Introduction
Granzimi sono una famiglia di serina proteasi presenti nei lisosomi secretori di natural killer (NK) e dei linfociti T citotossici (CTL) 1. Esistono cinque differenti granzimi nell'uomo (A, B, H, K e M), e dieci nei topi (A - G, K, M e N) 2,3. Granzyme A e B Granzyme (GzmA, GzmB) sono i più abbondanti e sono stati ampiamente studiati nel contesto umano e roditori.
La funzione classica GzmB è l'induzione di apoptosi nelle cellule bersaglio eseguite in combinazione con la proteina perforina formano pori, che permette di accedere granzyme citosol cellula bersaglio 4. Anche se l'espressione GzmB è inequivocabilmente trova in linfociti citotossici, studi recenti stanno affrontando una serie di altri tipi di cellule-GzmB esprimono, compreso ma non limitato ai cheratinociti 5, 6 basofili, mastociti 7, cellule dendritiche plasmacitoidi 8, e le cellule B 9, 10.In questo contesto, le funzioni GzmB non-apoptotici sono stati rivelati vanno dalla partecipazione a processi infiammatori, rimodellamento dei tessuti e altre proprietà immunomodulanti 11-14.
Dato che un ruolo biologico più ampio è stato proposto per GzmB quanto precedentemente sospettato, ricercatori richiedono strumenti affidabili e specifici per la sua individuazione. Di vantaggio è requisito specifico di GzmB per fendere sul lato carbossilico di residui di acido aspartico, una struttura unica tra serina proteasi eucariotiche 15. Mouse, umano e di ratto GzmB sono strutturalmente molto simile, tuttavia la specificità di substrato di topo GzmB estesa differisce leggermente da quella di umano e di ratto 16, il che significa che certi substrati generici con Asp al terminale (P1) possono essere scissi efficientemente GzmB da tutte e tre le specie, mentre altri substrati con sequenze più complesse monte di P1 può dare risultati molto variabili. Sia nel passato e li più recenteterature, questo fatto ha provocato una notevole confusione e cattiva interpretazione del significato biologico di alcuni risultati sperimentali, anche se attentamente controllato, studi cinetici hanno cercato di correggere la situazione 17.
In questo articolo abbiamo cercato di illustrare questi punti con due substrati disponibili in commercio, vale a dire Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl e N-acetil-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilide. I due reagenti fare generare diversi gruppi reattivi a seguito di scissione (un sulfidrilico gratuito contro un paranitroanilide gratuito fluorescente), ma questo non ha alcun effetto su qualunque taglio proteolitico. Il protocollo descritto è un adattamento moderno di un protocollo molto vecchio 18, ma dovrebbe aiutare gli investigatori di utilizzare i diversi substrati GzmB adeguatamente, fornendo inoltre un quadro metodologico per rilevare l'attività di altri granzimi, come GzmA e GzmH.
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Protocol
NOTA: milze erano derivate da topi (6-10 settimane di età) e tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida etiche degli animali del Centro Cancer MacCallum Peter (E486).
1. Preparazione dei campioni.
- Preparazione delle cellule del mouse NK attivate.
- Isolare cellule NK naive primarie da cella singola sospensioni dei milza di C57BL / 6 o B6.GrzmB - / - (GzmB gene null) topo di selezione negativa utilizzando kit disponibili in commercio.
- Seguire il protocollo dei costruttori. In breve, magneticamente etichettare "non-NK" cellule come le cellule T e B, cellule dendritiche, granulociti, macrofagi e globuli rossi utilizzando anticorpi biotina-coniugato contro i loro marcatori di superficie specifici. Utilizzare separazione magnetica con perle anti-biotina deplezione delle cellule "non-NK".
- Culture isolato cellule NK per 5-7 giorni in terreni contenenti IL-2 (1.000 U / ml) a 700.000 cellule / ml in piastre da 24 pozzettia 37 ° C.
