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Chemistry

Un ensayo colorimétrico que mide específicamente granzima B actividad proteolítica: La hidrólisis de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Published: November 28, 2014 doi: 10.3791/52419
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Introduction

Granzimas son una familia de serina proteasas que se encuentran en los lisosomas secretores de las células (NK) y linfocitos T citotóxicos (CTL) 1 asesino natural. Existen cinco granzimas diferentes en los seres humanos (A, B, H, K y M), y diez en ratones (A - G, K, M y N) 2,3. Granzima A y granzima B (GzmA, GzmB) son las más abundantes y han sido investigadas extensamente en el ambiente humano y de roedor.

La función clásica de GzmB es la inducción de apoptosis en las células diana ejecutados en conjunción con la proteína de perforina de formación de poros, que permite la granzima para acceder al citosol de la célula diana 4. Aunque la expresión GzmB se encuentra de manera inequívoca en los linfocitos citotóxicos, estudios recientes se han ocupado de una variedad de otros tipos de células que expresan GzmB, incluyendo pero no limitado a los queratinocitos 5, 6 basófilos, mastocitos, células dendríticas 7 plasmacitoides 8, 9 y las células B, 10.En este contexto, las funciones GzmB no apoptóticas fueron revelados desde la participación en los procesos inflamatorios, la remodelación de tejidos y otras propiedades inmunorreguladoras 11-14.

Dado que un papel biológico más amplio se ha propuesto para GzmB lo que se sospechaba previamente, los investigadores necesitan herramientas fiables y específicos para su detección. De la ventaja es requisito específico de GzmB para escindir en el lado carboxilo de residuos de ácido aspártico, una propiedad única entre serina proteasas eucariotas 15. Ratón, humano y de rata GzmB son estructuralmente muy similares, sin embargo, la especificidad de sustrato prolongado de GzmB ratón difiere sutilmente de que tanto de humano y de rata 16, lo que significa que ciertos sustratos genéricos con Asp en la terminal (P1) se pueden escindir eficientemente por GzmB de las tres especies, mientras que otros sustratos con secuencias más complicadas aguas arriba de P1 puede dar resultados muy variables. Tanto en el pasado y li más recienteterature, este hecho ha causado gran confusión y mala interpretación de la importancia biológica de algunos resultados experimentales, aunque cuidadosamente controlado, estudios cinéticos han tratado de corregir la situación 17.

En este trabajo hemos tratado de ilustrar estos puntos usando dos sustratos disponibles en el mercado, a saber, Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl y N-acetil-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilida. Los dos reactivos hacer generar diferentes grupos reactivos después de la escisión (un sulfhidrilo libre versus un paranitroanilida libre fluorescente), pero esto no tiene efecto alguno sobre la escisión proteolítica. El protocolo descrito es una adaptación moderna de un protocolo muy antiguo 18, pero debería ayudar a los investigadores a utilizar los diferentes sustratos GzmB adecuadamente, mientras que también proporciona un marco metodológico para la detección de la actividad de otros granzimas, como GzmA y GzmH.

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Protocol

NOTA: Los bazos fueron derivadas de ratones (6-10 semanas de edad) y todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de Ética Animal del Centro de Cáncer Peter MacCallum (E486).

