
    3. Make up verse buffer (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl2, pH 7,3) om de 2-3 weken.
  2. Breng DTNB en synthetische substraten kamertemperatuur. Verdun substraten (01:16, bijvoorbeeld 100 ul in 1,6 ml buffer) en DTNB (1: 250, bijvoorbeeld 10 ul in 2,5 ml buffer) en meng.
  3. Verdun minste 100 ug eiwit lysaat van elk monster in buffer tot een eindvolume van 160 pl. Met een multichannel pipet voeg 50 ul per putje in drievoud (~ 33,3 ug / putje) in een 'U' 'bottom vinyl 96-well plaat.Onder andere een "alleen-buffer" control (ook in drievoud).
  4. Voeg 100 ul van verdund DTNB om de monsters / buffer controle (deze stap overslaan bij het werken met Ac-IEPD-pNA.
    OPMERKING: Splitsing van Ac-IEPD-pNA door GzmB direct releases fluorogeen pNA (Figuur 4B).
  5. Gebruik een meerkanaalspipet om snel 50 pi verdund substraten toe te voegen aan elke set van drievoud, te beginnen met de buffer dan de negatieve controles en afwerking met verwachte positieve monsters.
  6. Plaats de plaat in de plaat lezer. Meet Asp-ase activiteit door hydrolyse van Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA in een microplaat lezer bij OD 405 nm. Gebruik een kinetische assay protocol, nemen 25 lezingen, elke 15 sec (ca. 6 min totale leestijd).
  7. Gebruik de absorptieaflezingen gegenereerd op elk tijdstip handmatig berekenen de snelheid van substraatsplitsing als software het plaatvormige lezer niet kan genereren waarde Vmax.

3. Analyse van de Data

OPMERKING: De gegenereerde gepresenteerd maximale snelheid data, gedefinieerd als verandering van OD tijd (mOD / min).

  1. Om de gegevens te analyseren, bepalen de maximale snelheid van substraat splitsing, die wordt berekend op basis van de mate van verandering in absorptie. Doe dit automatisch met behulp van de plaat lezer software, die meestal heeft deze optie.
  2. U kunt ook na het bekijken van de kinetische percelen van verandering in absorptie, die ontstaan ​​tijdens de kinetische assay op de plaat lezer, handmatig selecteren van de data punten die de steilste rechte lijn te geven. Voor de meeste tests de maximale snelheid wordt bereikt binnen de eerste 2 minuten van de test.
  3. Trek de aanvankelijke OD lezen vanaf het hoogste OD lezen op deze rechte lijn en delen door het tijdsinterval. Transfer ruwe data naar Microsoft Excel / Graph pad voor statistische analyse en grafische weergave.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De Boc-AAD-S-Bzl substraat specifiek voor GzmB

De serine protease GzmB een hoofdbestanddeel van cytotoxische lymfocyten (CTL en NK-cellen) en is hoofdzakelijk verantwoordelijk voor het induceren van snelle apoptotische dood in doelwitcellen, zoals in geïnfecteerde of getransformeerde cellen. Dit is grotendeels te wijten aan het substraat voorkeur voor splitsing na bepaalde asparaginezuurresidu in geselecteerde eiwitten, een kenmerk gedeeld met caspasen, die ook splitsen na asparaginezuurresidu maar vanuit een andere klasse van proteasen, de cysteine ​​proteasen 15. Dit verschil in de proteolytische mechanisme betekent dat AAD-SBzl niet kan worden gesplitst door een caspase. GzmB expressie wordt geïnduceerd na activering van cytotoxische lymfocyten en enzymatische activiteit kan worden gecontroleerd cellysaten bereid uit deze cellen (Figuur 1). De beschikbaarheid van granzyme knockout muizen heeft ons toegelaten om vast te stellen dathet synthetische peptidesubstraat Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) - thiobenzyl ester (S-Bzl) specifiek gehydrolyseerd door GzmB. Robuuste splitsing van het synthetische substraat kan worden gemeten in een cel lysaat van B6 primaire NK-cellen, maar niet in B6.GrzmB - / - NK-cellen. Als controle werd de proteolytische activiteit van GzmA die trypsine-achtige (tryptase) substraatspecificiteit heeft en in beide lysaten is gelijk was, zoals gemeten door de hydrolyse van N-α-CBZ-L-lysine (BLT) -S- Bzl.