- In alternativa, l'uso attivato cellule T 19, primaria antigene-ristretto da CTL OT1 T cell receptor topi transgenici 20, CTL generati in colture miste linfocitarie 21 o supernatanti di cellule NK attivate per determinare l'attività di secreto GzmB 19.
- Mantenimento della linea di cellule NK umane e l'isolamento di cellule NK primarie.
- Mantenere leucemia umana NK (cellule YT) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium supplementato con siero di vitello fetale del 10%. In alternativa, purificare cellule NK primari da sangue periferico di soggetti sani e stimolare per 2-3 giorni in terreno contenente IL-2 a 100 U / ml 22 come precedentemente descritto.
- Generazione di lisati cellulari.
- Lavare le cellule tre volte in PBS (pH 7,4), poi sospendere Nonidet P-40 tampone di lisi (0,1% NP-40, 250 mM NaCl, 25 mM Hepes, 2,5 mM EDTA). Idealmente, lisare un minimo di 5 x 10 6 7 cellule T in 100 microlitri di buffer. Non aggiungere gli inibitori della proteasi, come molti sono inibitori irreversibili della serina-proteasi, in particolare tryptases quali GzmA. Incubare in ghiaccio per 20 minuti, e poi pellet nuclei in una microcentrifuga a 15.000 xg per 10 min. Eliminare il pellet nucleare e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
- Determinare la concentrazione di proteine dei lisati.
- Utilizzare un protocollo disponibile in commercio di scelta come, Bradford o acido bicinconinico (BCA) e determinare la concentrazione di proteine. Assicurarsi che la concentrazione è ~ 2 mg minimo / ml. Conservare lisati a -20 ° C fino al momento (attività granzyme è stabile per molti mesi a -20 ° C).
2. Granzyme B Activity Assay
- Preparazione dei reagenti
- Preparare uno stock 10 mM dei substrati (Boc-AAD-S-Bzl o Ac-IEPD-Anp) in DMSO (~ 5 mg / ml) e conservare in aliquote a -20 & #176; C. Preparare una diluizione di lavoro fresco e gettare dopo ogni giorno, come Boc-AAD-S-Bzl idrolizza parzialmente in deposito in DMSO.
- Preparare uno stock di 250 mm del reagente colorimetrico (5,5'-ditio-bis (acido 2-nitrobenzoico), DTNB) in DMSO (0,09 g / ml) e conservare a -20 ° C. Preparare una diluizione di lavoro fresco ogni giorno. Questo reagente è richiesto solo per substrati con gruppi di indicatori SBzl, non dell'Anp.
- Make up tampone fresco (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl 2, pH 7,3) ogni 2-3 settimane.
- Portare DTNB e substrati sintetici a temperatura ambiente. Diluire substrati (01:16, ad esempio 100 microlitri di 1.6 ml di tampone) e DTNB (1: 250, ad esempio, 10 ml a 2,5 ml di tampone) e mescolare bene.
- Diluire un minimo di 100 mcg di proteine lisato di ciascun campione in tampone ad un volume finale di 160 microlitri. Usando una pipetta multicanale aggiungere 50 ml per pozzetto in triplice copia (~ 33,3 mcg / pozzetto) in un '' U '' vinile bottom piastra da 96 pozzetti.Includere un "buffer-only" di controllo (anche in triplice copia).
- Aggiungere 100 ml di DTNB diluito al controllo dei campioni / tampone (saltare questo passaggio quando si lavora con Ac-IEPD-pNA.
NOTA: La scissione di Ac-IEPD-pNA dal GzmB rilascia direttamente fluorogenico pNA (Figura 4B). - Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere rapidamente 50 ml di substrati diluito per ogni set di triplicato, a cominciare con il tampone poi tutti i controlli negativi e la finitura con campioni positivi attesi.
