Introduction
Granzimas são uma família de serina-proteases encontradas nos lisossomas secretoras de células assassinas naturais (NK) e linfócitos T citotóxicos (CTL) 1. Cinco granzimas diferentes existem em seres humanos (A, B, H, K e M), e dez ratos (A - G, K, M e N) 2,3. Granzyme A e B Granzyme (GzmA, GzmB) são os mais abundantes e têm sido amplamente estudados no cenário humano e roedores.
A função clássica de GzmB é a indução de apoptose em células alvo executadas em conjunto com a proteína perforina de formação de poros, o que permite a granzima para aceder ao citosol da célula alvo 4. Embora a expressão GzmB é inequivocamente encontrada em linfócitos citotóxicos, os estudos recentes têm-se debruçado sobre uma variedade de outros tipos de células que expressam GzmB, incluindo mas não se limitando aos queratinócitos 5, 6 basófilos, mastócitos, células dendríticas 7 plasmocitoides 8, 9 e células B, 10.Neste contexto, as funções GzmB não apoptóticas foram revelados desde a participação em processos inflamatórios, remodelação de tecidos e outras propriedades imunomoduladoras 11-14.
Tendo em conta que um papel biológico mais amplo tem sido proposto para GzmB do que se suspeitava anteriormente, os pesquisadores necessitam de ferramentas confiáveis e específicos para a sua detecção. De vantagem é requisito específico da GzmB para clivar no lado carboxilo dos resíduos de ácido aspártico, uma propriedade únicas entre as proteases de serina 15 eucarióticas. Rato, humano e de rato GzmB são estruturalmente muito semelhantes, no entanto, a especificidade do substrato prolongado de rato GzmB subtilmente diferente daquele de ambos humano e de rato 16, o que significa que certos substratos genéricos com Asp no terminal (P1) pode ser clivado eficazmente por GzmB de todas as três espécies, enquanto que outros substratos com sequências mais complicadas montante de P1 pode dar resultados muito variáveis. Tanto no passado e li mais recenteterature, este fato tem causado confusão e má interpretação do significado biológico de alguns achados experimentais considerável, embora cuidadosamente controlados, estudos cinéticos têm procurado corrigir a situação 17.
Neste trabalho procuramos ilustrar esses pontos usando dois substratos disponíveis no mercado, ou seja, Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl e N-acetil-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilida. Os dois reagentes fazer gerar diferentes grupos reativos após a clivagem (a sulfidrila livre versus um paranitroanilida livre fluorescente), mas isso não tem nenhum efeito sobre a clivagem proteolítica. O protocolo descrito é uma adaptação moderna de um protocolo muito velho 18, mas deve ajudar os pesquisadores a utilizar os diferentes substratos GzmB adequadamente, além de fornecer um quadro metodológico para detectar a atividade de outros granzimas, como GzmA e GzmH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Os baços foram derivadas de ratinhos (6-10 semanas de idade) e todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com as orientações éticas animais de MacCallum Cancer Centre, Peter (E486).
1. Preparação de Amostras.
- Preparação das células de rato NK ativadas.
- Isolar células NK ingênuas primários de uma única célula suspensões dos baços de C57BL / 6 ou B6.GrzmB - / - (null gene GzmB) ratos por seleção negativa usando kits disponíveis no mercado.
- Siga o protocolo dos fabricantes. Resumidamente, magneticamente marcar células NK "não", tais como as células T e B, células dendríticas, granulócitos, macrófagos e células vermelhas do sangue, utilizando anticorpos conjugados com biotina contra os seus marcadores de superfície específicos. Use separação magnética com contas anti-biotina para destruir as células "não-NK".
- Cultura isolada células NK durante 5-7 dias em meio contendo IL-2 (1000 U / ml) a 700.000 células / ml em placas de 24 poçosa 37 ° C.
