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Chemistry

Ein Farbtest, die speziell Maßnahmen Granzyme B Proteolytische Aktivität: Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

doi: 10.3791/52419 Published: November 28, 2014

Introduction

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Granzyme sind eine Familie von Serin-Proteasen, die in den sekretorischen Lysosomen von natürlichen Killerzellen (NK) und zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) 1 gefunden. Fünf verschiedene Granzyme im Menschen vorhanden (A, B, H, K und M), und zehn Mäuse (A - G, K, M und N) 2,3. Granzyme A und Granzyme B (GZMA, GzmB) sind die häufigsten und wurden umfangreich im menschlichen und Nagetier-Einstellung untersucht.

Die klassische Funktion GzmB ist die Induktion von Apoptose in Zielzellen in Verbindung mit der porenbildende Protein von Perforin, Granzym, die die an die Zielzelle Cytosol 4 Zugriff ermöglicht ausgeführt. Obwohl GzmB Expression unzweideutig in zytotoxischen Lymphozyten haben neuere Studien wurden zu einer Vielzahl anderer GzmB exprimierenden Zelltypen, einschließlich, aber nicht beschränkt Keratinozyten 5, 6 Basophilen, Mastzellen 7, plasmacytoid dendritischen Zellen 8, 9 und B-Zellen, 10.In diesem Zusammenhang wurden nicht-apoptotischen GzmB Funktionen ergeben, die von der Teilnahme an entzündlichen Prozessen, Gewebeumbau und anderen immunregulatorischen Eigenschaften 14.11.

Da eine breitere biologische Rolle für GzmB als bisher vermutet vorgeschlagen, Forschern erfordern zuverlässige und spezifische Werkzeuge für die Erkennung. Von Vorteil ist, GzmB die ausdrückliche Verpflichtung, in der Carboxylseite von Asparaginsäurereste, eine Eigenschaft, einzigartig unter den eukaryotischen Serinproteasen 15 zu spalten. Maus, Ratte und Mensch sind GzmB strukturell sehr ähnlich, aber die erweiterten Substratspezifität der Maus GzmB unterscheidet dezent von der Ratte und Mensch 16, was bedeutet, dass bestimmte allgemeine Substraten mit Asp an der Klemme (P1) effizient durch GzmB gespalten von allen drei Spezies, während andere Substrate mit komplizierteren Sequenzen stromaufwärts von P1 kann stark unterschiedliche Ergebnisse ergeben. In der Vergangenheit und neuere literature hat diese Tatsache erhebliche Verwirrung und Fehlinterpretation der biologische Bedeutung einiger experimenteller Befunde verursacht, obwohl sorgfältig kontrolliert wurden kinetische Untersuchungen versucht, die Lage 17 zu korrigieren.

In dieser Arbeit haben wir versucht, diese Punkte unter Verwendung von zwei im Handel erhältliche Substrate, nämlich Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl und N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-Nitroanilid zu illustrieren. Die beiden Reagenzien zu tun erzeugen unterschiedliche reaktive Gruppen nach der Spaltung (eine freie Sulfhydryl gegenüber einer Leuchtstoff kostenlos Paranitroanilid), aber dies berührt in keiner Weise auf die proteolytische Spaltung. Das beschriebene Protokoll ist eine moderne Adaption eines sehr alten Protokoll 18, sollte aber helfen Forschern, die verschiedenen GzmB Substrate angemessen zu nutzen, sondern schafft auch einen methodischen Rahmen zur Erfassung der Aktivität von anderen Granzyme wie GZMA und GzmH.

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Protocol

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HINWEIS: Die Milz wurde aus Mäusen (6-10 Wochen alt) und alle Tierversuche wurden nach den Tierethik Richtlinien der Peter MacCallum Cancer Center (E486) durchgeführt.