- Posizionare la piastra nel lettore di piastre. Misurare l'attività Asp-ase per idrolisi di Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA in un lettore di micropiastre a OD 405 nm. Utilizzare un protocollo di test cinetico, prendere 25 misure, ogni 15 sec (ca. 6 min di tempo di lettura totale).
- Utilizzare le letture di assorbanza generati in ogni punto di tempo per calcolare manualmente il tasso di substrato scissione se il software della piastra-reader non può generare un valore per Vmax.
3. Analisi di Data
NOTA: I dati generati si presenta come la velocità massima, definita come il cambiamento di OD nel tempo (Mod / min).
- Per analizzare i dati, determinare il tasso massimo di substrato scissione, che viene calcolato dal tasso di variazione di assorbanza. Fate questo automaticamente utilizzando il software lettore di piastre, che in genere ha questa opzione.
- In alternativa, dopo aver visto le trame cinetiche di variazione di assorbanza, che vengono generati durante il dosaggio cinetico sul lettore piatto, selezionare manualmente i punti di dati che danno la più ripida linea retta. Per la maggior parte i test la velocità massima viene raggiunta entro i primi 2 minuti del test.
- Sottrarre la lettura OD iniziale dalla lettura OD alto su questa linea retta e dividere per l'intervallo di tempo. Trasferire i dati grezzi per pad Microsoft Excel / Graph per l'analisi statistica e la visualizzazione grafica.
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Representative Results
Il substrato Boc-AAD-S-Bzl è specifico per GzmB
Il GzmB serina proteasi è un importante costituente di linfociti citotossici (cellule CTL e NK) ed è prevalentemente responsabile per indurre una rapida morte per apoptosi nelle cellule bersaglio, come le cellule infettate da virus o trasformate. Ciò è in gran parte dovuto alla sua preferenza substrato per la scissione, dopo taluni residui aspartato specifici in proteine selezionate, un attributo condiviso con le caspasi, che tagliano anche dopo residui aspartato ma provengono da una diversa classe di proteasi, la cisteina proteasi famiglia 15. Questa differenza nel meccanismo proteolitico significa che AAD-SBzl non può essere scisso da qualsiasi caspasi. Espressione GzmB è indotta dopo l'attivazione dei linfociti citotossici e attività enzimatica può essere monitorato in lisati cellulari preparati da queste cellule (Figura 1). La disponibilità di geni granzyme topi knockout ha permesso di stabilire cheil substrato sintetico peptide Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) - thiobenzyl estere (S-Bzl) è specificamente idrolizzato da GzmB. Clivaggio robusta del substrato sintetico può essere misurata in un lisato cellulare da cellule NK primarie B6, ma non in B6.GrzmB - / - cellule NK. Come controllo, l'attività proteolitica del GzmA, che ha tripsina-simile (triptasi) specificità di substrato ed è presente in entrambi i lisati era equivalente, come misurato dalla idrolisi di N-α-CBZ-L-lisina (BLT) -S- Bzl.
Sequenza GzmB riconoscimento del substrato specie-specifico
I primi studi che descrivono i potenziali molecole cellulari bersaglio spaccati da GzmB causato una certa confusione finché è emerso che il mouse e GzmB umana hanno una preferenza riconoscimento del substrato leggermente modificato, che è dettata da ben 8-10 residui di mapping che circonda la P1 aspartato 23. Questo è stato particolarmente evidente negli studi che hanno esaminato scissione del solo BH3 pro-apoptoticoBid molecola, che può essere scisso in modo efficiente da umani, ma molto meno efficiente del mouse GzmB. In cellule intatte, questa differenza comporta l'attivazione di diversi percorsi di morte cellulare, con GzmB umana operante preferenzialmente attraverso la via mitocondriale e mouse GzmB tramite attivazione delle caspasi diretta. Analisi di sequenze tetrapeptide rivelato che umano, ma non GzmB topo poteva fendere dopo la sequenza IEPD, che corrisponde alla sequenza di riconoscimento sia in uomo e topo Bid 16. In letteratura sia in prodotto commerciale cataloghi substrato tetrapeptide, Ac-IEPD-pNA è stato utilizzato genericamente per testare l'attività GzmB (Tabella 1). E 'ormai chiaro che, mentre nello stesso tempo umana e topo può fendere Boc-AAD-S-Bzl, con efficienza molto simili, mouse GzmB in lisati cellulari NK non idrolizzare efficacemente Ac-IEPD-pNA (Figura 2). Al contrario, diminuendo la quantità di lisato umana NK YT da 30 mg a 10 mg ancora resulted in GzmB sufficiente per idrolizzare il substrato Ac-IEPD-pNA (Figura 3).
