Abstract
L'infection grippale est associée à environ 36 000 morts et plus de 200 000 hospitalisations chaque année aux États-Unis. L'émergence continue de nouvelles souches de virus de la grippe en raison de la mutation et de réassortiment complique le contrôle du virus et nécessite le développement permanent de nouveaux médicaments et vaccins. L'étude de la grippe en laboratoire nécessite une méthode fiable et rentable pour la propagation du virus. Ici, un protocole complet est fourni pour la grippe A propagation des virus dans des œufs de poule fertiles, ce qui donne toujours des stocks viraux à titre élevé. En bref, le sérum (SPF) des œufs de poule fécondés exempts d'agents pathogènes sont incubées à 37 ° C et 55-60% d'humidité pendant 10 à 11 jours. Sur cette période, le développement de l'embryon peut être facilement contrôlé en utilisant un candler d'oeuf. Virus inoculation est effectuée par injection de stock de virus dans la cavité allantoïque en utilisant une aiguille. Après 2 jours d'incubation à 37 ° C, les oeufs sontréfrigérés pendant au moins 4 heures à 4 ° C. La coquille d'oeuf au-dessus de la poche d'air et la membrane chorio-allantoïde sont ensuite ouvert avec précaution, et le fluide allantoïque contenant le virus est récolté. Le liquide est éliminé de débris par centrifugation, aliquoté et transféré à -80 ° C pour stockage à long terme. La grande quantité (5-10 ml de liquide par oeuf contenant virus) titre et de haute virus qui est habituellement obtenue avec ce protocole a fait l'utilisation d'œufs pour la préparation de virus notre méthode favorable, en particulier pour les études in vitro qui nécessitent de grandes quantités de virus où des dosages élevés de la même stock de virus sont nécessaires.
Introduction
La grippe A continue d'être une menace majeure pour la santé humaine. Ce est une maladie respiratoire potentiellement dévastatrice avec une grande charge mondiale causant jusqu'à 500 000 décès dans le monde chaque année 1. Les virus grippaux sont dans la famille des Orthomyxoviridae et portent huit sens négatif ARN simple brin dans leur génome 1,2. La haute mutabilité (ce est à dire, "dérive" antigénique) du génome viral empêche immunité à long terme. En outre, la grippe est de plus en plus résistantes aux médicaments anti-viraux 3.
La pandémie de grippe H1N1 2009 a mis en évidence toutes les questions difficiles associés à la maladie de la grippe (souche pandémique, la résistance anti-virale, la production de vaccins retardé). La formulation de vaccin est déterminé annuellement par l'Organisation mondiale de la santé pour les souches de la grippe les plus susceptibles pathogènes (un pour chaque H1N1, H3N2 et la grippe B) 4. Parce que cette méthode est basée sur la souche de grippe annoncées, les souches pathogènes sont parfois mal identifiés et l'efficacité du vaccin diminue considérablement. En outre, l'apparition de nouvelles souches de la grippe peut contourner ces programmes de prévention en cas de pandémie provoquant la maladie 2.
La création d'un vaccin contre la grippe universelle a été difficile à atteindre 5. Par conséquent, la recherche doit se poursuivre dans la compréhension de la pathogenèse des lésions pulmonaires. Pour la recherche en laboratoire de l'installation, plusieurs méthodes ont été développées pour l'isolement du virus et la propagation 6. Virus de la grippe humaine peuvent être amplifiés dans une variété de substrats de cellules de mammifères. Cependant, générant virus de titre élevé en grandes quantités sont mieux atteints dans des oeufs embryonnés. Le protocole suivant décrit une technique pour la grippe A propagation du virus et le stockage de stocks de virus existants.
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Protocol
NOTE: Remarques générales: Effectuer toutes les procédures impliquant la manipulation de l'œuf dans des conditions stériles, et la technique stérile doit être utilisé en conséquence. Pré-nettoyer tous les équipements avec 70% d'éthanol avant utilisation. En général, l'inoculation du virus de la grippe et la récolte doivent être effectués dans un laboratoire BSL-2. Toutefois, si ce protocole est utilisé pour propager beaucoup plus pathogène virus de la grippe (par exemple, les souches pandémiques et prépandémiques, souches qui présentent un danger pour la volaille et le bétail, les souches de la grippe aviaire hautement pathogène, le 1918 souche H1N1), les niveaux de biosécurité plus élevés et dans certains cas, des mesures de biosécurité et autorisations sont nécessaires. Le comité institutionnel de biosécurité locale devrait approuver toutes les recherches sur le virus de la grippe.