- Alternativamente, as células T activadas utilização 19, antígeno-primária de CTL restrito a partir do receptor de células T OT1 ratinhos transgénicos 20, os CTL gerados em culturas de linfócitos mistas, 21 ou sobrenadantes de células NK activadas para determinar a actividade de secretada GzmB 19.
- Manutenção da linha de células NK humana e o isolamento de células NK primárias.
- Manter leucemia NK humana (células YT) no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio suplementado com 10% de soro fetal de vitelo. Em alternativa, purificar as células NK primárias a partir do sangue periférico de indivíduos saudáveis e estimular durante 2-3 dias em meio contendo IL-2 a 100 U / ml como previamente descrito 22.
- Geração de lisados celulares.
- Lave as células três vezes em PBS (pH 7,4), seguida de suspensão em P-40 tampão de lise Nonidet (0,1% de NP-40, NaCl 250 mM, Hepes 25 mM, EDTA 2,5 mM). Idealmente, lisar um mínimo de 5 x 10 6 7 células T em 100 ul de tampão. Não adicionar inibidores da protease, como muitos são inibidores irreversíveis das proteases de serina, e em particular, tais como triptases GzmA. Incubar em gelo durante 20 min, e em seguida sedimentar os núcleos numa microcentrifugadora a 15.000 xg durante 10 min. Descartar o sedimento nuclear e transferir o sobrenadante para um tubo fresco.
- Determinar a concentração de proteína dos lisados.
- Usar um protocolo disponível comercialmente de escolha, tal como, Bradford ou ácido bicinconínico (BCA) e determinar a concentração de proteína. Certifique-se de que a concentração é de aproximadamente 2 mg / ml mínimo. Armazenar em lisados de -20 ° C até ser necessário (granzima actividade é estável durante vários meses a -20 ° C).
2. A granzima B Ensaio de Actividade
- Preparação dos Reagentes
- Preparar um estoque 10 mM dos substratos (Boc-AAD-S-Bzl ou Ac-IEPD-pNA) em DMSO (~ 5 mg / ml) e armazenam-se em aliquotas a -20 & #176; C. Prepara-se uma diluição de trabalho acabado e descartar depois de cada dia, como Boc-AAD-S-Bzl hidrolisa parcialmente em armazenamento em DMSO.
- Preparar um estoque 250 mM do reagente colorimétrico (5,5'-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzóico), DTNB) em DMSO (0,09 g / ml) e armazenar a -20 ° C. Prepare uma diluição de trabalho de fresco todos os dias. Este reagente é necessária apenas para substratos com grupos de indicadores SBzl, não pNA.
- Make up tampão fresco (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl2, pH 7,3) a cada 2-3 semanas.
- Traga o DTNB e substratos sintéticos para a temperatura ambiente. Diluir, substratos (1:16, por exemplo, 100 ml em 1,6 ml de tampão) e DTNB (1: 250, por exemplo, 10 jul em 2,5 ml de tampão) e misture bem.
- Dilui-se um mínimo de 100 ug de proteína de lisado de cada amostra em tampão para um volume final de 160 ul. Usando uma pipeta multicanal adicionar 50 ul por poço em triplicado (~ 33,3 ng / cavidade) em um '' U '' vinilo inferior placa de 96 poços.Incluir um "tampão-only" controle (também em triplicado).
- Adicione 100 ml de diluída DTNB para o controle samples / tampão (omitir esta etapa quando se trabalha com Ac-IEPD-pNA.
NOTA: A clivagem de Ac-IEPD-pNA por GzmB liberta fluorogénico directamente pNA (Figura 4B). - Usar uma pipeta de canais múltiplos para adicionar rapidamente 50 ul de substrato diluído para cada conjunto de triplicados, começando com o tampão, em seguida, todos os controlos negativos e terminando com amostras positivas esperadas.