Figura 1:. Attività enzimatica granello in cellule NK murine Granzyme B (pannello superiore) e granzyme A (pannello inferiore) l'attività in lisati cellulari NK da B6 tipo selvatico e B6.GrzmB topi knockout è stato determinato il tasso massimo di idrolisi della Boc- Ala-Ala-Asp-Bzl S e N-α-CBZ-L-S-lisina-Bzl substrati peptidici. I dati rappresentano un esperimento rappresentativo eseguito in triplice copia (n> 3).
Figura 2:. Specie specifico idrolisi di Ac-IEPD- pNA substrato Mouse e GzmB umana idrolizzata Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl ugualmente ma solo GzmB umano idrolizzata Ac-IEPD-pNA. L'umanoLinea cellulare NK YT e primaria IL-2 del mouse attivato NK sono stati utilizzati come fonte di GzmB. Grafico mostra un esperimento rappresentativo eseguito in triplice copia (n> 3).
Figura 3:. Riduzione della concentrazione di proteine non abolisce l'attività GzmB Il tasso di idrolisi di Ac-IEPD-pNA indotta da GzmB umana è stata confrontata con una minore concentrazione di proteine di YT NK linea cellulare lisato. Rappresentante Esperimento per n> 3.
Figura 4:. Rappresentazione grafica del principio test unirà GzmB substrati Boc-AAD-S-Bzl (A) e Ac-IEPD-pNA (B) dopo l'aspartato P1, liberando in tal modo sia un mercaptano benzilico, che a sua volta interagisce con DTNB per formare un fluorogenico ione 3-carbossi-4-nitrofenossido (A), o direttamente rilasciando p-nitroanilide, che è un cromoforo stesso (B). Emissioni di fluorescenza di entrambe queste molecole possono essere rilevati a 405 nm.
| Serina proteasi | Substrato | Attività |
| Granzyme A | N-α-CBZ-L-lisina (BLT) thiobenzyl estere (S-Bzl) | Triptasi 22 |
| Granzyme B | 1. Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) -S-Bzl | ASPase 14 |
| 2. N-acetil-Ile-Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilide (pNA) | ||
| Granzyme H | Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl | Chimasi 23 |
Tabella 1:. Elenco dei substrati disponibili per rivelare l'attività granzyme dell'attività Tryptase di GzmA può essere rilevata mediante idrolisi della specifica N-α-CBZ-L-lisina (BLT) thiobenzyl estere (S-Bzl) . GzmB specificamente unirà dopo residui aspartato (Asp-ASE), che possono essere valutati da idrolisi di uno Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) -S-Bzl (rileva il mouse e l'attività GzmB umane), o N-acetil-Ile- Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilide (PNA) (rileva solo l'attività GzmB umana). Attività chimasi di GzmH viene valutata per scissione di Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl.
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Discussion
Storicamente i granzimi sono stati identificati come molecole effettrici chiave di linfociti citotossici (cellule CTL e NK) in grado di indurre una rapida morte apoptotica nelle cellule bersaglio. Questo è principalmente dovuto all'azione di GzmB che scisso molecole substrato bersaglio a (D) residui di aspartato e quindi era in grado di attivare la cascata caspasi da entrambi da tagliare pro-caspasi, così come molti dei loro bersagli a valle. Tuttavia, è ora apprezzato che l'espressione GzmB non è limitato alle cellule linfoidi citotossiche e la sua funzione può essere estesa ben oltre il riconoscimento cellula bersaglio e la morte cellulare.