1. Vorbereitung der Proben.

  1. Herstellung von aktivierten Maus-NK-Zellen.
    1. Isolieren Primär naive NK-Zellen von Einzelzellsuspensionen von den Milzen von C57BL / 6 oder B6.GrzmB - / - (GzmB Gen null) Mäusen durch negative Selektion unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits.
    2. Folgen Protokoll der Hersteller. Kurz gesagt, magnetisch zu markieren "nicht-NK" Zellen, wie T- und B-Zellen, dendritischen Zellen, Granulozyten, Makrophagen und Erythrozyten unter Verwendung von Biotin-konjugiertem Antikörper gegen ihre spezifischen Oberflächenmarkern. Verwenden magnetischer Trennung mit Anti-Biotin-Perlen zu "nicht-NK" Zellen abzureichern.
    3. Kultur isoliert NK-Zellen für 5-7 Tage in Medium, das IL-2 (1.000 U / ml) bei 700000 Zellen / ml in 24-Well-Plattenbei 37   ° C.
    4. Alternativ aktiviert Verwendung T-Zellen 19, primäre Antigen-restringierte CTL aus OT1 T-Zell-Rezeptor-transgenen Mäusen 20 erzeugte CTL in gemischten Lymphozyten-Kulturen 21 oder Überständen von aktivierten NK-Zellen, um die Aktivität der sekretierten GzmB 19 bestimmen.
  2. Wartung der menschlichen NK-Zelllinie und Isolierung von primären NK-Zellen.
    1. Pflege der menschlichen NK Leukämie (YT-Zellen) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt. Alternativ reinigen primären NK-Zellen aus dem peripheren Blut von gesunden Probanden und für 2-3 Tage in einem Medium anzuregen, das IL-2 bei 100 U / ml, wie zuvor beschrieben 22.
  3. Erzeugung von Zelllysaten.
    1. Wash-Zellen dreimal in PBS (pH 7,4), dann in Nonidet P-40 Lysepuffer auszusetzen (0,1% NP-40, 250 mM NaCl, 25 mM Hepes, 2,5 mM EDTA). Idealerweise Lyse von mindestens 5 x 10 6 7 T-Zellen in 100 ul Puffer. Nicht hinzufügen Proteaseinhibitoren, wie viele sind irreversible Inhibitoren von Serinproteasen, insbesondere Tryptasen wie GZMA. Inkubieren auf Eis für 20 min, und dann die Kerne zu pelletieren in einer Mikrozentrifuge bei 15.000 × g für 10 min. Entsorgen Sie die Kernpellet und den Überstand in ein frisches Röhrchen.
  4. Bestimmung der Proteinkonzentration der Lysate.
    1. Verwenden Sie ein handelsübliches Protokoll der Wahl, wie Bradford oder Bicinchoninsäure (BCA) und bestimmen Sie die Proteinkonzentration. Sicherzustellen, dass die Konzentration von ~ 2 mg / ml Minimum. Speicher Lysate bei -20 ° C bis zur Verwendung (Granzym-Aktivität ist für viele Monate bei -20 ° C stabil).