1. Preparación de las muestras.

  1. Preparación de células de ratón NK activadas.
    1. Aislar las células NK ingenuos primarias a partir de suspensiones de una sola célula de bazo de C57BL / 6 o B6.GrzmB - / - (GzmB gen null) ratones por selección negativa utilizando kits disponibles en el mercado.
    2. Siga el protocolo de los fabricantes. Brevemente, magnéticamente marcar las células NK "no", tales como las células T y B, células dendríticas, granulocitos, macrófagos, y células rojas de la sangre utilizando anticuerpos conjugados con biotina contra sus marcadores de superficie específicos. Utilice separación magnética con cuentas anti-biotina para agotar las células NK "no".
    3. Aislado Cultura células NK durante 5-7 días en medio que contenía IL-2 (1000 U / ml) a 700,000 células / ml en placas de 24 pocillosa 37   ° C.
    4. Alternativamente, el uso de células T activadas 19, CTL restringido el antígeno principal de OT1 receptor de células T de ratones transgénicos 20, CTL generados en cultivos mixtos de linfocitos 21, o los sobrenadantes de las células NK activadas para determinar la actividad de secretada GzmB 19.
  2. Mantenimiento de la línea humana de células NK y el aislamiento de células primarias NK.
    1. Mantener la leucemia NK humana (células YT) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con 10% de suero de ternera fetal. Alternativamente, purificar células NK primarias de la sangre periférica de sujetos sanos y estimular durante 2-3 días en medio que contiene IL-2 a 100 U / ml como se ha descrito previamente 22.
  3. Generación de lisados ​​celulares.
    1. Lavar las células tres veces en PBS (pH 7,4), a continuación, suspender en Nonidet P-40 tampón de lisis (0,1% NP-40, NaCl 250 mM, 25 mM Hepes, EDTA 2,5 mM). Idealmente, la lisis de un mínimo de 5 x 10 6 7 células T en 100 l de tampón. No añadir inhibidores de la proteasa, ya que muchos son inhibidores irreversibles de proteasas de serina, y en triptasas particulares como GzmA. Incubar en hielo durante 20 min, y luego sedimentar los núcleos en una microcentrífuga a 15.000 xg durante 10 min. Desechar el pellet nuclear y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
  4. Determinar la concentración de proteína de los lisados.
    1. Use un protocolo disponible comercialmente de elección tales como, Bradford o ácido bicinconínico (BCA) y determinar la concentración de proteínas. Asegúrese de que la concentración es de ~ 2 mg mínimo / ml. Lisados ​​almacenar a -20 ° C hasta que sea necesario (actividad granzima es estable durante muchos meses a -20 ° C).

2. granzima B Ensayo de la actividad

  1. Preparación de los reactivos
    1. Preparar una mM balance de los sustratos (Boc-AAD-S-Bzl o Ac-IEPD-PNA) 10 en DMSO (~ 5 mg / ml) y almacenar en alícuotas a -20 & #176; C. Prepare una dilución de trabajo recién y desechar después de cada día, como Boc-AAD-S-Bzl hidroliza parcialmente en el almacenamiento en DMSO.
    2. Preparar una población de 250 mM de reactivo colorimétrico (5,5'-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzoico), DTNB) en DMSO (0,09 g / ml) y se almacena a -20 ° C. Prepare una dilución de trabajo nueva cada día. Este reactivo sólo se requiere para sustratos con grupos indicadores SBzl, no ANP.
    3. Invente tampón fresco (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl 2, pH 7,3) cada 2-3 semanas.
  2. Llevar DTNB y sustratos sintéticos a temperatura ambiente. Diluir sustratos (1:16, por ejemplo, 100 l en 1,6 ml de tampón) y DTNB (1: 250, por ejemplo, 10 l en tampón 2,5 ml) y mezclar bien.
  3. Diluir un mínimo de 100 g de proteína de lisado de cada muestra en un tampón a un volumen final de 160 microlitros. Usando una pipeta multicanal añadir 50 l por pocillo por triplicado (~ 33,3 g / pocillo) en una '' U '' de vinilo del fondo placa de 96 pocillos.Incluir un "búfer de sólo" control (también por triplicado).
  4. Añadir 100 l de diluirse DTNB para el control de muestras / tampón (omita este paso cuando se trabaja con Ac-IEPD-pNA.
    NOTA: La escisión de Ac-IEPD-pNA por GzmB libera directamente fluorogénica pNA (Figura 4B).
  5. Utilizar una pipeta multicanal para añadir rápidamente 50 l de sustratos diluidas a cada conjunto de triplicados, empezando con el tampón entonces cualquier controles negativos y terminando con muestras positivas esperados.
  6. Colocar la placa en el lector de placas. Medir la actividad Asp-asa por hidrólisis de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA en un lector de microplacas a OD 405 nm. Utilice un protocolo de ensayo cinético, tomar 25 lecturas, cada 15 segundos (aprox 6 min tiempo de lectura total).
  7. Use las lecturas de absorbancia generadas en cada punto de tiempo para calcular manualmente la tasa de escisión de sustrato de si el software del lector de placas no puede generar un valor de Vmax.

