Introduction
Granzymes היא משפחה של סרין פרוטאזות נמצאה בlysosomes ההפרשה של רוצח טבעי (NK) תאים ולימפוציטים מסוג T ציטוטוקסי (CTL) 1. חמש granzymes שונה קיימים בבני אדם (A, B, H, K ו- M), ועשרה בעכברים (- G, K, M ו- N) 2,3. Granzyme וGranzyme B (GzmA, GzmB) הם הנפוצים ביותר ונחקר בהרחבה בהגדרה האנושית ומכרסמת.
הפונקציה הקלאסית של GzmB היא האינדוקציה של אפופטוזיס בתאי מטרת להורג בשיתוף עם perforin חלבון יוצרים הנקבובית, המאפשר לgranzyme לגשת cytosol תא המטרה 4. למרות שביטוי GzmB נמצא באופן חד משמעי בלימפוציטים מסוג רעיל לתאים, מחקרים שנעשו לאחרונה שטיפול במגוון של סוגי תאים להביע GzmB אחרים, לרבות אך לא רק לקרטינוציטים 5, בזופילים 6, 7 תאי פיטום, תאים דנדריטיים plasmacytoid 8, ותאי B 9, 10.בהקשר זה, פונקציות GzmB אינן אפופטוטיים נחשפו החל מההשתתפות בתהליכים דלקתיים, שיפוץ רקמות ומאפיינים אחרים immunoregulatory 11-14.
בהתחשב בכך שתפקיד ביולוגי רחב יותר הוצע לGzmB מאשר חשדו בעבר, חוקרים דורשים כלים אמינות וספציפיים לגילויה. יתרון הוא הדרישה הספציפית של GzmB לדבוק בצד carboxyl של שאריות חומצה אספרטית, נכס ייחודיים בין פרוטאזות סרין אוקריוטים 15. עכבר, אנושי וGzmB החולדה הם מבני דומים מאוד, עם זאת סגוליות המצע המורחב של GzmB העכבר שונה בעדינות מזה של שני בני האדם והעכברים 16, מה שאומר שמצעים מסוימים גנריות עם ASP במסוף (P1) ניתן ביקעו ביעילות על ידי GzmB מכל שלושת המינים, ואילו מצעים אחרים עם רצפים מורכבים יותר במעלה הזרם של P1 עשוי לתת תוצאות משתנים באופן נרחב. בעבר ובli האחרון יותרterature, עובדה זו גרמה לבלבול ופירוש לא נכון של המשמעות הביולוגית של כמה ממצאים ניסיוניים רבים, אף על פי שמבוקרת בקפידה, מחקרים הקינטית ביקשו לתקן את המצב 17.
במאמר זה אנו בקשנו להמחיש נקודות אלה באמצעות שני מצעים זמינים מסחרי, כלומר בוק-עלא-עלא-Asp-SBzl וN-אצטיל-איל-Asp-p-nitroanilide Glu-Pro. שני ריאגנטים לעשות ליצור קבוצות תגובתי שונות הבאות מחשוף (sulphydryl חופשי מול paranitroanilide חופשי ניאון), אבל אין לכך שום השפעה על מה שמחשוף פרוטאוליטים. הפרוטוקול המתואר הוא adaption מודרנית של פרוטוקול ישן מאוד 18, אבל צריך לעזור לחוקרים להשתמש במצעי GzmB השונים כראוי, גם בעת מתן מסגרת המתודולוגית לאיתור הפעילות של granzymes האחר, כגון GzmA וGzmH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: טחולים נגזרו מעכברים (6-10 שבועות של גיל) וכל ניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות האתיקה של בעלי החיים של פיטר MacCallum מרכז הסרטן (E486).
1. הכנת דוגמאות.
- הכנת תאי NK העכבר מופעלים.
- בודד תאי NK נאיביים עיקריים מתא בודד השעיות של הטחולים של C57BL / 6 או B6.GrzmB - / - עכברים (null גן GzmB) על ידי סלקציה שלילית באמצעות ערכות זמינות מסחרי.