- Colocar a placa no leitor de placas. Medir a actividade Asp-ase por hidrólise de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA em um leitor de microplacas a OD 405 nm. Use um protocolo de ensaio cinético, levar 25 leituras, a cada 15 segundos (cerca de 6 min de tempo de leitura total).
- Use as leituras de absorvância gerado em cada ponto de tempo para calcular manualmente a taxa de clivagem do substrato caso o software do leitor de placas não podem gerar um valor de Vmax.
3. Análise de Data
NOTA: Os dados gerados são apresentados como a velocidade máxima, definida como a mudança de OD ao longo do tempo (mOD / min).
- Para analisar os dados, determinar o valor máximo de clivagem do substrato, o qual é calculado a partir da taxa de variação de absorvância. Faça isso usando automaticamente o software leitor de placas, que normalmente tem essa opção.
- Como alternativa, depois de ver as parcelas cinéticos de variação de absorvância, que são gerados durante o ensaio de cinética no leitor de placa, manualmente selecionar os pontos de dados que dão a mais íngreme linha reta. Para a maioria dos ensaios, a taxa máxima é obtida dentro da primeira 2 minutos de ensaio.
- Subtraia a leitura OD inicial da maior leitura OD nesta linha reta e dividir pelo intervalo de tempo. Transferência de dados brutos para o Microsoft Excel / Gráfico pad para análise estatística e display gráfico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O substrato Boc-AAD-S-Bzl é específico para GzmB
O GzmB protease serina é um dos principais constituintes de linfócitos citotóxicos (CTL e as células NK) e é predominantemente responsável pela indução da morte apoptótica rápida em células alvo, tais como células transformadas ou infectadas com vírus. Isto é, em grande parte devido à sua preferência de substrato para a clivagem após certos resíduos de aspartato específicas em proteínas selecionadas, um atributo compartilhado com as caspases, que também fazem a clivagem após resíduos de aspartato, mas que são de uma classe diferente de proteases, a protease família cisteína 15. Esta diferença no mecanismo proteolítico significa que o AAD-SBzl não pode ser clivada por qualquer caspase. GzmB expressão é induzida após activação de linfócitos citotóxicos e a actividade enzimática pode ser monitorizados em lisados de células preparados a partir destas células (Figura 1). A disponibilidade de camundongos knockout gene granzyme nos permitiu estabelecer queo substrato peptídico sintético Boc-Ala-Ala-Asp (DAA) - tiobenzilo éster (S-Bzl) é especificamente hidrolisado por GzmB. Robusta de clivagem do substrato sintético pode ser medida num lisado celular a partir de células NK B6 primários, mas não em B6.GrzmB - / - células NK. Como um controlo, a actividade proteolítica da GzmA, que tem a tripsina (triptase) especificidade para o substrato e está presente em ambos os lisados era equivalente, como medido pela hidrólise da N-α-CBZ-L-lisina (BLT) -S- Bzl.
Sequência de reconhecimento de substrato GzmB espécie-específico
Os primeiros estudos descrevam moléculas de células-alvo potenciais clivada por GzmB causou alguma confusão até que surgiu esse rato e GzmB humano tem uma preferência reconhecimento do substrato ligeiramente alterada, o que é ditado por quantos 8-10 resíduos mapeamento em torno do P1 aspartato 23. Isto foi particularmente evidente em estudos que examinaram a clivagem da pró-apoptótica BH3-onlymolécula de Licitação, que podem ser cortados de forma eficiente por humanos, mas muito menos eficiente pelo mouse GzmB. Em células intactas, esta diferença resulta na activação de diferentes vias de morte celular, com GzmB humano operando, preferencialmente, através da via mitocondrial, e rato GzmB através da activação da caspase directa. Análise de seqüências tetrapeptídicas revelou que GzmB rato humano, mas não poderia decompor após a seqüência IEPD, que coincide com a sequência de reconhecimento, tanto do mouse Bid 16 e humanas. Tanto na literatura e em produto comercial cataloga o substrato tetrapéptido, Ac-IEPD-pNA foi usado genericamente para testar a actividade GzmB (Tabela 1). É agora claro que, embora tanto humana e de ratinho podem clivar Boc-AAD-S-Bzl, com uma eficiência muito semelhante, GzmB rato em lisados de células NK não hidrolisar eficientemente Ac-IEPD-pNA (Figura 2). Em contraste, a diminuição da quantidade de lisado humano NK YT de 30 ug a 10 ug ainda redundoud em GzmB suficiente para hidrolisar o substrato Ac-IEPD-pNA (Figura 3).
