Introduction
Granzymes är en familj av serinproteaser som finns i de sekretoriska lysosomer naturliga mördarceller (NK) och cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) en. Fem olika granzymes existerar hos människor (A, B, H, K och M), och tio i möss (A - G, K, M och N) 2,3. Granzym A och Granzyme B (GzmA, GzmB) är den mest förekommande och har undersökts i den mänskliga och gnagare inställning.
Den klassiska funktionen för GzmB är induktionen av apoptos i målceller utförda i samband med det porbildande protein perforin, som tillåter att granzym att komma åt målcellen cytosol 4. Fastän GzmB uttryck entydigt hittas i cytotoxiska lymfocyter, har nyligen gjorda studier har adresse en mängd andra GzmB-uttryckande celltyper, inklusive men inte begränsat till keratinocyter 5, basofiler 6, mastceller 7, plasmacytoid dendritceller 8, och B-celler 9, 10.I detta sammanhang har icke-apoptotiska GzmB funktioner avslöjat allt från deltagande i inflammatoriska processer, vävnadsombildning och andra immun fastigheter 11-14.
Med tanke på att en bredare biologisk roll har föreslagits för GzmB än tidigare misstänkt, forskare kräver tillförlitliga och specifika verktyg för sin upptäckt. Av fördel är GzmB specifika krav på att klyva på karboxylsidan av asparaginsyrarester, en fastighets unika bland eukaryota serinproteaser 15. Mus, människa och råtta GzmB är strukturellt mycket lika, men den förlängda substratspecificitet av mus GzmB skiljer subtilt från den hos både människa och råtta 16, vilket innebär att vissa generiska substrat med Asp i terminalen (P1) kan klyvas på ett effektivt sätt genom GzmB från alla tre arter, medan andra substrat med mer komplicerade sekvenser uppströms i P1 kan ge vitt olika resultat. I både det förflutna och nyare literature, har detta faktum orsakat stor förvirring och feltolkningar av den biologiska betydelsen av vissa experimentella fynd, trots noggrant kontrollerad, har kinetiska studier försökt korrigera situationen 17.
I denna uppsats har vi försökt att belysa dessa punkter med hjälp av två kommersiellt tillgängliga substrat, nämligen Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl och N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilid. De två reagenser gör genererar olika reaktiva grupper efter klyvning (en fri sulfhydrylgrupp kontra ett fluorescerande fri paranitroanilid), men detta har ingen effekt oavsett om proteolytisk klyvning. Den beskrivna protokollet är en modern anpassning av en mycket gammal protokoll 18, men bör hjälpa utredarna att använda de olika GzmB substrat lämpligt, och samtidigt ge en metodisk ram för detektering av aktiviteten hos andra granzymes såsom GzmA och GzmH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Mjältar härledda från möss (6-10 veckor gamla) och alla djurförsök utfördes enligt djuretiska riktlinjer Peter MacCallum Cancer Centre (E486).
1. Beredning av prover.
- Beredning av aktiverade mus NK-celler.
- Isolera primära naiva NK-celler från encelliga suspensioner av mjälte i C57BL / 6 eller B6.GrzmB - / - (GzmB gen null) möss genom negativ selektion med användning av kommersiellt tillgängliga kit.
- Följ tillverkarens protokoll. I korthet, magnetiskt märka "icke-NK" celler såsom T och B-celler, dendritiska celler, granulocyter, makrofager och röda blodkroppar med användning av biotin-konjugerade antikroppar mot deras specifika ytmarkörer. Använd magnetisk separation med anti-biotin-pärlor för att utarma "icke-NK" celler.
- Kultur isolerade NK-celler under 5-7 dagar i medium innehållande IL-2 (1000 U / ml) vid 700000 celler / ml i 24-brunnsplattorvid 37 ° C.
- Alternativt aktiverade användning T-celler 19, primärt antigen-begränsade CTL från OT1 T-cellreceptor-transgena möss 20, CTL genererade i blandade lymfocytkulturer 21 eller supernatanter från aktiverade NK-celler för att bestämma aktiviteten hos utsöndrad GzmB 19.
- Underhåll av human NK cellinje och isolering av primära NK-celler.
- Bibehåll humana NKi leukemi (YT-celler) i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium kompletterat med 10% fetalt kalvserum. Alternativt, kan det renas primära NK-celler från det perifera blodet hos friska försökspersoner och stimulera för 2-3 dagar i medium innehållande IL-2 vid 100 U / ml såsom beskrivits tidigare 22.
- Generering av cellysat.