- עקוב פרוטוקול של היצרנים. בקצרה, מגנטי תווית תאים "הלא NK" כמו T ותאי B, תאים דנדריטיים, גרנולוציטים, מקרופאגים, תאי דם אדומים באמצעות נוגדני ביוטין מצומדות- נגד סמני המשטח הספציפיים שלהם. השתמש בהפרדה מגנטית עם חרוזים אנטי-ביוטין לרוקן תאים "הלא NK".
- תרבות מבודדת תאי NK 5-7 ימים במדיה המכילה IL-2 (1000 U / ml) ב700,000 תאים / מיליליטר בצלחות 24 גםב 37 מעלות צלזיוס.
- לחלופין, שימוש הופעל תאי T 19, CTL המוגבל אנטיגן העיקרי מעכברים מהונדסים 20 קולט תא ההארכה הזמן 1 T, CTL שנוצרו בתרבויות מעורבות הלימפוציטים 21, או supernatants מתאי NK מופעלים כדי לקבוע את הפעילות של GzmB המופרש 19.
- תחזוקה של קו אדם NK תא ובידוד של תאי NK עיקריים.
- שמור לוקמיה NK (תאי יט) בRoswell Park זיכרון מכון בינוני (RPMI) בתוספת 10% בסרום עגל עוברי. לחלופין, לטהר את תאי NK עיקריים מהדם ההיקפי של נבדקים בריאים ולעורר במשך 2-3 ימים במדיום המכיל IL-2 ב 100 U / ml כפי שתואר קודם לכן 22.
- דור של lysates תא.
- שטפו תאים שלוש פעמים PBS (pH 7.4), ואז להשעות במאגר תמוגה P-40 Nonidet (0.1% NP-40, 250 מ"מ NaCl, 25 מ"מ Hepes, 2.5 mM EDTA). באופן אידיאלי, lyse מינימום של 5 x 10 6 7 תאים T ב 100 חיץ μl. אל תוסיפו מעכבי פרוטאז, כפי שרבים הם מעכבים בלתי הפיכים של פרוטאזות סרין, ובtryptases מסוים כגון GzmA. דגירה על קרח למשך 20 דקות, ולאחר מכן גלולה את הגרעינים בmicrocentrifuge ב 15,000 XG במשך 10 דקות. זורק את הכדור הגרעיני ולהעביר את supernatant לצינור טרי.
- קבע את ריכוז החלבון של lysates.
- משתמש בפרוטוקול זמין מסחרי של בחירה כגון, ברדפורד או חומצת bicinchoninic (BCA) ולקבוע את ריכוז החלבון. ודא שהריכוז הוא ~ 2 מ"ג מינימום / מיליליטר. lysates החנות ב -20 ° C עד נדרשת (פעילות granzyme יציב במשך חודשים רבים ב -20 ° C).
2. Granzyme B פעילות Assay
- הכנת ריאגנטים
- הכן מלאי מ"מ 10 של מצעים (בוק-AAD-S-Bzl או AC-IEPD-PNA) בDMSO (~ 5 מ"ג / מיליליטר) ולאחסן בaliquots ב -20 & #176; C. הכן דילול עובד טרי וזורקים אחרי כל יום, כמו הבוק-AAD-S-Bzl hydrolyzes באופן חלקי על האחסון בDMSO.
- הכן מלאי 250 מ"מ של מגיב colorimetric (5,5'-dithio-bis (חומצת 2-nitrobenzoic), DTNB) בDMSO (0.09 גר '/ מיליליטר) ולאחסן ב -20 ° C. הכן דילול עבודה טרי בכל יום. מגיב זה נדרש רק למצעים עם קבוצות SBzl מחוון, לא הרשות הפלסטינית.
- מרכיבים את החיץ טרי (0.1M HEPES, 0.05 M MgCl 2, pH 7.3) בכל 2-3 שבועות.