2. Granzyme B-Aktivitätstest

  1. Herstellung der Reagenzien
    1. Bereiten Sie eine 10 mM Stamm der Substrate (Boc-AAD-S-Bzl oder Ac-IEPD-pNA) in DMSO (~ 5 mg / ml) und lagern bei -20 & #176; C. Bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung frisch und entsorgen Sie nach jedem Tag, als Boc-AAD-S-Bzl teilweise bei der Lagerung in DMSO hydrolysiert.
    2. Bereiten Sie eine 250 mM Stamm der farbmetrischen Reagenz (5,5'-Dithio-bis (2-nitrobenzoesäure), DTNB) in DMSO (0,09 g / ml) und bei -20 ° C. Bereiten Sie jeden Tag eine neue Arbeitsverdünnung. Dieses Reagenz ist nur für Substrate mit SBzl Indikatorgruppen nicht pNA erforderlich.
    3. Make-up frischen Puffer (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl 2, pH 7,3), alle 2-3 Wochen.
  2. Bringen DTNB und synthetische Substrate auf Raumtemperatur. Verdünnen Substrate (01.16, zB 100 ul in 1,6 ml Puffer) und DTNB (1: 250, beispielsweise 10 & mgr; l in 2,5 ml Puffer) und gut mischen.
  3. Verdünne ein Minimum von 100 & mgr; g Protein-Lysat von jeder Probe in einem Puffer, um ein Endvolumen von 160 ul. Mit einer Mehrkanal-Pipette werden 50 ul pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung (~ 33,3 ug / Vertiefung) in einer '' U '' bottom Vinyl Platte mit 96 Vertiefungen.Fügen Sie eine "Puffer-only" Kontrolle (auch in dreifacher Ausfertigung).
  4. 100 l verdünnt DTNB zu der Proben / Pufferkontrolle (bei der Arbeit mit Ac-IEPD-pNA lassen Sie diesen Schritt.
    HINWEIS: Die Spaltung von Ac-IEPD-pNA durch GzmB direkt frei fluorogenen pNA (4B).
  5. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette um 50 ul verdünnt Substrate auf jeden Satz von dreifach schnell hinzufügen, beginnend mit dem Puffer dann negative Kontrollen und endend mit erwarteten positiven Proben.
  6. Die Platte wird in der Plattenlesegerät. Messen Asp-ase-Aktivität durch Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA in einem Mikroplatten-Lesegerät bei OD 405 nm. Verwenden Sie eine kinetische Assay-Protokoll, nehmen 25 Lesungen, alle 15 Sekunden (ca. 6 min Gesamtlesezeit).
  7. Verwenden Sie die Absorptionswerte zu jedem Zeitpunkt erzeugt werden, um manuell berechnen die Geschwindigkeit der Spaltung des Substrats, wenn die Software des Plattenlesegerät kann kein Wert für Vmax zu generieren.

3. Analyse Data

Hinweis: die erzeugt wird, wenn die maximale Geschwindigkeit präsentierten Daten, definiert als Veränderung der OD über die Zeit (mOD / min).

  1. Um die Daten zu analysieren, zu bestimmen, die maximale Geschwindigkeit der Spaltung des Substrats, die von der Änderungsrate der Extinktion berechnet wird. Tun Sie dies automatisch mit dem Plattenlesegerät-Software, die in der Regel hat diese Option.
  2. Alternativ nach der Anzeige der kinetischen Grundabsorptionsänderung, die während der kinetischen Assay auf dem Plattenlesegerät erzeugt werden, manuell auswählen, die Datenpunkte, die den steilsten gerade Linie zu geben. Für die meisten Tests wird innerhalb der ersten 2 min des Tests die maximale Rate erreicht.
  3. Subtrahieren Sie die Anfangs-OD Lesung aus dem höchsten OD-Wert auf dieser geraden Linie und Gefälle durch das Zeitintervall. Übertragen Sie Rohdaten an Microsoft Excel / Graph-Pad für die statistische Analyse und grafische Darstellung.

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Representative Results

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Die Boc-AAD-S-Bzl Substrat spezifisch für GzmB