1. Préparation des oeufs pour l'inoculation
- Obtenir des œufs aviaires (SPF) exempts d'agents pathogènes fraîchement fécondé sériques d'un fournisseur approprié. Typiquement, des œufs de poule sont utilisés. Les œufs doivent être noused immédiatement à l'arrivée.
- À l'arrivée mettre les œufs dans un incubateur d'œufs humidifié avec un tourneur automatique des oeufs pour faire tourner les oeufs régulièrement. Si un tourneur automatique des oeufs ne est pas disponible, faire pivoter manuellement oeufs au moins 2 à 3 fois par jour (assurez-vous de porter des gants et de garder tout aussi stérile que possible).
- Incuber les œufs à 37 ° C et 55-60% d'humidité pendant 10 à 11 jours.
2. mirage des oeufs
- Utilisez un candler d'oeuf à examiner l'œuf devant une lumière vive dans une pièce sombre pour vérifier les œufs de l'infertilité par mirage après environ 7 ou 8 jours d'incubation.
- Essuyez le candler d'œuf avec 70% d'éthanol. Changer de gants souvent et désinfecter avec 70% d'éthanol afin de minimiser le risque de contamination par des agents pathogènes.
- Retirer les oeufs dans l'incubateur et les placer dans des boîtes d'œufs vides.
- Éteignez les lumières dans la salle.
- Maintenez la grande fin de chaque oeuf un à la fois contre le candler.
- Observez l'œuf Détermineze si elle est fertile ou infertile.
REMARQUE: les vaisseaux sanguins minces conduisant à un embryon en forme de haricot doit être clairement visible. Les œufs non fécondés apparaissent comme une tache de sang petite avec un jaune d'œuf visible.
- Jeter les œufs qui sont fécondés, et retourner les oeufs viables à l'incubateur. Ne laissez pas œufs à l'extérieur de l'incubateur pendant plus de 30 min. Si l'état d'un œuf ne peut être confirmée, marquer, et observer plus tard.
3. Préparation de l'inoculum Virus
- Diluer virus de la grippe disponibles à environ 10 mars au 10 avril pfu / ml dans du PBS stérile contenant 10 mM HEPES (pH 7,4). Étape critique: Diluer le stock de virus immédiatement avant l'emploi et garder le virus dilué sur la glace tout le temps.
4. Virus de la grippe inoculation par voie allantoïdienne
- Le jour de l'inoculation du virus (jours 10 ou 11), bougie à nouveau les oeufs et éliminer les embryons morts. Distinguer embryons vivants parla recherche de mouvement à l'intérieur de l'œuf.
- Retirez trois oeufs de l'incubateur, et d'organiser les oeufs dans un support séparé avec le sac d'air vers le haut.
- Marquer l'espace aérien des oeufs avec un marqueur permanent.
- Laver la coquille dessus de l'espace aérien avec 70% d'éthanol.
- Mettez les œufs avec l'air l'espace dans une boîte d'œufs et dans une hotte de biosécurité (BSL-2).
- Utiliser une aiguille de 18G stérile pour percer un petit trou dans la coquille sur le sac d'air de chaque œuf. Veillez à ne pas insérer l'aiguille trop profondément pour éviter poignarder l'embryon ou le jaune.
- Dessinez le virus de la grippe diluée dans une seringue de 1 ml stérile et fixer une aiguille de 22G.
- Avancer avec précaution la seringue avec une aiguille à un angle dans la cavité allantoïdienne 45 °.
- Injecter 0,2 ml du virus dilué de la grippe.
- Répéter l'injection avec les deux autres oeufs, puis jeter la seringue et l'aiguille.
- Sceller le trou avec une goutte de colle à partir d'un pistolet à colle (ou de la cire de paraffine fondue). Be Veillez à ce que la colle ne fuit pas à l'intérieur de l'œuf.
- Placez les oeufs de nouveau dans l'incubateur d'œufs avec l'espace d'air pointé vers le haut.
- Répétez les étapes 4.2 à 4.12 jusqu'à ce que tous les oeufs ont été inoculés.
5. Temps d'incubation
- Incuber les œufs infectés sans tourner à 37 ° C et ~ 60% d'humidité.
- Choisir le temps d'incubation optimal en fonction du type de virus de la grippe. Incuber la grippe A pendant 48 h; incuber la grippe B et C pendant 72 heures.