- להביא DTNB ומצעים סינטטיים לטמפרטורת חדר. מצעים לדלל (01:16, למשל ב1.6 מיליליטר של חיץ 100 μl) וDTNB (1: 250, לדוגמא 10 μl ב2.5 מיליליטר חיץ) ומערבבים היטב.
- לדלל מינימום של 100 מיקרוגרם lysate חלבון של כל דגימה במאגר לנפח סופי של 160 μl. בעזרת פיפטה רבה להוסיף 50 μl לכל גם בשלושה עותקים (~ 33.3 מיקרוגרם / טוב) ב''U' 'צלחת 96-היטב ויניל התחתון.כולל "חיץ בלבד" שליטה (גם בשלושה עותקים).
- הוספה של DTNB המדולל 100 μl לשליטת דגימות / חיץ (להשמיט את הצעד הזה בעבודה עם Ac-IEPD-PNA.
הערה: מחשוף של Ac-IEPD-ידי הרשות הפלסטינית GzmB ישירות משחרר fluorogenic PNA (איור 4). - השתמש בפיפטה רבה כדי להוסיף במהירות 50 μl של מצעים מדוללים לכל סט של triplicates, החל במאגר אז כל בקרות שליליות וסיים עם דגימות חיוביות צפויות.
- מניחים את הצלחת בקורא הצלחת. למדוד את פעילות Asp-ASE ידי הידרוליזה של בוק-עלא-עלא-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-הרשות הפלסטינית בקורא microplate בננומטר OD 405. משתמש בפרוטוקול assay הקינטית, לקחת 25 קריאות, בכל 15 שניות (זמן קריאה כוללת 6 דקות בערך).
- השתמש בקריאות ספיגה שנוצרה בכל נקודת זמן כדי לחשב באופן ידני את שיעור מחשוף מצע אם התוכנה של הצלחת-הקורא לא יכולה ליצור ערך עבור Vmax.
3. ניתוח של Data
הערה: הנתונים המופקים מוצג כמהירות המרבית, מוגדר כשינוי של OD לאורך זמן (mod / min).
- כדי לנתח את הנתונים, לקבוע את השיעור המרבי של מחשוף מצע, המחושב משיעור השינוי בספיגה. לעשות את זה באופן אוטומטי באמצעות תוכנת צלחת קורא, אשר בדרך כלל יש באפשרות זו.
- לחלופין לאחר צפייה בחלקות הקינטית של שינוי בספיגה, אשר נוצר במהלך assay הקינטית על קורא הצלחת, בחר ידני נקודות נתונים שנותנים הקו הישר התלול ביותר. עבור רוב מבחני השיעור המרבי מושגת בתוך 2 דקות הראשונות של assay.
- לחסר קריאת OD הראשונית מקריאת OD הגבוהה ביותר בקו הזה ישר ולחלק את מרווח הזמן. העבר את הנתונים גולמיים לכרית Microsoft Excel / גרף לניתוח סטטיסטי ותצוגה גרפית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מצע הבוק-AAD-S-Bzl הוא ספציפי לGzmB
GzmB פרוטאז סרין הוא מרכיב עיקרי של לימפוציטים ציטוטוקסיות (תאי CTL וNK) והוא בעיקר אחראי לגרימת מוות אפופטוטיים מהיר בתאי מטרה, כגון תאים או הפך נגוע בנגיף. זה נובע במידה רבה העדפת המצע שלה למחשוף אחרי שאריות aspartate ספציפיות מסוימות בחלבונים שנבחרו, תכונה משותפת עם caspases, שגם לדבוק אחרי שאריות aspartate אבל הם ממעמד שונה של פרוטאזות, משפחת פרוטאז ציסטאין 15. הבדל במנגנון proteolytic משמעות הדבר הוא כי AAD-SBzl לא ניתן ביקע ידי כל caspase. ביטוי GzmB מושרה לאחר הפעלה של לימפוציטים מסוג רעיל לתאים ופעילות האנזימטית יכול להיות במעקב בlysates התא שהוכן מהתאים אלה (איור 1). הזמינות של עכברי נוקאאוט גן granzyme אפשרה לנו לקבוע כיהמצע הסינתטי פפטיד בוק-עלא-עלא-ASP (AAD) - thiobenzyl אסתר (S-Bzl) הוא מיובש במיוחד על ידי GzmB. מחשוף חזק של המצע הסינתטי ניתן למדוד בlysate תא מתאי NK העיקריים B6, אך לא בB6.GrzmB - / - תאי NK. כביקורת, פעילות מפרקי החלבונים של GzmA, שבו יש סגוליות מצע כמו טריפסין (tryptase) ונמצאת בשני lysates היה שווה ערך, כפי שנמדד על ידי הידרוליזה של N-α-CBZ L- ליזין (BLT) -S- Bzl.