3. Análisis de Data

NOTA: Los datos generados se presenta como velocidad máxima, que se define como el cambio de OD en el tiempo (mod / min).

  1. Para analizar los datos, determinar la tasa máxima de escisión de sustrato, que se calcula a partir de la tasa de cambio en la absorbancia. Hacer esto automáticamente con el software lector de placas, que normalmente tiene esta opción.
  2. Alternativamente después de ver las parcelas cinéticos de cambio en la absorbancia, que se generan durante el ensayo cinético en el lector de placas, seleccionar manualmente los puntos de datos que dan a la línea recta más empinada. Para la mayoría de los ensayos se consigue la tasa máxima dentro de la primera 2 min del ensayo.
  3. Restar la lectura OD inicial a partir de la lectura más alta OD en esta línea recta y se dividen por el intervalo de tiempo. Transferir datos brutos a Microsoft Excel / Gráfico almohadilla para el análisis estadístico y gráfico.

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Representative Results

El sustrato Boc-AAD-S-Bzl es específico para GzmB

El GzmB serina proteasa es un constituyente principal de los linfocitos citotóxicos (CTL y células NK) y es predominantemente responsable de inducir la rápida muerte apoptótica en las células diana, tales como células infectadas por virus o transformadas. Esto es en gran parte debido a su preferencia de sustrato para la escisión después de ciertos residuos de aspartato específicos en las proteínas seleccionadas, un atributo compartida con las caspasas, que también escinden después de residuos de aspartato, pero que son de una clase diferente de proteasas, la familia de la proteasa cisteína 15. Esta diferencia en el mecanismo proteolítica significa que AAD-SBzl no puede ser escindido por cualquier caspasa. Expresión GzmB es inducida después de la activación de los linfocitos citotóxicos y la actividad enzimática se puede controlar en lisados ​​celulares preparados a partir de estas células (Figura 1). La disponibilidad de los ratones knockout de genes granzima ha permitido establecer queel sustrato péptido sintético Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) - tiobencilo éster (S-Bzl) se hidroliza específicamente por GzmB. La escisión robusta del sustrato sintético puede ser medida en un lisado celular a partir de células NK primarias B6, pero no en B6.GrzmB - / - células NK. Como control, la actividad proteolítica de GzmA, que tiene (triptasa) especificidad de sustrato de tipo tripsina y está presente en ambos lisados ​​era equivalente, medida por la hidrólisis de N-α-CBZ-L-lisina (BLT) -S- Bzl.

Secuencia de reconocimiento de sustrato GzmB específico de la especie

Los primeros estudios que describen posibles moléculas de células diana escindidas por GzmB causado cierta confusión hasta que se supo que el ratón y GzmB humana tienen una preferencia reconocimiento de sustrato ligeramente alterada, que es dictada por tantos como 8-10 residuos mapeo que rodea el P1 aspartato 23. Esto fue particularmente evidente en los estudios que examinaron la escisión de sólo BH3 la pro-apoptóticamolécula de la subasta, que se puede escindir de manera eficiente por humanos, pero mucho menos eficientemente por GzmB ratón. En células intactas, esta diferencia resulta en la activación de diferentes vías de la muerte celular, con GzmB humano que opera preferentemente a través de la vía mitocondrial, y GzmB ratón a través de la activación de caspasa directa. Análisis de secuencias de tetrapéptidos reveló que GzmB ratón humano, pero no podía escindir después de la secuencia IEPD, que coincide con la secuencia de reconocimiento, tanto en ratón de la subasta 16 humana y. Tanto en la literatura y en producto comercial cataloga el sustrato tetrapéptido, Ac-IEPD-pNA se ha utilizado genéricamente para ensayar la actividad GzmB (Tabla 1). Ahora está claro que mientras tanto humanos y de ratón puede escindir Boc-AAD-S-Bzl, con una eficiencia muy similares, GzmB ratón en lisados ​​de células NK no hidrolizar eficientemente Ac-IEPD-pNA (Figura 2). En contraste, la disminución de la cantidad de lisado humano NK YT desde 30 g hasta 10 g todavía resulted con el suficiente GzmB para hidrolizar el sustrato Ac-IEPD-pNA (Figura 3).