In questo articolo descriviamo un protocollo che consente il rilevamento di GzmB attiva in lisati cellulari derivate da mouse e cellule CTL / NK umane utilizzando un semplice saggio colorimetrico. La semplicità e la specificità di questo test, come accertato da questi risultati consentono l'applicazione di questo protocollo per esaminare GzmB in campioni di cellule provenienti da un'altra fontes. Tuttavia, è importante che i lisati cellulari hanno una concentrazione proteica di almeno 2 mg / ml, e adeguati controlli positivi e negativi sono inclusi nel protocollo sperimentale. La specificità del reagente Boc-AAD-SBzl per GzmB è evidente dalla mancanza di attività substrato-scissione nel lisato derivati da animali GzmB nulli, come attività è completamente perso (Figura 1). In studi futuri è consigliabile un controllo così negativo (s. Protocollo sezione 1.1) viene usato per verificare che qualsiasi attività rilevata è specifico per GrzB. (Nota: Anche se come GrB, caspasi hanno una specificità assoluta per la scissione a residui aspartato nella posizione P1, supporti preferiti sono tetrapepetides dove l'acido P4 amino è anche un fattore determinante di specificità 24.). Se l'analisi del materiale ricombinante sito serina proteasi attiva alanina mutante (proteasi inattiva preparato esattamente nello stesso modo in cui l'enzima attivo) dovrebbe essere included, e ciò è particolarmente importante se saggiando lisati cellulari non mammiferi, in particolare quelli da lieviti o cellule batteriche.
Utilizzando il protocollo sopra per saggi di cellule di mammifero, attività GzmB non viene diminuita dalla presenza di inibitori endogeni affini serina proteasi (Serpins), che può essere notevolmente up-regolato in linfociti citotossici attivati (CL) 25, come pure in cellule derivate da tessuti non-immuni, comprese le cellule trasformate 26. Il serpinB9 citosolica, (ex PI-9) è altamente specifico per GzmB umana; tuttavia nel topo, ci sono diversi ortologhi specifici stretti ma les cui serpin b9, o SPI-6 ha una significativa attività inibitoria per il mouse GzmB 27. Sebbene in lisi NP-40 buffer può essere permissiva per generare un'interazione irreversibile tra GzmB e serpin, incubazione a 37 ° C è necessaria per la formazione del complesso 28 ottimale. Non rileviamo formazione del complesso in the lisati di Western Blot, che si tradurrebbe in una perdita di attività della proteasi. Questo protocollo viene condotta a temperatura ambiente del laboratorio tipica, fino a ~ 22 ° C.
Da più di 20 anni di esperienza di eseguire questi test abbiamo scoperto che la fonte commerciale del reagente Boc-AAD-SBzl è di massima importanza per ottenere risultati coerenti, sensibili e affidabili. Consigliamo solo fornitore che abbiamo fatto riferimento, anche se altre fonti commerciali sono adatti anche per i supporti necessari per rilevare l'attività di altri granzimi. Il protocollo descritto in questo documento può essere facilmente adattato per determinare l'attività della proteasi di altre proteasi serina granuli per idrolisi dei substrati peptidici sintetici con una sequenza di riconoscimento appropriato come elencato nella Tabella 1. La N-α-CBZ-L-lisina-S- Bzl substrato può essere utilizzato per rilevare l'attività di triptasi sia GzmA in topo e umana CL e teoricamente GzmK in topo CL. Anche se l'espressione GzmK mRNA è stata dimostrata mediante RT-PCR in cellule killer generate da GzmAB topi knockout gene in risposta a peptidi influenzali 29, non siamo a conoscenza di attività della proteasi GzmK essere stato riportato in questo o in qualsiasi altro contesto fisiologicamente rilevanti. L'attività di entrambi ricombinante GzmH umana, o la proteasi purificata da cellule NK, può essere valutata con Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl 30, tuttavia non è possibile attribuire l'idrolisi del substrato specifico per questo granzyme in lisati cellulari. Linfociti contengono un certo numero di altre proteasi endolysosomal quali le catepsine, che avrà anche chimotripsina-simili (chimasi) attività. Nel topo, il gene GzmH è sostituito da un gruppo di geni (CF) Gzms tutte previsto avere simili (chimasi) attività.