רצף הכרת מצע GzmB מינים ספציפיים
מחקרים מוקדמים המתארים מולקולות תא היעד פוטנציאליות ביקעו ידי GzmB גרמו לקצת בלבול עד שהתברר שיש לי עכבר וGzmB אדם העדפת הכרת מצע שונה מעט, המוכתבת על ידי רב כמו 8-10 שאריות מיפוי מקיף את P1 aspartate 23. זו בלטה במיוחד במחקרים שבדקו מחשוף של פרו-אפופטוטיים BH3 רק-הצעה מולקולה, אשר יכול להיות ביקע ביעילות על ידי אדם, אבל הרבה פחות ביעילות על ידי GzmB עכבר. בתאים שלמים, הבדל זה גורם להפעלה של מסלולי מוות של תאים שונים, עם GzmB אדם הפועל באופן מועדף במסלול של המיטוכונדריה, וGzmB עכבר באמצעות הפעלת caspase ישירה. ניתוח של רצפי tetrapeptide גילה כי GzmB עכבר אנושי, אבל לא הצליח לדבוק לאחר הרצף IEPD, התואם את רצף ההכרה בשני בני אדם ועכבר הצעה 16. בשתי הספרות ובמוצר מסחרי קטלוגים מצע tetrapeptide, Ac-IEPD-PNA נעשה שימוש באופן גנרי לבדיקת פעילות GzmB (טבלת 1). ברור כעת כי בעוד שני בני אדם ועכבר יכולים לדבוק בוק-AAD-S-Bzl, עם יעילות דומה מאוד, GzmB העכבר בlysates תא NK אינו Ac-IEPD-PNA יעילות hydrolyse (איור 2). בניגוד לכך, להקטין את כמות lysate NK יט אדם מ -30 מיקרוגרם עד 10 מיקרוגרם עדיין resulteד בGzmB מספיק כדי hydrolyse מצע Ac-IEPD-PNA (איור 3).
איור 1:. פעילות אנזים גרגיר בתאי NK העכבריים Granzyme B (פנל עליון) וgranzyme (פנל תחתון) פעילות בlysates תא NK מwildtype B6 והעכברים נוקאאוט B6.GrzmB נקבעו על ידי השיעור המרבי של הידרוליזה של Boc- עלא-עלא Asp-S-Bzl וN-α-CBZ L- ליזין-S-Bzl מצעי פפטיד. הנתונים מתארים ניסוי נציג אחד בוצע בשלושה עותקים (n> 3).
איור 2:. הידרוליזה מינים ספציפית של Ac-IEPD- PNA מצע העכבר וGzmB אדם מיובש בוק-עלא-עלא-Asp-S-Bzl באותה מידה, אבל רק GzmB אדם מיובש Ac-IEPD-PNA. האדםשורת תאי NK יט והעכבר עיקרי מופעל IL-2 NK שמשו כמקור לGzmB. גרף עמודות מציגה ניסוי נציג אחד בוצע בשלושה עותקים (n> 3).
איור 3:. הפחתה בריכוז חלבון לא בטלה פעילות GzmB השיעור של הידרוליזה של Ac-IEPD-PNA הנגרמת על ידי GzmB האנושי הושווה באמצעות ריכוז חלבון ירידה של lysate שורת תאי NK יט. נציג ניסוי עבור n> 3.