- Tvätta cellerna tre gånger i PBS (pH 7,4), därefter suspendera i Nonidet P-40 lyseringsbuffert (0,1% NP-40, 250 mM NaCl, 25 mM Hepes, 2,5 mM EDTA). Helst lysera minst 5 x 10 6 7 T celler i 100 pl buffert. Lägg inte till proteashämmare, så många är irreversibla hämmare av serinproteaser, särskilt tryptaser såsom GzmA. Inkubera på is under 20 min och sedan pelletera kärnor i en mikrocentrifug vid 15.000 xg under 10 minuter. Kassera den nukleära pelleten och överför supernatanten till ett nytt rör.
- Bestäm proteinkoncentrationen av lysaten.
- Använd en kommersiellt tillgänglig protokoll val såsom Bradford eller bicinkoninsyra (BCA) och bestämma proteinkoncentrationen. Se till att koncentrationen är ~ 2 mg / ml minimum. Förvara lysat vid -20 ° C fram till användning (granzym aktivitet är stabil under flera månader vid -20 ° C).
2. Granzyme B Activity Assay
- Beredning av reagens
- Förbered en 10 mM lager av substrat (Boc-AAD-S-Bzl eller Ac-IEPD-pNA) i DMSO (~ 5 mg / ml) och förvara i alikvoter vid -20 & #176; C. Förbered en arbetsutspädning nyligen och kasseras efter varje dag, som Boc-AAD-S-Bzl hydrolyserar delvis på lagring i DMSO.
- Bered en 250 mM stam av den kolorimetriska reagens (5,5'-ditio-bis (2-nitrobensoesyra), DTNB) i DMSO (0,09 g / ml) och förvaras vid -20 ° C. Förbered en ny arbetsdag späd varje dag. Detta reagens är endast för substrat med SBzl indikatorgrupper, inte PNA.
- Gör upp färsk buffert (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl2, pH 7,3) var 2-3 veckor.
- Bring DTNB och syntetiska substrat till rumstemperatur. Späd substrat (01:16, t.ex. 100 ^ i 1,6 ml buffert) och DTNB (1: 250, t.ex. 10 pl i 2,5 ml buffert) och blanda väl.
- Späd minst 100 ng protein lysat av varje prov i buffert till en slutlig volym av 160 | il. Med hjälp av en flerkanalspipett lägga 50 ^ per brunn i tre exemplar (~ 33,3 ng / brunn) i en '' U '' bottom vinyl 96-brunnar.Inkludera en "enbart buffert" kontroll (även i tre exemplar).
- Lägg 100 fil utspätt DTNB till prover / buffertkontroll (hoppa över detta steg när du arbetar med Ac-IEPD-pNA.
OBS: Klyvning av Ac-IEPD-pNA från GzmB släpper direkt fluorogent pNA (Figur 4B). - Använd en flerkanalspipett att snabbt lägga 50 ìl av utspädda substrat till varje uppsättning av tre exemplar, som börjar med bufferten då eventuella negativa kontroller och slutar med förväntade positiva prover.
- Placera plattan i plattläsaren. Mät Asp-as-aktivitet genom hydrolys av Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA i en mikroplattläsare vid OD 405 nm. Använd en kinetisk analysprotokoll, ta 25 läsningar, var 15 sek (ca 6 min totala läsning tid).
- Använd absorbansavläsningarna som genereras vid varje tidpunkt för att manuellt beräkna hastigheten för substratklyvning om plattan-läsarens programvaran inte kan generera ett värde för Vmax.
3. Analys av DaTA
OBS: De data som genereras presenteras som maximal hastighet, som definieras som förändring av OD med tiden (mOD / min).
- För att analysera data, bestämma den maximala hastigheten för substratklyvning, vilket beräknas från förändringstakten i absorbans. Gör detta automatiskt med plattläsarprogram, som typiskt har denna möjlighet.
- Alternativt efter visa de kinetiska tomter av förändringen i absorbans, som uppkommer under den kinetiska analysen på plattläsaren, manuellt välja de datapunkter som ger den brantaste rak linje. För de flesta analyser den högsta skattesatsen uppnås inom de första 2 min av analysen.