Figura 1:. A actividade enzimática em grânulos em células NK de murino granzima B (painel superior) e granzima A (painel inferior) em actividade NK a partir de lisados de células de tipo selvagem e ratinhos knockout B6 B6.GrzmB foi determinada pela taxa máxima de hidrólise do Boc- Ala-Ala-Asp-S-Bzl e N-α-CBZ-L-S-Bzl lisina substratos peptídicos. Os dados representam uma experiência representativa realizada em triplicado (n> 3).
Figura 2:. Hidrólise Species-specific de Ac-IEPD- pNA substrato Mouse e GzmB humana hidrolisada Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl igualmente, mas apenas GzmB humana hidrolisada Ac-IEPD-pNA. A humanaA linha de células NK YT e IL-2 do rato activado primário NK foram usadas como uma fonte de GzmB. Gráfico de barras mostra uma experiência representativa realizadas em triplicata (n> 3).
Figura 3:. A redução da concentração de proteínas não anulam a actividade GzmB A taxa de hidrólise de Ac-IEPD-pNA induzida por GzmB humano foi comparada com a diminuição da concentração de proteína da linha de células NK YT lisado. Representante Experiment para n> 3.
Figura 4:. Representação gráfica do princípio do ensaio GzmB cliva os substratos Boc-AAD-S-Bzl (A) e Ac-IEPD-pNA (B) após o aspartato P1, libertando assim quer um mercaptano de benzilo, que por sua vez interage com DTNB para formar um ião fluorogénico 3-carboxi-4-nitrofenóxido (A), ou através da libertação directamente p-nitroanilida, o qual é em si um cromóforo (B). Emissões de fluorescência de duas destas moléculas pode ser detectada a 405 nm.
| Protease serina | Substrato | Atividade |
| A granzima | N-α-CBZ-L-lisina (BLT) tiobenzil éster (S-Bzl) | Tryptase 22 |
| Granzyme B | 1. Boc-Ala-Ala-Asp (DAA) -S-Bzl | ASPase 14 |
| 2. N-acetil-Ile-Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilida (pNA) | ||
| Granzyme H | Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl | Quimase 23 |
Tabela 1:. actividade Lista de substratos disponíveis para a detecção da actividade da triptase granzima GzmA pode ser detectada por meio de hidrólise do grupo N-α-CBZ-L-lisina específica (BLT) tiobenzil éster (S-Bzl) . GzmB especificamente cliva após resíduos aspartato (Asp-ase), que podem ser avaliadas por meio de hidrólise ou de Boc-Ala-Ala-Asp (DAA) -S-Bzl (rato detecta e GzmB actividade humana), ou N-acetil-Ile- Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilida (pNA) (apenas detecta actividade GzmB humano). A quimase de GzmH actividade é avaliada pela clivagem de Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historicamente os granzimas foram identificados como moléculas efectoras principais de linfócitos citotóxicos (CTL e as células NK), capazes de induzir uma rápida morte apoptótica em células alvo. Isto foi devido principalmente à ação de GzmB, que clivada moléculas de substrato-alvo em aspartato (D) os resíduos e, assim, foi capaz de ativar a cascata caspase por ambas clivagem pró-caspases, assim como vários de seus alvos a jusante. No entanto, é agora apreciado que a expressão GzmB não está confinada a células linfóides citotóxicas e a sua função pode ser estendido bem para além do reconhecimento da célula alvo e a morte celular.