איור 4:. תיאור גרפי של עיקרון assay דבק GzmB מצעי הבוק-AAD-S-Bzl () וAc-IEPD-PNA (B) לאחר aspartate P1, שחרור וכך גם mercaptan נזיל, אשר בתורו אינטראקציה עם D TNB כדי ליצור יון fluorogenic 3-carboxy-4-nitrophenoxide (), או ישירות על ידי שחרור p-nitroanilide, שהוא עצמו chromophore (B). פליטת הקרינה של שני מולקולות אלה יכול להיות מזוהה ב 405 ננומטר.
| פרוטאז סרין | מצע | פעילות |
| Granzyme | N-α-CBZ L- ליזין (BLT) thiobenzyl אסתר (S-Bzl) | Tryptase 22 |
| Granzyme B | 1. הבוק-עלא-עלא-ASP (AAD) -S-Bzl | 14 ASPase |
| 2. N-אצטיל-איל-Glu-Pro-Asp -p-nitroanilide (IEPD) (PNA) | ||
| Granzyme H | Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl | Chymase 23 |
s = "jove_content"> טבלת 1:. פעילות רשימה של מצעים זמינים עבור זיהוי של פעילות granzyme tryptase של GzmA יכולה להיות מזוהה על ידי הידרוליזה של N-α-CBZ L- ליזין הספציפי (BLT) thiobenzyl אסתר (S-Bzl) . GzmB במיוחד דבק אחרי שאריות aspartate (ASP-ASE), אשר ניתן להעריך על ידי הידרוליזה של שני בוק-עלא-עלא-ASP (AAD) -S-Bzl (מזהה עכבר ופעילות GzmB אדם), או N-אצטיל-Ile- Glu-Pro Asp (IEPD) -p-nitroanilide (PNA) (מזהה פעילות GzmB אדם בלבד). פעילות Chymase של GzmH מוערכת על ידי מחשוף של SUC-Phe-Leu-Phe-S-Bzl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מבחינה הסטורית granzymes זוהו כמולקולות מפעיל עיקריות של לימפוציטים מסוג רעיל לתאים (תאי NK וCTL) מסוגל גרימת מוות אפופטוטיים מהיר בתאי מטרה. זה היה בעיקר בגלל הפעולה של GzmB, שהבקיעה מולקולות מצע היעד בaspartate שאריות (ד ') ובכך הייתה מסוגל להפעיל את מפל caspase על ידי שני פרו-caspases ביקוע, כמו גם כמה מהיעדים במורד הזרם שלהם. עם זאת, הוא העריך כי עכשיו ביטוי GzmB אינו מוגבל לתאי הלימפה ציטוטוקסיות ותפקודו ניתן להאריך גם מעבר להכרת תא המטרה ומוות של תאים.
במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המאפשר זיהוי של GzmB הפעיל בlysates התא נבע הן מהעכבר ותאי CTL / NK אנושיים באמצעות assay colorimetric אחד פשוט. הפשטות והספציפיות של assay זה כהוברר על ידי ממצאים אלה מאפשרים היישום של פרוטוקול זה לבחון GzmB בדגימות סלולריות ממקור אחרs. עם זאת, חשוב שיש לי lysates הסלולרי ריכוז חלבון של מיליליטר / לפחות 2mg, ובקרות חיוביות ושליליות מתאימות כלולות בפרוטוקול הניסוי. הסגוליות של מגיב הבוק-AAD-SBzl לGzmB ניכר מחוסר פעילות מצע-מחשוף בlysate מקורם בבעלי חי null GzmB, כפעילות היא אבודה לחלוטין (איור 1). בכל מחקרים עתידיים מומלצת ששליטה שלילית כגון (ים. סעיף פרוטוקול 1.1) משמשת כדי לוודא שכל פעילות שזוהתה היא ספציפית לGrzB. (הערה: למרות שכמו GRB, יש לי caspases סגוליות מוחלטת למחשוף בשאריות aspartate בעמדת P1, מצעים מועדפים הם tetrapepetides בי חומצת אמינו P4 היא גם הקובע קריטי של הספציפיות 24.). אם בוחן חומר רקומביננטי סרין האתר הפעיל לפרוטאז המוטציה אלאנין (פרוטאז לא פעיל מוכנים באותה הדרך בדיוק כפי שהאנזים הפעיל) צריכה להיות included, וזה חשוב במיוחד אם מנסה לאמוד lysates תא שאינו יונקים, במיוחד אלה משמרים או תאי חיידקים.