- Subtrahera det initiala OD läsning från den högsta OD läsning på denna raka linje och dividera med tidsintervallet. Överför rådata till Microsoft Excel / Graph pad för statistisk analys och grafisk display.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Boc-AAD-S-Bzl substrat är specifik för GzmB
Den serinproteas GzmB är en huvudbeståndsdel av cytotoxiska lymfocyter (CTL och NK-celler) och är främst ansvarig för inducering snabb apoptotisk död i målceller, såsom virusinfekterade eller transformerade celler. Detta beror till stor del dess substrat preferens för klyvning efter vissa specifika aspartat rester i utvalda proteiner, ett attribut delas med kaspaser, som också klyver efter aspartatgrupper rester men är från en annan klass av proteaser, cystein proteas familjen 15. Denna skillnad i den proteolytiska mekanismen betyder att AAD-SBzl inte kan klyvas genom någon kaspas. GzmB expression induceras efter aktivering av cytotoxiska lymfocyter och enzymatisk aktivitet kan övervakas i cellysat framställda från dessa celler (figur 1). Tillgången på granzym gen knockoutmöss har tillåtit oss att fastställa attdet syntetiska peptidsubstratet Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) - tiobensyl ester (S-Bzl) specifikt hydrolyseras av GzmB. Robust klyvning av det syntetiska substratet kan mätas i ett cellysat från B6 primära NK-celler, men inte i B6.GrzmB - / - NK-celler. Som en kontroll, den proteolytiska aktiviteten hos GzmA, som har trypsinliknande (tryptas) substratspecificitet och är närvarande i båda lysaten var ekvivalent, mätt genom hydrolys av N-α-CBZ-L-lysin (BLT) -S- Bzl.
Artspecifik GzmB substratigenkänningssekvens
Tidiga studier som beskriver potentiella mål cellmolekyler spjälkas av GzmB orsakade viss förvirring tills det visade sig att mus och människa GzmB har en något förändrad substratigenkännings preferens, som styrs av så många som 8-10 rester kartläggning kring P1 aspartat 23. Detta var särskilt tydligt i studier som undersökts klyvning av enbart BH3 pro-apoptotiskamolekyl bud, vilket kan klyvas effektivt av människor, men i mycket mindre effektivt av musen GzmB. I intakta celler, resulterar denna skillnad i aktiveringen av olika vägar med celldöd, med humant GzmB arbetar företrädesvis genom den mitokondriella vägen, och mus GzmB via direkt kaspasaktivering. Analys av tetrapeptidsekvenser visade att mänskligt men inte musen GzmB kunde klyva efter sekvensen IEPD, vilket matchar igenkänningssekvens i både människa och mus bud 16. I både litteraturen och i kommersiell produkt katalogiserar tetrapeptiden substratet, har Ac-IEPD-pNA använts generiskt för att testa med avseende på GzmB aktivitet (Tabell 1). Det står nu klart att medan både människa och mus kan klyva Boc-AAD-S-Bzl, med mycket liknande effektivitet, mus GzmB i NK cellysat låter att effektivt hydrolyserar Ac-IEPD-pNA (Figur 2). Däremot minskar mängden humant NK YT lysat från 30 ^ g till 10 | ig fortfarande resulted i tillräcklig GzmB att hydrolysera Ac-IEPD-pNA-substrat (Figur 3).
Figur 1:. Granule enzymaktivitet i murina NK-celler Granzyme B (övre panelen) och granzym A (undre panelen) aktivitet i NK cellysat från B6 vildtyp och B6.GrzmB knockoutmöss bestämdes av den maximala hastigheten för hydrolys av Boc- Ala-Ala Asp-S-Bzl och N-α-CBZ-L-lysin-S-Bzl peptidsubstrat. Data visar en representant experiment utförs i tre exemplar (n> 3).
Figur 2:. Arter Specifik hydrolys av Ac-IEPD- pNA-substrat mus och människa GzmB hydrolyserat Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl lika men bara mänskligt GzmB hydrolyserat Ac-IEPD-pNA. Den humanaNK-cellinjen YT och primär IL-2 aktiverade mus NK användes som en källa för GzmB. Stapeldiagram visar ett representativt experiment utfört i trippelprover (n> 3).
Figur 3:. Minskning av proteinkoncentration inte upphäva GzmB aktivitet Hydrolyshastigheten av Ac-IEPD-pNA inducerad av humant GzmB jämfördes med användning av minskande proteinkoncentration av YT NK cellinje lysat. Experiment representant för n> 3.