Die Serinprotease GzmB ist ein Hauptbestandteil von zytotoxischen Lymphozyten (CTL und NK-Zellen) und vorwiegend zur Induzierung schnelle apoptotischen Tod in Zielzellen, wie virusinfizierte oder transformierten Zellen verantwortlich. Dies ist vor allem aufgrund der Substratpräferenz für die Spaltung nach bestimmten Aspartatreste in ausgewählten Proteinen geteilt ein Attribut mit den Caspasen, die auch nach der Aspartatreste spalten, aber aus einer anderen Klasse der Proteasen, Cystein-Proteasefamilie 15. Dieser Unterschied in der proteolytischen Mechanismus bedeutet, AAD-SBzl durch keine Caspase gespalten werden. GzmB Expression wird nach der Aktivierung von zytotoxischen Lymphozyten und enzymatische Aktivität in Zelllysaten aus diesen Zellen (Figur 1) hergestellt überwacht werden induziert. Die Verfügbarkeit von Granzym-Gen-Knockout-Mäusen hat uns erlaubt, die zu etablierendas synthetische Peptidsubstrat Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) - Thiobenzyl ester (S-Bzl) spezifisch durch GzmB hydrolysiert. Robust Spaltung des synthetischen Substrats in einem Zell-Lysat von B6 primären NK-Zellen gemessen werden, aber nicht in B6.GrzmB - / - NK-Zellen. Als Kontrolle wurde die proteolytische Aktivität der GZMA, die Trypsin-artigen (Tryptaseinhibitor) Substratspezifität besitzt und in beiden Lysaten vorhanden war äquivalent, wie durch die Hydrolyse von N-α-CBZ-L-Lysin (BLT) gemessen -S- Bzl.

Artspezifische GzmB Substrat-Erkennungssequenz

Frühe Studien potenzielle Zielzelle Moleküle durch GzmB gespalten beschreibt einige Verwirrung gesorgt, bis sich herausgestellt, dass Maus und Mensch GzmB haben eine leicht veränderte Substraterkennung Vorzug, die von nicht weniger als 8-10 Rückstände Mapping um den P1 Aspartat 23 diktiert wird. Dies war in Studien, die Abspaltung der Pro-apoptotische BH3-only sucht besonders offensichtlichMolekül Gebot, welches effizient durch menschliche weit weniger effizient durch Maus GzmB gespalten werden können, jedoch. In intakten Zellen, führt dieser Unterschied in der Aktivierung von verschiedenen Zelltod Wege, mit menschlichen GzmB Betriebs vorzugsweise durch die mitochondrialen und Maus GzmB über direkte Caspase-Aktivierung. Die Analyse der Tetrapeptid-Sequenzen zeigte, dass menschliche, aber nicht Maus GzmB konnte nach der Reihenfolge IEPD, die die Erkennungssequenz sowohl in der Human- und Maus-Bid 16 passt zu spalten. Sowohl in der Literatur und in der kommerziellen Produktkataloge das Tetrapeptid-Substrat hat Ac-IEPD-pNA wurden allgemein verwendet, um GzmB Aktivität (Tabelle 1) zu testen. Es ist nun klar, dass zwar sowohl Mensch und Maus können Boc-AAD-S-Bzl spalten, mit sehr ähnlichen Effizienz, Maus GzmB in NK Zelllysate nicht effizient hydrolysieren Ac-IEPD-pNA (Abbildung 2). Demgegenüber Verringerung der Menge an menschlicher NK YT Lysat von 30 ug bis 10 ug noch resulted in ausreichender GzmB die Ac-IEPD-pNA-Substrat (3), zu hydrolysieren.

Figur 1
Fig. 1: Granulatenzymaktivität in murinen NK-Zellen Granzyme B (obere Tafel) und Granzym A (untere Tafel) -Aktivität in NK Zelllysaten aus B6-Wildtyp und B6.GrzmB knockout Mäusen wurde durch die maximale Geschwindigkeit der Hydrolyse des Boc- bestimmt Ala-Ala Asp-S-Bzl und N-α-CBZ-L-Lysin-S-Bzl Peptidsubstrate. Die Daten zeigen ein repräsentatives Experiment in dreifacher Ausfertigung (n> 3) durchgeführt.

Abbildung 2
Abb. 2: Artspezifische Hydrolyse von Ac-IEPD- pNA-Substrat Maus und menschlichen GzmB hydrolysiert Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl ebenso aber auch nur ein Mensch GzmB hydrolysiert Ac-IEPD-pNA. Der menschlicheNK-Zellinie YT und primäre IL-2 aktivierten NK Maus wurden als eine Quelle von GzmB verwendet. Balkendiagramm zeigt einen repräsentativen Versuch dreifach durchgeführt (n> 3).