Neste artigo descrevemos um protocolo que permite a detecção de GzmB ativa em lisados de células derivadas de mouse e células CTL / NK humanas usando um método colorimétrico simples. A simplicidade e especificidade desse ensaio conforme apurado por estes resultados permitem a aplicação do presente protocolo para examinar GzmB em amostras celulares de outra fontes. No entanto, é importante que os lisados celulares tem uma concentração de proteína de pelo menos 2 mg / mL, e os controlos positivos e negativos adequados são incluídas no protocolo experimental. A especificidade do reagente Boc-AAD-SBzl para GzmB é evidente a partir da falta de actividade de clivagem de substrato no ligado derivado de GzmB animais nulos, como actividade é completamente perdida (Figura 1). Em todos os estudos futuros, recomenda-se que um tal controlo negativo (s. Protocolo secção 1.1) é usado para verificar se qualquer actividade detectada é específico para GrzB. (Nota: Embora como GrB, caspases têm uma especificidade absoluta para a clivagem em resíduos de aspartato na posição P1, sendo os substratos preferidos são tetrapepetides onde o ácido amino P4 é também um factor determinante de especificidade 24.). Se análise do material recombinante do local activo serina da protease mutante de alanina (protease inactiva preparado exactamente da mesma maneira como a enzima activa) deve ser included, e isto é particularmente importante se o ensaio de lisados de células não-mamíferos, particularmente aqueles a partir de células de levedura ou bacterianas.
Usando o protocolo acima para os ensaios de células de mamíferos, actividade GzmB não é diminuído pela presença de inibidores de proteases de serina aparentadas endógenos (serpinas), que pode ser grandemente regulados positivamente em linfócitos citotóxicos activados (LC) 25, bem como em células derivadas a partir de tecidos não imunes, incluindo células transformadas 26. O serpinB9 citosólica, (anteriormente PI-9) é altamente específico para GzmB humano; no entanto, no rato, existem vários ortólogos específicos próximos, mas les dos quais b9 serpin, ou SPI-6 tem atividade inibitória significativa para rato GzmB 27. Embora a lise em tampão NP-40 pode ser permissiva para a geração de uma interacção irreversível entre GzmB e serpina, incubação a 37 ° C é necessário para a formação do complexo óptimo de 28. Nós não detectar a formação do complexo em the lisados por western blot, o que resultaria em perda de actividade de protease. Este protocolo realiza-se à temperatura ambiente laboratorial típica, até ~ 22 ° C.
A partir de mais do que 20 anos de experiência na realização destes ensaios verificou-se que a fonte comercial do reagente Boc-AAD-SBzl é de extrema importância para a obtenção de resultados consistentes, sensíveis e fiáveis. Só recomendam o fornecedor foi feita referência, embora outras fontes comerciais são também adequados para os substratos necessários para detectar a actividade de outras granzimas. O protocolo descrito no presente documento pode ser facilmente adaptado para a determinação da actividade da protease de outras proteases de serina de grânulos a partir da hidrólise de substratos de péptidos sintéticos com uma sequência de reconhecimento apropriada conforme descrito na Tabela 1. A N-α-CBZ-L-lisina-S- Bzl substrato pode ser usado para detectar a actividade da triptase de ambos GzmA no rato e CL humano e teoricamente GzmK no rato CL. Embora a expressão de ARNm GzmK foi demonstrado por RT-PCR em células assassinas gerados a partir GzmAB ratinhos knockout de genes em resposta a péptidos 29 da gripe, não temos conhecimento de actividade de protease GzmK tendo sido relatado nesta ou em qualquer outro contexto fisiologicamente relevante. A actividade de qualquer GzmH recombinante humana, ou a protease purificada a partir de células NK, pode ser avaliada com Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl 30, no entanto, não é possível atribuir a hidrólise deste substrato especificamente para este em granzima Os lisados celulares. Os linfócitos contêm um número de outras proteases endolysosomal tais como as catepsinas, que também terão (quimase) actividade semelhante a quimotripsina. No ratinho, o gene GzmH é substituído por um grupo de genes (CF) Gzms tudo previsto para ter (a quimase) actividade semelhante.