6. Virus de la grippe récolte
- Après la période d'incubation, les oeufs refroidir à 4 ° C pendant un minimum de 4 heures (ou O / N) pour tuer l'embryon et la constriction des vaisseaux sanguins pour réduire le risque de contamination du fluide allantoïque infecté avec le sang. Pour ce faire, pour empêcher les globules rouges de l'absorption du virus, ce qui réduit le rendement. Alternativement, les œufs de refroidissement pendant 30 min à -20 ° C; Mais cela augmente le risque de contamination par le sang.
- Après les oeufs ont été suffisamment refroidi, transférer les oeufs à une hotte de biosécurité. Placez l'oeuf dans un support solide avec le sac d'air vers le haut. Nettoyer la surface de l'œuf avec 70% d'éthanol.
- Utilisez des ciseaux stériles pour ouvrir la coquille dessus de la poche d'air. Retirer la coquille autour de la poche d'air tout en faisant attention de ne pas détruire la membrane chorioallantoïque.
- Ouvrez la membrane chorioallantoïque avec des pinces stériles contondants. Déplacez doucement côté l'embryon et le sac jaune avec une petite spatule ou une cuillère. Prenez soin de ne pas rompre le jaune.
- L'utilisation d'un 1 ml pipette Eppendorf, recueillir soigneusement le fluide allantoïque. Si nécessaire, inclinez l'œuf un peu sur le côté pour recueillir autant de liquide que possible.
- Mélanger le liquide allantoïdien de tous les oeufs dans un tube en plastique conique de 50 ml. Garder les tubes sur la glace en tout temps pendant la récolte de virus. Un rendement d'oeufs 5-10 ml d'un fluide légèrement jaunâtre.
- Spin le fluide allantoïque contenant le virus à 1000 g pendant 10 min à 46; C pour sédimenter les débris. Transférer le liquide clair dans un nouveau tube de 50 ml conservé dans la glace. Éliminer œufs dans un conteneur à déchets BSL-2.
7. Stockage
- Aliquoter immédiatement le fluide clarifié allantoïdien (par exemple, 50, 100 ou 500 ul aliquotes) et enclenchez-gel dans l'azote liquide. Transfert stocks de virus congelés à -80 ° C congélateur pour le stockage à long terme.
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Representative Results
Plusieurs méthodes ont été développées pour titrer le virus de la grippe. Une considération lors du choix d'une méthode appropriée est que certains déterminer particules totales, indépendamment de la viabilité (par exemple, le dosage de l'hémagglutinine) alors que d'autres sont basés sur l'infectiosité, qui permettra d'évaluer virions viables (par exemple, essai de plaque) 6. Ici, le titre viral de liquide allantoïdien recueilli à partir d'œufs de poulet inoculés avec un virus de la grippe adapté à la souris (A / PR / 8/34) a été déterminé par dosage de plaque (figure 1) et essai d'hémagglutination (figure 2).
infection par le virus de la grippe provoque un effet cytopathogène qui se traduisent par des plaques (zones circulaires de cellules lysées) pour former sur une monocouche de cellules. Les plaques ont été visualisées par coloration des cellules avec du violet cristallisé, et 65 les plaques ont été comptées dans le puits avec la 10 -12 dilution de virus (figure 1). Parce que 500 L de stock virale diluée wcomme mis sur les cellules, le titre final est de 1,3 x 10 14 PFU / ml.
Le test d'hémagglutination est un procédé pour titrer des bases de virus de la grippe sur la capacité du virus à se fixer à la surface des globules rouges. Une suspension virale agglutiner les globules rouges, les empêchant ainsi de se déposer hors de la suspension. En utilisant des dilutions en série du virus dans une plaque à 96 puits (soit V ou fond rond) et en ajoutant une quantité fixe de globules rouges, le titre viral peut être déterminé. Un résultat clairement négatif n'a été observé avec le complexe 1: 2 10 dilution du virus dans 50 pi (figure 2). Par conséquent, le titre final est de 2,1 x 10 4 HAU / ml.