Figur 3
Fig. 3: Reduktion der Proteinkonzentration nicht GzmB Aktivität aufzuheben Die Hydrolysegeschwindigkeit von Ac-IEPD-pNA durch menschliche GzmB induziert wurde mit abnehmender Proteinkonzentration von YT NK-Zelllinie Lysat verglichen. Experiment repräsentativ für n> 3.

4
Fig. 4: Graphische Darstellung des Testprinzips GzmB spaltet die Substrate Boc-AAD-S-Bzl (A) und Ac-IEPD-pNA (B) nach dem P1 Aspartat, wodurch die Freigabe entweder ein Benzylmercaptan, die ihrerseits zusammenwirkt mit DTNB, eine fluorogene 3-carboxy-4-nitrophenoxide Ion (A) zu bilden, oder durch direktes Lösen p-nitroanilid, das ein Chromophor selbst (B) ist. Fluoreszenzemissionen aus beiden dieser Moleküle können bei 405 nm detektiert werden.

Serinprotease Substrat Aktivität
Granzyme A N-α-CBZ-L-Lysin (BLT) Thiobenzyl ester (S-Bzl) Tryptase 22
Granzyme B 1. Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) -S-Bzl ASPase 14
2. N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-Nitroanilid (pNA)
Granzyme H Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl Chymase 23

Tabelle 1:. Liste der Substrate für den Nachweis von Granzym-Aktivität verfügbar Tryptase Aktivität GZMA kann durch Hydrolyse des speziellen N-α-CBZ-L-Lysin (BLT) Thiobenzyl-Ester nachgewiesen werden (S-Bzl) . GzmB spezifisch spaltet nach Aspartatreste (Asp-ase), die durch Hydrolyse von entweder Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) bewertet werden können -S-Bzl (erkennt Maus und Mensch GzmB Aktivität), oder N-Acetyl-Ile- Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-Nitroanilid (pNA) (erkennt nur Menschen GzmB Aktivität). Chymase Aktivität GzmH wird durch Spaltung von Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl beurteilt.

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Discussion

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Historisch die Granzyme wurden als Schlüssel Effektormoleküle zytotoxischer Lymphozyten (CTL und NK-Zellen), die zur Induktion einer schnellen apoptotischen Tod in Zielzellen identifiziert. Dies war vor allem auf die Wirkung von GzmB, das Zielsubstrat Moleküle an Aspartat (D) Reste gespalten und somit konnte die Caspase-Kaskade von beiden spalten pro-Caspasen zu aktivieren, sowie mehrere ihrer nachgelagerten Ziele. Es ist jedoch nun ersichtlich, dass GzmB Expression ist nicht auf lymphoide zytotoxischen Zellen beschränkt und kann seine Funktion auch über Zielzellerkennung und Zelltod verlängert.

In dieser Veröffentlichung beschreiben wir ein Protokoll, das den Nachweis einer aktiven GzmB in Zellysaten sowohl von Maus- und Human-CTL / NK-Zellen unter Verwendung einer einfachen kolorimetrischen Test abgeleitet ermöglicht. Die Einfachheit und Spezifität dieses Tests als durch diese Ergebnisse ermitteln erlauben die Anwendung dieses Protokolls zu GzmB in zellulären Proben aus einer anderen Quelle zu untersuchens. Es ist jedoch wichtig, dass die zelluläre Lysate haben eine Proteinkonzentration von mindestens 2 mg / ml, und geeignete positive und negative Kontrollen sind in dem Versuchsprotokoll enthalten. Die Spezifität der Boc-AAD-SBzl Reagenz zur GzmB ist offensichtlich aus dem Mangel an Substrat-Spaltungsaktivität in dem Lysat aus GzmB null Tieren gewonnen werden, als Aktivität vollständig verloren (1). In zukünftigen Studien wird empfohlen, eine solche Negativkontrolle (s. Protokoll Abschnitt 1.1) wird verwendet, um sicherzustellen, dass die festgestellten Tätigkeit ist spezifisch für GrzB. (Anmerkung: Obwohl wie GrB weisen Caspasen eine absolute Spezifität für die Spaltung an Aspartatreste in der P1-Position sind bevorzugte Substrate sind tetrapepetides wo der P4 Aminosäure ist auch eine kritische Determinante der Spezifität. 24). Wenn die Prüfung rekombinantem Material die aktive Stelle Serin zu Alanin mutierte Protease (inaktive Protease in genau derselben Weise wie das aktive Enzym hergestellt) sollte ichinbegriffen, und dies ist besonders wichtig, wenn Untersuchen Nichtsäugetier Zelllysaten, insbesondere aus der Hefe oder Bakterienzellen.