Figur 4:. Grafisk avbildning av principen analysen GzmB klyver substraten Boc-AAD-S-Bzl (A) och Ac-IEPD-pNA (B) efter P1 aspartat därigenom frisätta antingen en bensylmerkaptan, som i sin tur interagerar med DTNB att bilda ett fluorogent 3-karboxi-4-nitrofenoxid jon (A), eller genom att direkt släppa p-nitroanilid, vilket är en kromofor själv (B). Fluorescens utsläppen av båda dessa molekyler kan detekteras vid 405 nm.
| Serinproteas | Substrat | Aktivitet |
| Granzyme A | N-α-CBZ-L-lysin (BLT) tiobensyl ester (S-Bzl) | Tryptas 22 |
| Granzyme B | 1. Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) -S-Bzl | ASPase 14 |
| 2. N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilid (pNA) | ||
| Granzyme H | Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl | Chymas 23 |
Tabell 1:. Förteckning över substrat tillgängliga för detektering av granzym aktivitet Tryptas aktivitet GzmA kan detekteras genom hydrolys av den specifika N-α-CBZ-L-lysin (BLT) tiobensyl ester (S-Bzl) . GzmB specifikt klyver efter aspartat rester (Asp-ASE), som kan utvärderas genom hydrolys av antingen Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) -S-Bzl (upptäcker mus och människa GzmB aktivitet), eller N-acetyl-Ile- Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilid (pNA) (detekterar bara mänskligt GzmB aktivitet). Chymas aktivitet GzmH bedöms genom klyvning av Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historiskt de granzymes identifierades som viktiga effektormolekyler av cytotoxiska lymfocyter (CTL och NK-celler) som kan inducera en snabb apoptotisk död i målceller. Detta berodde i huvudsak på grund av inverkan av GzmB som klyvs målsubstrat molekyler vid aspartat (D) rester och därmed kunde aktivera kaspaskaskaden både klyvnings pro-kaspaser, liksom flera av sina nedströms mål. Dock är det nu uppskattat att GzmB uttryck inte är begränsat till lymfoida cytotoxiska celler och dess funktion kan förlängas långt utöver målcellen erkännande och celldöd.
I denna uppsats beskriver vi ett protokoll som möjliggör detektion av aktiva GzmB i cellysat härrör från både mus och humana CTL / NK-celler genom att använda en enkel kolorimetrisk analys. Enkelheten och specificitet denna analys bestämd genom dessa resultat tillåter tillämpningen av detta protokoll för att undersöka GzmB i cellulära prover från annan källas. Det är emellertid viktigt att de cellulära lysaten har en proteinkoncentration av åtminstone 2 mg / ml, och lämpliga positiva och negativa kontroller är inkluderade i det experimentella protokollet. Specificiteten av Boc-AAD-SBzl reagens för GzmB framgår av bristen på substrat-klyvnings aktivitet i lysatet härrör från GzmB null djur, eftersom verksamheten är helt förlorad (Figur 1). I eventuella framtida studier rekommenderas att en sådan negativ kontroll (s. Protokoll avsnitt 1.1) används för att verifiera att all verksamhet upptäcks är specifik för GrzB. (Anmärkning: Även som grB, kaspaser har en absolut specificitet för klyvning vid aspartat rester i P1 positionen, föredragna substrat är tetrapepetides där P4 aminosyran är också en kritisk determinant av specificitet 24.). Om prövningen rekombinant material det aktiva stället serin till alanin muterat proteas (inaktivt proteas ställdes på exakt samma sätt som det aktiva enzymet) bör vara included, och detta är särskilt viktigt om analys icke däggdjurs cellysat, särskilt de från jäst eller bakterieceller.
Med användning av ovanstående protokoll för analyser av däggdjursceller är GzmB aktivitet inte negativt av närvaron av endogena cognate serinproteasinhibitorer (Serpins), som kan vara kraftigt uppreglerad i aktiverade cytotoxiska lymfocyter (CL) 25, såväl som i celler härledda från icke-immuna vävnader, inklusive transformerade celler 26. Den cytosoliska serpinB9, (tidigare PI-9) är mycket specifikt för mänsklig GzmB; Men i musen, finns det flera nära men les specifika ortologer varav serpin b9, eller SPI-6 har betydande hämmande aktivitet för mus GzmB 27. Fastän lys i NP-40 buffert kan vara tolerant för generering av en irreversibel interaktion mellan GzmB och serpin, inkubering vid 37 ° C krävs för optimal komplexbildning 28. Vi vill inte detektera komplexbildning i the lysat med Western blöt, vilket skulle resultera i förlust av proteasaktivitet. Detta protokoll utförs vid typiska omgivande laboratorietemperatur, upp till ~ 22 ° C.