La quantification de la figure 1. Le titrage du virus PR8 de la plaque de dosage. Une monocouche de cellules MDCK a été infectée avec 10 fois serial dilutions de PR8 (10 -1 à 10 -12) pendant 1 heure, lavées, puis recouvertes avec une solution d'agarose à 0,6%. Après incubation à 37 ° C pendant 72 heures, la gélose a été soigneusement enlevé et les cellules ont été fixées et colorées avec du cristal violet à 0,25%. Formation de la plaque a été comparer à un témoin non infecté (CTR). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. hémagglutination (HA) Dosage de titrer oeuf dérivé PR8 virus grippal. Virus PR8 a été dilué en série deux fois dans du PBS et mélangé avec 50 l de 0,5% de dinde globules rouges. Les dilutions ont été préparées en quatre exemplaires, et les photos ont été prises après une heure d'incubation à la température ambiante. Les résultats négatifs apparaissent comme des points au centre des puits alors que des résultats positifsformer une couleur rougeâtre uniforme à travers le bien. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L'influenza cause une grande charge mondiale de morbidité, et le travail se poursuit dans la compréhension de la pathogenèse des lésions pulmonaires 7. Pour la recherche facilitée dans cette maladie mortelle, diverses méthodes ont été développées pour propager le virus de la grippe 6. Ici, nous décrivons une technique pour produire des virus de la grippe dans les oeufs de poulet. L'avantage de cette méthode est qu'il est hautement reproductible et se traduit par de grandes quantités de titre élevé stocks de virus de la grippe, ce qui est souvent nécessaire pour des études in vitro.
La plupart des laboratoires seront en mesure de développer ce protocole rapidement et facilement avec les coûts de démarrage minimes. Bien que nous recommandons d'investir dans un incubateur d'œufs avec tourneur automatique, ce protocole peut être menée à bien sans un tel équipement, mais sera plus laborieuse. Nous recommandons également d'utiliser les fournisseurs commerciaux de recherche pour l'achat d'œufs fécondés pour garantir la cohérence et la stérilité des oeufs. Le Bureau du LaboratORY protection des animaux (OLAW) interprétation de la Politique Public Health Service (PHS) sur Humane soin et l'utilisation des animaux de laboratoire Unis pour l'utilisation de la recherche des oeufs embryonnés vivants aviaires que la politique PHS ne est applicable après l'éclosion. Par conséquent, la plupart des institutions ne auront pas besoin d'approbation IACUC pour ce protocole. Cependant, les politiques varient selon les institutions, et l'approbation comité institutionnel de biosécurité seront nécessaires avant de lancer ce protocole.
Lorsque vous travaillez avec le virus, il est primordial de maintenir le virus à 4 ° C après la récolte du liquide allantoïdien de l'œuf embryonnés infectés. Chaque œuf devrait produire entre 5-10 ml de fluide allantoïque, et le titre dépend de la souche de virus de la grippe. Notre laboratoire a couramment utilisé cette méthode pour propager une souche de la grippe H1N1 de souris adapté (A / PR / 8/34). Ce protocole peut également être utilisé pour des échantillons cliniques, mais dans cette situation, l'inoculation de la cavité amniotique peut être préférable en raison de la presence d'acides 2,6-sialique liés nécessaire pour la liaison au sein de la doublure amniotique 8,9. Une autre considération est que cette méthode peut ne pas être idéal pour la propagation des virus de la grippe aviaire (par exemple, des souches H5N1) en raison de la pathogénicité pour l'embryon.
Diverses méthodes de titrage du virus de la grippe ont été développées qui ont toutes leurs avantages et leurs inconvénients. En effet, la quantification virale peut être à base de protéines (par exemple, le dosage de l'hémagglutinine, ELISA), (par exemple, essai de plaque virale) à base d'acide nucléique (PCR par exemple, quantitative), ou fonctionnelle 6. Tests non-fonctionnels seront déterminer le total des titres viraux indépendamment de se ils sont vivants ou morts particules virales. Par conséquent, les tests de l'activité infectieuse du virus de la grippe mesurera virus vivant et permettre une équivalence fonctionnelle comparables d'un lot à. L'essai de formation de plaques est un essai couramment utilisé qui peut évaluer les titres de la grippe vivant virnous, mais peut être lent et encombrant pour effectuer 10. En comparaison, le dosage de l'hémagglutinine est simple et facile, mais ne permet pas d'évaluer la viabilité et détermine toutes les particules de la grippe.
Ici, nous fournissons une méthode relativement facile à propager le virus à titre élevé de la grippe. L'initiation de novo de ce protocole dans un laboratoire est simple, et les matériaux et l'équipement de départ sont relativement peu coûteux.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | ||
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol>99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
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