Unter Verwendung des obigen Protokolls für Assays von Säugetierzellen ist GzmB Aktivität nicht durch die Anwesenheit von endogenen kognaten Serinproteaseinhibitoren (Serpine), die erheblich sein kann, in aktivierten zytotoxischen Lymphozyten (CL) 25 nach oben reguliert, sowie in Zellen, abgeleitet vermindert aus Nicht-Immungewebe, einschließlich transformierten Zellen 26. Die zytosolischen serpinB9 (früher PI-9) ist hochspezifisch für humanes GzmB; jedoch in der Maus, gibt es mehrere enge, aber les spezifischen Orthologe davon Serpin B9 oder SPI-6 besitzt signifikante inhibitorische Aktivität für Maus GzmB 27. Obwohl Lyse in NP-40-Puffer kann permissive zum Erzeugen eines irreversiblen Wechselwirkung zwischen GzmB und Serpin, Inkubation bei 37 ° C sein wird für optimale Komplexbildung 28 erforderlich. Wir haben nicht die Komplexbildung in th erkennene Lysaten durch Western-Blot, die zu einem Verlust der Proteaseaktivität führen würde. Dieses Protokoll wird bei typischen Laborumgebungstemperatur durchgeführt, bis ~ 22 ° C.

Von mehr als 20 Jahren Erfahrung der Durchführung dieser Tests haben wir festgestellt, dass die kommerzielle Quelle der Boc-AAD-SBzl Reagenz ist von größter Bedeutung für den Erhalt von konsistenten, empfindliche und zuverlässige Ergebnisse. Wir würden nur empfehlen, den Lieferanten wir verwiesen haben, obwohl auch andere kommerzielle Quellen sind auch für die erforderlich sind, um die Aktivität anderer Granzyme erkennen Substraten. Die in diesem Papier beschriebene Protokoll kann leicht zur Bestimmung Proteaseaktivität von anderen Granulat Serinproteasen durch die Hydrolyse von synthetischen Peptidsubstraten mit einer geeigneten Erkennungssequenz wie in Tabelle 1 aufgelistet sind angepasst werden. Die N-α-CBZ-L-Lysin-S- Bzl Substrat kann verwendet werden, um die Tryptase Aktivität sowohl GZMA detektieren in Maus- und Mensch-CL und theoretisch Granzym K in Maus CL werden. Obwohl Granzym K-mRNA-Expression wurde durch RT-PCR in Killerzellen aus GzmAB Gen-Knockout-Mäusen in Reaktion auf Influenza-Peptide 29 erzeugte gezeigt, wir keine Kenntnis von Granzym K-Protease-Aktivität mit in dieser oder einer anderen physiologisch relevanten Kontext berichtet. Die Aktivität von rekombinantem menschlichen GzmH oder der Protease aus NK-Zellen gereinigt werden, können mit beurteilen Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl 30, es ist jedoch nicht möglich, die Hydrolyse dieses Substrats speziell diesem Granzym in zuschreiben Zelllysate. Lymphozyten enthalten eine Reihe von anderen endolysosomalen Proteasen wie die Cathepsine, die auch wird chymotrypsinartige (Chymosin) Aktivität. In der Maus ist die GzmH Gen von einem Cluster von Genen (Gzms CF) alle vorhergesagten ähnliche (Chymosin) Aktivität aufweisen ersetzt.