Figura 1
Figura 1:. La actividad enzimática de gránulos en las células NK murinas granzima B (panel superior) y granzima A (panel inferior) la actividad en lisados ​​de células NK de tipo salvaje B6 y ratones knockout B6.GrzmB fue determinada por la tasa máxima de hidrólisis del Boc- Ala-Ala Asp-S-Bzl y N-α-CBZ-L--S-Bzl lisina sustratos peptídicos. Los datos representan un experimento representativo realizado por triplicado (n> 3).

Figura 2
Figura 2:.-Especies hidrólisis específica de Ac-IEPD- pNA sustrato Mouse y GzmB humana hidroliza Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl igual pero sólo GzmB humana hidroliza Ac-IEPD-pNA. El humanoLínea de células NK YT y la IL-2 de ratón primario activado NK se utilizaron como una fuente de GzmB. Gráfico de barras muestra un experimento representativo realizado por triplicado (n> 3).

Figura 3
Figura 3:. Reducción de la concentración de proteína no abrogar la actividad GzmB La velocidad de hidrólisis de Ac-IEPD-pNA inducida por GzmB humana se comparó con la disminución de la concentración de proteína de NK YT línea celular lisado. Representante Experimento para n> 3.

Figura 4
Figura 4:. Representación gráfica del principio ensayo escinde GzmB los sustratos Boc-AAD-S-Bzl (A) y Ac-IEPD-pNA (B) después de la aspartato P1, liberando de esta manera, ya sea un bencilmercaptano, que a su vez interactúa con DTNB para formar un ion de 3-carboxi-4-nitrofenóxido fluorogénico (A), o directamente mediante la liberación de p-nitroanilida, que es en sí mismo un cromóforo (B). Emisiones de fluorescencia de estas dos moléculas pueden ser detectados a 405 nm.

Serina proteasa Sustrato Actividad
Granzima A N-α-CBZ-L-lisina (BLT) tiobencilo éster (S-Bzl) Tryptase 22
Granzima B 1. Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) -S-Bzl ASPase 14
2. N-acetil-Ile-Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilida (pNA)
Granzima H Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl Quimasa 23

Tabla 1:. Lista de los sustratos disponibles para la detección de la actividad de la granzima actividad de la triptasa de GzmA puede ser detectado por la hidrólisis de la N-α-CBZ-L-lisina específico (BLT) tiobencilo éster (S-Bzl) . GzmB específicamente escinde después de residuos de aspartato (Asp-asa), que pueden ser evaluados por hidrólisis de cualquiera de Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) -s-Bzl (detecta ratón y la actividad GzmB humana), o N-acetil-Ile- Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilida (pNA) (detecta única actividad GzmB humano). La actividad de la quimasa de GzmH se evalúa mediante la escisión de Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl.

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Discussion

Históricamente las granzimas fueron identificados como moléculas efectoras clave de linfocitos citotóxicos (CTL y células NK) capaces de inducir una muerte apoptótica rápida en las células diana. Esto se debió principalmente a la acción de GzmB, que escinde moléculas de sustrato diana a aspartato (D) los residuos y por lo tanto fue capaz de activar la cascada de caspasas por ambas escisión pro-caspasas, así como varios de sus objetivos de abajo. Sin embargo, ahora se aprecia que la expresión GzmB no se limita a las células citotóxicas linfoides y su función se puede extender mucho más allá de reconocimiento de células objetivo y muerte celular.