Från mer än 20 års erfarenhet som utför dessa analyser har vi funnit att den kommersiella källan till Boc-AAD-SBzl reagens är av yttersta vikt för att få konsekventa, känsliga och tillförlitliga resultat. Vi rekommenderar endast leverantören vi har refereras, även om andra kommersiella källor är också lämpliga för substraten som krävs för att detektera aktiviteten hos andra granzymes. Det protokoll som beskrivits i detta dokument kan lätt anpassas för att bestämma proteasaktivitet av andra granulat serinproteaser genom hydrolys av syntetiska peptidsubstrat med en lämplig igenkänningssekvens som anges i tabell 1. Den N-α-CBZ-L-lysin-S- Bzl substratet kan användas för att detektera tryptas aktiviteten av både GzmA i mus och human CL och teoretiskt GzmK i mus CL. Även GzmK mRNA uttryck har visats av RT-PCR i mördarceller genererade från GzmAB gen knockoutmöss som svar på influensa peptider 29, är vi inte medvetna om GzmK proteasaktivitet har rapporterats i denna eller någon annan fysiologiskt relevant sammanhang. Aktiviteten hos antingen rekombinant human GzmH eller proteaset renades från NK-celler, kan bedömas med Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl 30, är det emellertid inte möjligt att tillskriva hydrolys av detta substrat specifikt till denna granzym i cellysat. Lymfocyter innehåller ett antal andra endolysosomal proteaser såsom katepsiner, som också kommer att ha kymotrypsinliknande (chymas) aktivitet. I musen är GzmH genen ersätts av ett kluster av gener (Gzms CF) alla spås ha liknande (chymas) aktivitet.
Även människans GzmB befanns effektivt klyva BH3-endast pro-apoptotiska molekyl bud, och därmed direkt engagera mitokondrielladödsvägen 31, till synes motstridiga resultat ursprungligen erhölls med mus GzmB. Denna förvirring löstes genom eleganta studier av ett antal utredare, vilket fastställt att det föredragna substratigenkänningssekvens skilde mellan mus och människa (och råtta) GzmB, trots den höga graden (~ 80%) av den totala sekvenshomologi av proteaser 16, 17,23. Den optimala igenkänningssekvensen för humant GzmB är I / V, E / M / Q, P / Xaa (S / T) och D i P1 positionen medan det för mus GzmB det är L / I / V, E, F / Y / Q, D 16,17. Den stora skillnaden var på P2 positionen, som P särskilt inte tolereras av mus GzmB, därav musen bud (IEPD 75) klyvningsställe skulle inte rymmas i GzmB substratbindande kluven. Dessutom de syntetiska peptidsubstraten IEPD-PNA, rutinmässigt beskrivs som specifik för GzmB och IETD-PNA, dåligt hydrolyseras med musen GzmB. Vi har ytterligare befäst konstaterandet av andra 23 använder recombinant granzymes att människans GzmB, men inte GzmB närvarande i mus NK och CTL hydrolyserar IETD-pNA och IEPD-pNA. Et al. Kaiserman 17 jämfört klyvningsaktiviteten av rekombinant humant och mus grB produceras i Pichiapastoris, använder Boc-AAD-SBzl med Ac-IETD-PNA substrat. Likaså fann författarna att medan båda enzymerna kluvna Boc-AAD-SBzl med jämförbar effektivitet, hydrolys av Ac-IETD-pNA vid musen grB var 30-faldigt mindre effektiv. Medan T och P (liksom S) i P2 läget är att föredra av mänsklig GzmB, är de inte tolereras musen GzmB. Däremot har vi tydligt visat jämförbar GzmB aktivitet i både humana och mus NK cellysat använder mer generiska Boc-AAD-SBzl reagens. Emellertid kunde endast mänsklig GzmB aktivitet detekteras med IEPD-pNA reagens.
Tillsammans dessa fynd belysa det faktum att skillnaderna i den fina specificiteten för GzmB av olika arter kan ha en stor inverkan på hur man väljerett lämpligt substrat för in vitro-analys. Sammanfattningsvis, om upptäckt av mus, människa eller råtta GzmB aktivitet undersöks, är Boc-AAD-SBzl underlaget för valet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SMSB05 | Granzyme B substrate (mouse and human) |
| Ac-IEPD-pNA | SM Biochemicals LLC, CA | SMPNA009 | Granzyme B substrate (only human) |
| N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl | Sigma-Aldrich | C3647 | Granzyme A substrate |
| Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SB025 | Granzyme H substrate |
| 5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Sigma-Aldrich | D8130 | DTNB, Ellman’s Reagent |
| NK cell isolation kit II mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-892 | negative selection kit |
| NK cell isolation kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-657 | negative selection kit |
| Plate reader | Biorad iMark | Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3 | |
| Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate | Corning, MA, USA | 2797 |
References
- Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).
- Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).
- Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. , (2009).
- Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).
- Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).
- Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).
- Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).
- Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. , (2009).
- Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).
- Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).
- Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).
- Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).
- Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).
- Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).
- Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).
- Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).
- Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).
- Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
- Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).
- Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).
- Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).
- Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).
- Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).
- Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).
- Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).
- Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).
- Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).
- Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
- Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).
- Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).
- Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).