Obwohl menschliche GzmB gefunden wurde, um effektiv zu spalten die BH3-only-pro-apoptotischen Molekül Gebot, und damit direkt die mitochondriale engagierenTod Weg 31, scheinbar widersprüchliche Ergebnisse wurden zunächst mit der Maus GzmB erhalten. Diese Verwirrung wurde von eleganten Studien von einer Reihe von Forschern, die bestimmt, dass das bevorzugte Substrat-Erkennungssequenz zwischen Maus und Mensch (und Ratte) GzmB unterschiedlich gelöst, trotz der hohen (~ 80%) der Gesamtsequenzhomologie der Proteasen 16, 17,23. Die optimale Erkennungssequenz für menschlichen GzmB ist I / V, E / M / Q, P / Xaa (S / T) und D in der P1-Position während für Maus GzmB es L / I / V, E, F / Y / Q, D 16,17. Der Hauptunterschied war bei der Position P2, wie P ist insbesondere nicht mit der Maus GzmB, daher der Maus Bid (IEPD 75) Spaltstelle toleriert würde nicht vom GzmB Substratbindungsspalte untergebracht werden. Außerdem sind die synthetischen Peptidsubstraten IEPD-pNA, routinemßig als spezifisch für GzmB beschrieben und IETD-pNA, werden schlecht von Maus GzmB hydrolysiert. Wir haben weiter konsolidiert die Feststellung von anderen 23 mit wieder hergestelltrekombinante Granzyme, dass menschliche GzmB, aber nicht in der Maus NK und CTL hydrolysieren IETD-pNA und IEPD-pNA vorhanden GZMB. Kaiserman et al. 17 im Vergleich der Spaltungsaktivität von rekombinantem Human-und Maus GrB produziert in Pichia pastoris, mit Boc-AAD-SBzl mit Ac-IETD-pNA Substrate. In ähnlicher Weise fanden die Autoren heraus, dass, während beide Enzyme gespalten Boc-AAD-SBzl mit vergleichbarer Effizienz, Hydrolyse von Ac-IETD-pNA durch Maus GrB war 30-fach weniger effizient. Während T und P (sowie S) in der P2-Position sind durch menschliche GzmB bevorzugt, sind sie nicht der Maus GzmB toleriert. Im Gegensatz dazu haben wir deutlich gezeigt, vergleichbar GzmB Aktivität sowohl in humanen und murinen NK-Zell-Lysaten unter Verwendung der generischen Boc-AAD-SBzl Reagenz. Allerdings könnte auch nur ein Mensch GzmB Aktivität mit der IEPD-pNA Reagenz erkannt werden.

Zusammen stellen diese Ergebnisse unterstreichen die Tatsache, dass Unterschiede in der Feinspezifität GzmB verschiedener Arten können einen großen Einfluss auf, wie man zu wählenein geeignetes Substrat für die in vitro-Analyse. Zusammenfassend: Wenn Nachweis von Maus, Mensch oder Ratte GzmB Aktivität untersucht wird, ist Boc-AAD-SBzl das Substrat der Wahl.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SMSB05 Granzyme B substrate (mouse and human)
Ac-IEPD-pNA  SM Biochemicals LLC, CA SMPNA009 Granzyme B substrate (only human)
N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl Sigma-Aldrich C3647 Granzyme A substrate
Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SB025 Granzyme H substrate
5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)  Sigma-Aldrich D8130 DTNB, Ellman’s Reagent
NK cell isolation kit II mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-096-892 negative selection kit
NK cell isolation kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-092-657 negative selection kit
Plate reader Biorad iMark Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3
Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate Corning, MA, USA 2797

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References

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Ein Farbtest, die speziell Maßnahmen Granzyme B Proteolytische Aktivität: Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
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Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).More

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).

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