En este trabajo se describe un protocolo que permite la detección de GzmB activo en lisados ​​celulares derivadas de ratón y células CTL / NK humanas mediante un simple ensayo colorimétrico. La simplicidad y la especificidad de este ensayo, que se comprobó por estos hallazgos permiten la aplicación de este protocolo para examinar GzmB en muestras celulares de otra fuentes. Sin embargo, es importante que los lisados ​​celulares tienen una concentración de proteína de al menos 2 mg / ml, y controles positivos y negativos adecuados se incluyen en el protocolo experimental. La especificidad del reactivo de Boc-AAD-SBzl para GzmB es evidente a partir de la falta de actividad de escisión de sustrato en el lisado derivado de GzmB animales nulos, ya que la actividad se pierde totalmente la (Figura 1). En cualquier estudio futuro se recomienda que dicho control negativo (s. Sección del protocolo 1.1) se utiliza para verificar que cualquier actividad detectada es específico para GrzB. (Nota: Aunque como GrB, caspasas tienen una especificidad absoluta para la escisión en los residuos de aspartato en la posición P1, sustratos preferidos son tetrapepetides donde el aminoácido P4 es también un factor determinante de la especificidad 24.). Si el análisis de material recombinante el sitio activo de la serina proteasa mutante de alanina (proteasa inactiva preparado exactamente de la misma manera que la enzima activa) debería ser inclu, y esto es particularmente importante si el ensayo de lisados ​​de células de no mamíferos, en particular los de la levadura o células bacterianas.

Usando el protocolo anterior para los ensayos de células de mamífero, la actividad GzmB no se ve disminuida por la presencia de inhibidores de la proteasa serina afines endógenos (serpinas), que puede ser en gran medida hasta reguladas en linfocitos citotóxicos activados (CL) 25, así como en células derivadas de los tejidos no inmunes, incluyendo células transformadas 26. El serpinB9 citosólica, (anteriormente PI-9) es altamente específico para GzmB humana; sin embargo, en el ratón, hay varias orthologues específicos cerca, pero de los cuales les b9 serpina, o SPI-6 tiene actividad inhibidora significativa para GzmB ratón 27. Aunque la lisis en NP-40 tampón puede ser permisiva para la generación de una interacción irreversible entre GzmB y serpina, incubación a 37 ° C se requiere para la formación de complejos óptima 28. Nosotros no detectar la formación de complejos en ªe lisados ​​por Western blot, lo que resultaría en la pérdida de actividad de la proteasa. Este protocolo se lleva a cabo a temperatura de laboratorio típico ambiente, hasta ~ 22 ° C.

De más de 20 años de experiencia en la realización de estos ensayos se ha encontrado que la fuente comercial del reactivo de Boc-AAD-SBzl es de suma importancia para la obtención de resultados consistentes, sensibles y fiables. Sólo nos recomienda el proveedor que hemos referido, aunque otras fuentes comerciales también son adecuados para los sustratos necesarios para detectar la actividad de otros granzimas. El protocolo descrito en este documento puede ser fácilmente adaptado para determinar la actividad de la proteasa de otras proteasas de serina gránulo por la hidrólisis de sustratos de péptidos sintéticos con una secuencia de reconocimiento apropiado como se indica en la Tabla 1. La N-α-CBZ-L-lisina-S- Bzl sustrato se puede usar para detectar la actividad de la triptasa de ambos GzmA en el ratón y CL humana y teóricamente GzmK en el ratón CL. Aunque GzmK mRNA expresión se ha demostrado por RT-PCR en las células asesinas generados a partir de GzmAB ratones knockout de genes en respuesta a los péptidos de la gripe 29, no tenemos conocimiento de la actividad de la proteasa GzmK haber sido informado en este o en cualquier otro contexto fisiológicamente relevante. La actividad de cualquiera de GzmH humana recombinante, o la proteasa purificada a partir de células NK, se puede evaluar con Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl 30, sin embargo, no es posible atribuir la hidrólisis de este sustrato específicamente a este granzima en lisados ​​celulares. Los linfocitos contienen un número de otras proteasas endolysosomal tales como las catepsinas, que también tienen actividad (quimasa) de tipo quimotripsina. En el ratón, el gen GzmH se sustituye por un grupo de genes (CF) Gzms todo predice que tienen actividad (quimasa) similar.