השימוש בפרוטוקול לעיל למבחנים של תאי יונקים, פעילות GzmB לא פחתה על ידי הנוכחות של מעכבי פרוטאז סרין מקור אנדוגני (serpins), שיכול להיות מאוד מוסדר עד-בלימפוציטים מסוג מופעל ציטוטוקסיות (CL) 25, וכן בתאים שמקורם מרקמות שאינן חיסוניים, כוללים תאים הפכו 26. SerpinB9 cytosolic, (לשעבר PI-9) הוא מאוד ספציפי לGzmB האנושי; עם זאת בעכבר, יש כמה orthologues קרוב אבל les הספציפי שB9 סרפין, או SPI-6 יש פעילות מעכבת משמעותית לGzmB עכבר 27. למרות תמוגה בNP-40 חיץ יכולה להיות מתירנית ליצירת אינטראקציה בלתי הפיכה בין GzmB וסרפין, דגירה על 37 מעלות צלזיוס נדרש להיווצרות מורכבת אופטימלית 28. אנחנו לא לזהות היווצרות מורכבת בהlysates דואר על ידי כתם מערבי, אשר יביא לירידה בפעילות פרוטאז. פרוטוקול זה מתבצע בטמפרטורת הסביבה מעבדה טיפוסית, עד ~ 22 ° C.
יותר מ 20 שנות ניסיון בביצוע מבחני אלה מצאנו כי המקור המסחרי של מגיב הבוק-AAD-SBzl הוא בעל חשיבות עליונה לקבלת תוצאות עקביות, רגישות ואמינות. היינו רק להמליץ הספק יש לנו הפניה, אם כי מקורות מסחריים אחרים הם מתאימים גם למצעים הדרושים כדי לאתר את הפעילות של granzymes האחר. הפרוטוקול המתואר במאמר זה ניתן להתאים בקלות לקביעת פעילות פרוטאז סרין פרוטאזות של הגרגר האחר על ידי הידרוליזה של מצעי פפטיד סינטטיים עם רצף הכרה מתאים כמפורט בטבלה 1. N-α-CBZ L- ליזין-S- מצע Bzl יכול לשמש כדי לזהות פעילות tryptase של שני GzmA בעכבר וCL האנושי ובאופן תיאורטי GzmK בעכבר CL. למרות שביטוי GzmK mRNA הודגם על ידי RT-PCR בתאי רוצח שנוצרו מעכברי נוקאאוט גן GzmAB בתגובה לפפטידים שפעת 29, אנחנו לא מודעים לפעילות פרוטאז GzmK שדווח בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית או אחר כל זה. הפעילות של שני GzmH רקומביננטי האנושי, או פרוטאז מטוהר מתאי NK, ניתן להעריך עם SUC-Phe-Leu-Phe-S-Bzl 30, אולם זה לא ניתן לייחס את הידרוליזה של מצע זה במיוחד כדי granzyme זה ב תא lysates. לימפוציטים מכילים מספר של פרוטאזות endolysosomal אחרת כגון cathepsins, אשר יהיה גם פעילות כמו chymotrypsin (chymase). בעכבר, גן GzmH הוא הוחלף על ידי אשכול גנים (Gzms CF) כל ניבא לי פעילות דומה (chymase).