Soortspecifieke GzmB substraat herkenningsequentie

Vroege studies beschrijven potentiële doelcel moleculen gekliefd door GzmB veroorzaakte enige verwarring totdat bleek dat muis en menselijke GzmB een iets gewijzigde substraatherkenning voorkeur die wordt gedicteerd door wel 8-10 residuen mapping rond de P1 aspartaat 23. Dit was met name evident in studies die klieving van slechts BH3-pro-apoptotische onderzochtmolecuul Bid, die efficiënt kan worden gesplitst door de mens, maar veel minder efficiënt met de muis GzmB. In intacte cellen, dit verschil resulteert in de activatie van verschillende celdood routes, met menselijke GzmB voorkeur werkt via de mitochondriale route en muis GzmB via directe activatie caspase. Analyse van tetrapeptide sequenties onthulde dat de mens maar niet muis GzmB kon klieven na de opeenvolging IEPD, die overeenkomt met de herkenningsequentie in zowel mens en muis Biedingen 16. In zowel de literatuur en commerciële productcatalogen het tetrapeptide substraat is Ac-IEPD-pNA generiek gebruikt voor het testen GzmB (tabel 1). Het is nu duidelijk dat, hoewel zowel mens en muis splitsen Boc-AAD-S-Bzl, met zeer vergelijkbare efficiëntie, muis GzmB NK cellysaten niet efficiënt hydrolyseren Ac-IEPD-pNA (figuur 2). Daarentegen verminderen van de hoeveelheid menselijke NK YT lysaat van 30 ug tot 10 ug nog resulted voldoende GzmB de Ac-IEPD-pNA substraat (figuur 3) hydrolyseren.

Figuur 1
Figuur 1:. Korrel enzymactiviteit in muizen NK-cellen Granzyme B (bovenste paneel) en granzyme A (onderste paneel) activiteit in NK cellysaten uit B6 wildtype en B6.GrzmB knockout muizen werd bepaald door de maximale snelheid van hydrolyse van de Boc Ala-Ala-Asp S-Bzl en N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl peptidesubstraten. De gegevens tonen een representatief experiment uitgevoerd in drievoud (n> 3).

Figuur 2
Figuur 2:. Species-specifieke hydrolyse van Ac-IEPD- pNA substraat muis en menselijke GzmB gehydrolyseerd Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl even maar menselijke GzmB gehydrolyseerde Ac-IEPD-pNA. De menselijkeNK-cellijn YT en primaire IL-2 geactiveerde NK muizen werden gebruikt als een bron van GzmB. Grafiek toont één representatief experiment uitgevoerd in drievoud (n> 3).

Figuur 3
Figuur 3:. Vermindering van de eiwitconcentratie leverde GzmB activiteit niet trekt hij de snelheid van hydrolyse van Ac-IEPD-pNA veroorzaakt door menselijke GzmB werd vergeleken met behulp van afnemende eiwitconcentratie van YT NK-cellijn lysaat. Experiment representatief voor n> 3.

Figuur 4
Figuur 4:. Grafische voorstelling van het testprincipe GzmB splitst de substraten Boc-AAD-S-Bzl (A) en Ac-IEPD-pNA (B) na de P1 aspartaat, waardoor het vrijgeven ofwel een benzylmercaptan, die op zijn beurt samenwerkt met DTNB een fluorogene 3-carboxy-4-nitrophenoxide ion (A) te vormen, of door direct vrijgeven p-nitroanilide, wat een chromofoor zelf (B). Fluorescentie emissie van beide moleculen worden gedetecteerd bij 405 nm.

Serine protease Substraat Activiteit
Granzyme A N-α-CBZ-L-lysine (BLT) thiobenzyl ester (S-Bzl) Tryptase 22
Granzyme B 1. Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) -S-Bzl ASPase 14
2. N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilide (pNA)
Granzyme H SUC-Phe-Leu-Phe-S-Bzl Chymase 23

Tabel 1:. Lijst van beschikbare substraten voor detectie van granzyme activiteit Tryptase activiteit van GzmA kan worden gedetecteerd door hydrolyse van de specifieke N-α-CBZ-L-lysine (BLT) thiobenzyl ester (S-Bzl) . GzmB splitst specifiek na aspartaat residuen (Asp-ase), die kan worden beoordeeld door hydrolyse hetzij Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) -S-Bzl (detecteert muis en menselijke GzmB activiteit) of N-acetyl-Ile- Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilide (PNA) (alleen menselijk GzmB activiteit detecteert). Chymase activiteit GzmH wordt beoordeeld door splitsing van Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Historisch gezien granzymen werden geïdentificeerd als belangrijke effector moleculen van cytotoxische lymfocyten (CTL en NK cellen) kan induceren een snelle apoptotische dood in doelwitcellen. Dit was voornamelijk te wijten aan de werking van GzmB, waarvan bedoelde substraat moleculen gesplitst op aspartaat (D) residuen en derhalve kon de caspase cascade activeert zowel splitsen pro-caspasen, evenals verscheidene hun stroomafwaartse doelwitten. Het is echter nu duidelijk zijn dat GzmB expressie niet beperkt tot lymfoïde cytotoxische cellen en zijn functie verder dan doelwitcel herkenning en celdood verlengd.