Aunque no se encontró GzmB humana para romper efectivamente el único-BH3 molécula pro-apoptóticos de la subasta, y por lo tanto comprometerse directamente la mitocondriavía de la muerte de 31 años, aparentemente contradictorios resultados se obtuvieron inicialmente con GzmB ratón. Esta confusión se resolvió por estudios elegantes por un número de investigadores, que determinó que la secuencia de reconocimiento de sustrato preferido difería entre ratón y humano (y de rata) GzmB, a pesar del alto grado (~ 80%) de homología de secuencia global de las proteasas 16, 17,23. La secuencia de reconocimiento óptima para GzmB humano es I / V, E / M / Q, P / Xaa (S / T) y D en la posición P1 mientras que para GzmB ratón es L / I / V, E, F / Y / Q, D 16,17. La principal diferencia estaba en la posición P2, como P, en particular, no es tolerada por el ratón GzmB, de ahí el ratón Oferta (IEPD 75) sitio de corte no serían acomodados por la hendidura de unión al sustrato GzmB. Además, los sustratos peptídicos sintéticos IEPD-PNA, que se describe habitualmente como específico para GzmB, y IETD-PNA, están mal hidrolizados por GzmB ratón. Hemos consolidado aún más el hallazgo realizado por otros 23 mediante rerecombinante granzimas que GzmB humano, pero no GzmB presente en ratón NK y CTL hidrolizan IETD-pNA y IEPD-pNA. Kaiserman et al. 17 compararon la actividad de escisión de humana recombinante y el ratón GrB produjo en Pichia pastoris, utilizando Boc-AAD-SBzl con los sustratos Ac-IETD-PNA. Del mismo modo, los autores encontraron que mientras que ambas enzimas escindidos Boc-AAD-SBzl con una eficiencia comparable, la hidrólisis de Ac-IETD-pNA por el ratón GrB era 30 veces menos eficiente. Mientras que T y P (así como S) en la posición P2 son los preferidos por GzmB humana, que no son tolerados GzmB ratón. Por el contrario, hemos demostrado claramente la actividad GzmB comparables en ambos lisados ​​de células humanas y de ratón NK utilizando el reactivo más genérico Boc-AAD-SBzl. Sin embargo, sólo la actividad GzmB humano podría ser detectada con el reactivo IEPD-pNA.

En conjunto, estos resultados ponen de relieve el hecho de que las diferencias de la multa especificidad de GzmB de diferentes especies pueden tener un gran impacto en cómo elegirun sustrato apropiado para el análisis in vitro. En resumen, si se investiga la detección de ratón, la actividad GzmB humano o de rata, Boc-AAD-SBzl es el sustrato de elección.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SMSB05 Granzyme B substrate (mouse and human)
Ac-IEPD-pNA  SM Biochemicals LLC, CA SMPNA009 Granzyme B substrate (only human)
N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl Sigma-Aldrich C3647 Granzyme A substrate
Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SB025 Granzyme H substrate
5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)  Sigma-Aldrich D8130 DTNB, Ellman’s Reagent
NK cell isolation kit II mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-096-892 negative selection kit
NK cell isolation kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-092-657 negative selection kit
Plate reader Biorad iMark Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3
Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate Corning, MA, USA 2797

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References

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Química Número 93 granzima B proteasa serina tioésteres peptídicos BOC-Ala-Ala-Asp-S-Bzl sustrato colorimétrico la hidrólisis la actividad asp-asa
Un ensayo colorimétrico que mide específicamente granzima B actividad proteolítica: La hidrólisis de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
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Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. … More

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).

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