Embora GzmB humano foi encontrado para clivar efetivamente o BH3-only molécula pró-apoptótica Bid, e, assim, envolver diretamente o mitocondrialvia de morte 31, aparentemente resultados conflitantes foram inicialmente obtidos com o mouse GzmB. Esta confusão foi resolvida por estudos elegantes por um certo número de investigadores, que determinou que a sequência de reconhecimento do substrato preferido diferiu entre rato e humano (e rato) GzmB, apesar do elevado grau (~ 80%) de homologia de sequência total das proteases 16, 17,23. A sequência de reconhecimento óptima para GzmB humano é eu / V, E / M / Q, P / Xaa (S / T) e D na posição P1 enquanto que para rato GzmB é L / I / V, E, F / Y / Q, D 16,17. A principal diferença foi na posição P2, tal como P, em particular, não é tolerada pelo rato GzmB, portanto, o rato Bid (IEPD 75) local de clivagem não ser acomodados por a fenda de ligação ao substrato GzmB. Além disso, os substratos peptídicos sintéticos IEPD-PNA, rotineiramente descrito como específico para GzmB e IETD-PNA, são mal hidrolisado por rato GzmB. Nós consolidamos ainda mais a constatação feita por outros 23 usando recombinant granzimas que GzmB humana, mas não GzmB presente no rato NK e CTL hydrolyse IETD-pNA e IEPD-pNA. Kaiserman et al. 17 comparado a actividade de clivagem de recombinante humano e de rato GrB produzido em Pichia pastoris, utilizando Boc-AAD-SBzl com os substratos Ac-IETD-pNA. Da mesma forma, os autores descobriram que, embora ambas as enzimas clivada Boc-AAD-SBzl com eficiência comparável, a hidrólise do Ac-IETD-pNA pelo mouse GrB foi 30 vezes menos eficiente. Embora T e P (assim como S) na posição P2 são preferidos por GzmB humano, que não são tolerados GzmB rato. Em contrapartida, observou-se nitidamente demonstrado actividade GzmB comparável em ambos os lisados de células NK humanas e de rato, utilizando o reagente de Boc-AAD-SBzl mais genérica. No entanto, apenas actividade GzmB humano podia ser detectado com o reagente IEPD-pNA.
Juntos, estes resultados destacam o fato de que as diferenças da especificidade fina GzmB de espécies diferentes podem ter um grande impacto sobre como escolherum substrato adequado para a análise in vitro. Em resumo, se a detecção de rato, actividade GzmB humano ou de rato é investigada, Boc-AAD-SBzl é o substrato de escolha.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SMSB05 | Granzyme B substrate (mouse and human) |
| Ac-IEPD-pNA | SM Biochemicals LLC, CA | SMPNA009 | Granzyme B substrate (only human) |
| N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl | Sigma-Aldrich | C3647 | Granzyme A substrate |
| Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SB025 | Granzyme H substrate |
| 5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Sigma-Aldrich | D8130 | DTNB, Ellman’s Reagent |
| NK cell isolation kit II mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-892 | negative selection kit |
| NK cell isolation kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-657 | negative selection kit |
| Plate reader | Biorad iMark | Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3 | |
| Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate | Corning, MA, USA | 2797 |
References
- Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).
- Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).
- Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. , (2009).
- Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).
- Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).
- Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).
- Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).
- Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. , (2009).
- Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).
- Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).
- Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).
- Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).
- Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).
- Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).
- Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).
- Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).
- Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).
- Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
- Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).
- Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).
- Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).
- Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).
- Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).
- Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).
- Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).
- Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).
- Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).
- Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
- Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).
- Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).
- Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).