In dit artikel beschrijven we een protocol dat de detectie van actieve GzmB in cellysaten afkomstig van zowel muis als humane CTL / NK-cellen via een simpele colorimetrische assay maakt. De eenvoud en de specificiteit van deze test zoals vastgesteld door deze bevindingen maken het mogelijk de toepassing van dit protocol om GzmB onderzoeken in cellulaire monsters uit andere brons. Het is echter belangrijk dat de cellysaten een eiwitconcentratie van tenminste 2 mg / ml, en positieve en negatieve controles zijn opgenomen in het experimentele protocol. De specificiteit van de Boc-AAD-SBzl reagens voor GzmB blijkt uit het ontbreken van substraat-splitsing activiteit in het lysaat afkomstig van GzmB nul dieren, zoals activiteit volledig verloren (Figuur 1). Bij eventuele toekomstige studies wordt aanbevolen dat een dergelijke negatieve controle (s. Protocol paragraaf 1.1) wordt gebruikt om te controleren of elke activiteit gedetecteerd is specifiek voor GrzB. (Noot: Hoewel dergelijke GrB, caspases een absolute specificiteit voor splitsing bij aspartaat residuen in de P1 positie voorkeur substraten tetrapepetides waarbij de P4 aminozuur ook een bepalende factor specificiteit. 24). Als behandeling recombinant materiaal de actieve plaats serine naar alanine mutant protease (inactief protease bereid op dezelfde manier als het actieve enzym) moet ikncluded, en dit is vooral belangrijk wanneer testen niet- zoogdieren cellysaten, met name uit gist of bacteriële cellen.

Met de bovengenoemde protocol voor assays van zoogdiercellen, is GzmB activiteit niet verminderd door de aanwezigheid van endogene verwante serine proteaseremmers (serpins), die sterk kunnen up-gereguleerd in geactiveerde cytotoxische lymfocyten (CL) 25, alsmede in cellen afgeleide van niet-immune weefsels, waaronder getransformeerde cellen 26. Het cytosol serpinB9, (voorheen PI-9) is zeer specifiek voor menselijke GzmB; maar in de muis, zijn er verschillende sluiten maar les specifieke orthologen waarvan serpine b9 of SPI-6 significante remmende activiteit muis GzmB 27. Hoewel lysis in NP-40 buffer permissief voor een onomkeerbaar interactie tussen GzmB en serpine, incubatie bij 37 ° C kan zijn vereist voor optimale complexvorming 28. We hebben geen complexe formatie in th detecterene lysaten door western blot, hetgeen zou resulteren in verlies van protease-activiteit. Dit protocol wordt uitgevoerd bij normale omgevingstemperatuur van het laboratorium uitgevoerd, tot ~ 22 ° C.

Van meer dan 20 jaar ervaring uitvoeren van deze assays hebben we gevonden dat de commerciële bron van de Boc-AAD-SBzl reagens is van het grootste belang voor het verkrijgen van consistente, gevoelige en betrouwbare resultaten. Wij zou alleen de leverancier we hebben genoemd, hoewel andere commerciële bronnen zijn ook geschikt voor nodig is om de activiteit van andere granzymen detecteren substraten. De in dit document beschreven protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor het bepalen protease activiteit van andere granule serineproteasen door hydrolyse van synthetische peptide-substraten met een geschikte herkenningssequentie zoals vermeld in tabel 1. De N-α-CBZ-L-lysine-S- Bzl substraat kan worden gebruikt om de activiteit van tryptase zowel GzmA detecteren bij muis en humane CL en theoretisch GzmK in muizen CL. Hoewel GzmK mRNA-expressie aangetoond door RT-PCR in killer cellen gegenereerd uit GzmAB knockout muizen in respons op influenza peptiden 29, we ons niet bewust van GzmK proteaseactiviteit werd gemeld in deze of een andere fysiologisch relevante context. De activiteit van ofwel recombinant humaan GzmH of de protease gezuiverd uit NK-cellen kunnen worden beoordeeld Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl 30, maar het is niet mogelijk om de hydrolyse van het substraat toeschrijven specifiek deze in granzyme cellysaten. Lymfocyten bevatten een aantal andere endolysosomal proteasen zoals cathepsinen, die ook activiteit hebben chymotrypsine-achtige (chymase). In de muis is de GzmH gen vervangen door een cluster van genen (Gzms CF) Alle voorspelde vergelijkbare activiteit (chymase) hebben.