למרות GzmB אדם נמצא לדבוק ביעילות BH3 בלבד המולקולה הפרו-אפופטוטיים הצעה, ובכך ישירות לעסוק במיטוכונדריהמסלול המוות 31, ככל הנראה תוצאות סותרות היו בתחילה שהושג עם GzmB עכבר. בלבול זו נפתר על ידי מחקרים אלגנטיים על ידי מספר החוקרים, שקבע כי רצף הכרת מצע המועדף שונה בין אדם לעכבר (וחולדה) GzmB, למרות גבוה התואר (~ 80%) של הומולוגיה ברצף הכוללת של פרוטאזות 16, 17,23. רצף ההכרה האופטימלי לGzmB האנושי הוא אני / V, E / M / Q, P / XAA (S / T) ו- D במצב P1 ואילו לGzmB עכבר זה L / I / V, E, F / Y / Q, D 16,17. ההבדל העיקרי היה בעמדת P2, כP בפרט אינו נסבל על ידי עכבר GzmB, ומכאן עכבר ההצעה (IEPD 75) אתר מחשוף לא לאכלס ידי שסוע מצע GzmB המחייב. יתר על כן, מצעי פפטיד הסינתטי IEPD-PNA, תאר באופן שיגרתי כספציפי לGzmB, וIETD-הרשות הפלסטינית, הם הידרוליזה כהלכה על ידי GzmB עכבר. יש לנו מאוחד הממצא שנעשה על ידי אחרים 23 מחדש באמצעות נוסףcombinant granzymes שGzmB האנושי, אבל לא GzmB נוכחי בעכבר NK וCTL hydrolyse IETD-PNA וIEPD-PNA. קייזרמן et al. 17 לעומת פעילות המחשוף של אדם רקומביננטי והעכבר GRB מיוצר בpastoris Pichia, באמצעות בוק-AAD-SBzl עם מצעי Ac-IETD-PNA. בדומה לכך, החוקרים מצאו כי בעוד שני האנזימים ביקעו בוק-AAD-SBzl ביעילות דומה, הידרוליזה של Ac-IETD-ידי הרשות הפלסטינית עכבר GRB היה פי 30 פחות יעילים. בעוד T ו- P (כמו גם S) במצב P2 הם מועדף על ידי GzmB האנושי, הם לא נסבלים GzmB עכבר. בניגוד לכך, אנו בבירור פעילות GzmB דומה בשני lysates תא האנושי ועכבר NK באמצעות מגיב בוק-AAD-SBzl הכללי יותר. עם זאת, פעילות GzmB אדם רק ניתן הייתה לזהות במגיבה IEPD-PNA.
כל הממצאים האלה מדגישים את העובדה כי חילוקי הסגוליות הקנס של GzmB של מינים שונים יכולים להיות השפעה גדולה על איך לבחורמצע מתאים לניתוח במבחנה. לסיכום, אם זיהוי של עכבר, פעילות GzmB אדם או עכברוש נחקר, הבוק-AAD-SBzl הוא המצע של בחירה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SMSB05 | Granzyme B substrate (mouse and human) |
| Ac-IEPD-pNA | SM Biochemicals LLC, CA | SMPNA009 | Granzyme B substrate (only human) |
| N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl | Sigma-Aldrich | C3647 | Granzyme A substrate |
| Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SB025 | Granzyme H substrate |
| 5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Sigma-Aldrich | D8130 | DTNB, Ellman’s Reagent |
| NK cell isolation kit II mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-892 | negative selection kit |
| NK cell isolation kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-657 | negative selection kit |
| Plate reader | Biorad iMark | Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3 | |
| Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate | Corning, MA, USA | 2797 |
References
- Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).
- Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).
- Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. , (2009).
- Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).
- Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).
- Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).
- Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).
- Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. , (2009).
- Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).
- Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).
- Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).
- Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).
- Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).
- Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).
- Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).
- Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).
- Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).
- Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
- Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).
- Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).
- Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).
- Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).
- Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).
- Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).
- Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).
- Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).
- Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).
- Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
- Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).
- Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).
- Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).