Sebbene GzmB umano è stato trovato per fendere efficacemente il BH3-only molecola pro-apoptotica Bid, e, quindi, coinvolgere direttamente il mitocondrialemorte percorso 31, a quanto pare risultati contrastanti sono stati inizialmente ottenuti con il mouse GzmB. Questa confusione è stato risolto da studi eleganti da un certo numero di ricercatori, che ha determinato che la sequenza preferita riconoscimento del substrato diversa tra topo e umano (e nel ratto) GzmB, nonostante l'elevato grado (~ 80%) di omologia complessiva sequenza delle proteasi 16, 17,23. La sequenza di riconoscimento ottimale per GzmB umana è I / V, E / M / Q, P / Xaa (S / T) e D nella posizione P1 mentre per il mouse GzmB è L / I / V, E, F / Y / Q, D 16,17. La differenza principale è nella posizione P2, come P, in particolare, non è tollerato dal mouse GzmB, quindi il mouse Bid (IEPD 75) sito di scissione non sarebbe essere ospitati dalla fessura legame substrato GzmB. Inoltre, i substrati peptidici sintetici IEPD PNA, abitualmente descritto come specifico per GzmB, e IETD PNA, sono scarsamente idrolizzati dal mouse GzmB. Abbiamo ulteriormente consolidato la constatazione fatta da altri 23, secondo reCombinant granzimi che GzmB umana, ma non GzmB presenti nel topo NK e CTL idrolizzare IETD-pNA e IEPD-pNA. Kaiserman et al. 17 confrontato l'attività scissione di ricombinante umano e topo GrB prodotto in Pichia pastoris, utilizzando Boc-AAD-SBzl con i substrati Ac-IETD PNA. Allo stesso modo, gli autori hanno trovato che, mentre entrambi gli enzimi spaccati Boc-AAD-SBzl con efficienza paragonabile, idrolisi di Ac-IETD-pNA dal mouse GrB era 30 volte meno efficiente. Mentre T e P (così come S) nella posizione P2 sono preferiti da GzmB umana, non sono tollerati topo GzmB. Al contrario, abbiamo chiaramente dimostrato l'attività GzmB paragonabile in entrambi i lisati cellulari umani e del mouse NK utilizzando il più generico reattivo Boc-AAD-SBzl. Tuttavia, solo l'attività GzmB umana poteva essere rilevato con il reagente IEPD-pNA.
Insieme, questi risultati evidenziano il fatto che le differenze di multa specificità GzmB di specie diverse possono avere un grande impatto su come scegliereun substrato per l'analisi in vitro. In sintesi, se la rilevazione di topo, l'attività GzmB umano o di ratto è indagato, Boc-AAD-SBzl è il substrato di scelta.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SMSB05 | Granzyme B substrate (mouse and human) |
| Ac-IEPD-pNA | SM Biochemicals LLC, CA | SMPNA009 | Granzyme B substrate (only human) |
| N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl | Sigma-Aldrich | C3647 | Granzyme A substrate |
| Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SB025 | Granzyme H substrate |
| 5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Sigma-Aldrich | D8130 | DTNB, Ellman’s Reagent |
| NK cell isolation kit II mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-892 | negative selection kit |
| NK cell isolation kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-657 | negative selection kit |
| Plate reader | Biorad iMark | Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3 | |
| Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate | Corning, MA, USA | 2797 |
References
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