Hoewel de menselijke GzmB werd gevonden om effectief te klieven de BH3-only pro-apoptotische molecuul Bid, en dus direct betrekken van de mitochondrialedood route 31, ogenschijnlijk tegenstrijdige resultaten werden aanvankelijk verkregen met de muis GzmB. Deze verwarring werd opgelost door elegante studies door een aantal onderzoekers, waarvan vastgesteld dat het substraat herkenningssequentie voorkeur verschilde tussen muis en mens (en ratten) GzmB ondanks de hoge (~ 80%) van de totale sequentie homologie van de proteasen 16 17,23. De optimale herkenning sequentie voor humaan GzmB is I / V, E / M / Q, P / Xaa (S / T) en D in de P1 positie dat voor muizen GzmB is L / I / V, E, F / Y / Q, D 16,17. Het grote verschil was in de P2 positie, als P in het bijzonder niet wordt getolereerd door de muis GzmB, vandaar de muis Biedingen (IEPD 75) kliefplaats zou niet worden opgevangen door de GzmB substraatbinding gespleten. Bovendien is de synthetische peptidesubstraten IEPD-pNA, routinematig omschreven als specifiek voor GzmB en IETD-pNA, zijn slecht gehydrolyseerd door muis GzmB. We hebben verder geconsolideerd de vaststelling door anderen 23 met behulp van reCombinant granzymen dat menselijke GzmB, maar niet in de muis NK en CTL hydrolyse IETD-pNA en IEPD-pNA GzmB. Kaiserman et al. 17 ten opzichte van de splitsing activiteit van recombinant humaan en muis GrB geproduceerd in Pichia pastoris, met behulp van Boc-AAD-SBzl met de Ac-IETD-pNA substraten. Ook de auteurs vinden dat terwijl beide enzymen gesplitst Boc-AAD-SBzl met vergelijkbare efficiëntie, hydrolyse van Ac-IETD-pNA met de muis GrB was 30-voudig minder efficiënt. Terwijl T en P (als S) in de P2 positie voorkeur door menselijke GzmB, zijn ze niet getolereerd muis GzmB. Daarentegen hebben we duidelijk aangetoond vergelijkbare GzmB activiteit in zowel mens en muis NK cellysaten met behulp van de meer generieke Boc-AAD-SBzl reagens. Echter, kon alleen menselijke GzmB activiteit gedetecteerd met IEPD-pNA reagens.

Samen vormen deze bevindingen benadrukken het feit dat verschillen van de fijne specificiteit van GzmB van verschillende soorten een grote invloed op hoe te kiezen kan hebbeneen geschikt substraat voor in vitro analyse. Samengevat, als detectie van muis, mens of rat GzmB activiteit onderzocht Boc-AAD-SBzl is het substraat van keuze.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SMSB05 Granzyme B substrate (mouse and human)
Ac-IEPD-pNA  SM Biochemicals LLC, CA SMPNA009 Granzyme B substrate (only human)
N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl Sigma-Aldrich C3647 Granzyme A substrate
Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SB025 Granzyme H substrate
5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)  Sigma-Aldrich D8130 DTNB, Ellman’s Reagent
NK cell isolation kit II mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-096-892 negative selection kit
NK cell isolation kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-092-657 negative selection kit
Plate reader Biorad iMark Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3
Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate Corning, MA, USA 2797

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).
  2. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).
  3. Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. , (2009).
  4. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).
  5. Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).
  6. Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).
  7. Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).
  8. Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. , (2009).
  9. Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).
  10. Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).
  11. Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).
  12. Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).
  13. Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).
  14. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).
  15. Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).
  16. Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).
  17. Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).
  18. Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
  19. Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).
  20. Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).
  21. Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).
  22. Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).
  23. Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).
  24. Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).
  25. Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).
  26. Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).
  27. Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).
  28. Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
  29. Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).
  30. Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).
  31. Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).

Tags

Chemistry Granzyme B serine protease peptide thioesters BOC-Ala-Ala-Asp-S-Bzl colorimetrische substraat hydrolyse asp-ase activiteit
Een colorimetrische test waarmee specifiek Granzyme B proteolytische activiteit: Hydrolyse van Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. More

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter