Abstract
זיהום שפעת קשור על 36,000 מקרי מוות ויותר מ -200,000 אשפוזים מדי שנה בארצות הברית. הופעתה המתמשכת של זני נגיף שפעת חדשים עקב מוטציה ומחדש מבחר מסבכת את השליטה של הנגיף ומחייבת פיתוח הקבוע של תרופות וחיסונים רומן. המחקר מבוסס המעבדה של שפעת דורש שיטה אמינה וחסכונית להתפשטות של הווירוס. כאן, פרוטוקול מקיף מסופק לשפעת התפשטות וירוס בביצי תרנגולת פורה, אשר מניבה באופן עקבי מניות נגיפיות גבוה כייל. בקיצור, ביצי סרום הפתוגן ללא (SPF) מופרה עוף טופחו על 37 מעלות צלזיוס ולחות% 55-60 במשך 10 - 11 ימים. במהלך תקופה זו, פיתוח עובר יכול להיות במעקב בקלות באמצעות קנדלר ביצה. חיסון וירוס מתבצע על ידי הזרקה של מניות וירוס לתוך חלל allantoic באמצעות מחט. אחרי 2 ימים של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, הביציםמצונן לפחות 4 שעות על 4 מעלות צלזיוס. קליפת הביצה מעל שק האוויר וקרום chorioallantoic לאחר מכן פתחה בזהירות, ונוזל allantoic המכיל את הנגיף שנקטפו. הנוזל מנוקה מפסולת על ידי צנטריפוגה, aliquoted והועבר ל-80 ° C לאחסון לטווח ארוך. הכמות הגדולה (5-10 מיליליטר של נוזל לביצה המכיל וירוס) כייל נגיף וגבוה אשר בדרך כלל מושגת עם פרוטוקול זה הפכה את השימוש בביצים להכנת וירוס השיטה נוחה שלנו, בפרט ללימודים במבחנה הדורשים כמויות גדולות של וירוס שבמינונים גבוהים של אותו מניות הווירוס יש צורך.
Introduction
השפעת ממשיך להיות איום גדול לבריאות אדם. זוהי מחלה בדרכי הנשימה שעלול להיות הרסנית עם נטל גלובלי גדול גורם עד 500,000 מקרי המוות בעולם בשנה 1. נגיפי שפעת נמצאים במשפחת Orthomyxoviridae ולבצע RNA חד-גדילי 8 תחושה שלילית בגנום שלהם 1,2. הניוון הגבוה (כלומר "להיסחף", אנטיגני) של הגנום הנגיפי מונע חסינות לטווח ארוך. יתר על כן, השפעת היא עמידה יותר ויותר לתרופות אנטי-ויראליות 3.
מגיפת שפעת שפעת H1N1 2009 הדגישה את כל הנושאים המאתגרים הקשורים למחלת שפעת (זן מגפה, התנגדות אנטי-נגיפית, ייצור חיסון מתעכב). ניסוח החיסון נקבע מדי שנה על ידי ארגון הבריאות העולמית לזני שפעת הסביר ביותר פתוגניים (אחד עבור כל H1N1, H3N2 ושפעת B) 4. מכיוון ששיטה זו מבוססת על זן שפעת חזהים, זנים פתוגניים מעת לעת באופן שגוי שזוהו ויעילות חיסון יורדת באופן דרמטי. יתר על כן, את המראה של זני שפעת רומן יכול לעקוף תוכניות המניעות אלה גורמים למחל מגיפת 2.
יצירת חיסון נגד שפעת אוניברסלית כבר חמקמקה 5. לכן, מחקר חייב להמשיך להבנת הפתוגנזה של פציעת ריאות. למחקר במעבדה מתקן, במספר שיטות פותחו עבור בידוד וריבוי 6 ויראלי. יכולים להיות מוגברים נגיפי שפעת אנושיים במגוון רחב של מצעי תאים יונקים. עם זאת, וירוסים גבוה כייל יצירה בכמויות גדולות מושגות הטובות ביותר בביצי embryonated. הפרוטוקול הבא מתאר טכניקה לשפעת התפשטות וירוס ואחסון ממניות וירוס קיימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הערות כלליות: בצע את כל הנהלים הקשורים מניפולציה של הביצה בתנאים סטריליים, ויש להשתמש בי טכניקה סטרילית בהתאם. טרום נקי כל הציוד עם אתנול 70% לפני השימוש. באופן כללי, חיסון נגיף שפעת וקציר צריכים להתנהל במעבדה BSL-2. עם זאת, אם פרוטוקול זה משמש כדי להפיץ הרבה יותר פתוגניים נגיפי שפעת (למשל, זני מגיפה ומראש מגיפה, זנים שמהווים סכנה לעופות ובעלי חיים, זני שפעת עופות אלימים במיוחד, זן H1N1 1918), רמות בטיחות ביולוגיות גבוהות ו בחלק ממקרים, אמצעי זהירות ביטחון ביולוגי ואישורים נדרשים. ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית המקומית צריכה לאשר את כל המחקר מעורב נגיף שפעת.
1. הכנת הביצים להרכבת חיסון
- להשיג ביצי עופות לפתוגן חופשי (SPF) טרי מופרה סרום מספק מתאים. בדרך כלל, ביצי תרנגולת משמשות. ביצים צריכה להיות לנוed מייד עם הגעה.
- על ביצי מקום הגעה בחממה ביצת humidified עם טרנר ביצה אוטומטי כדי לסובב ביצים באופן קבוע. אם טרנר ביצה אוטומטי אינו זמין, לסובב ידני ביצים לפחות 2-3 פעמים ביום (הקפד ללבוש כפפות ולשמור הכל כסטרילי ככל האפשר).
- דגירה ביצים על 37 מעלות צלזיוס ולחות% 55-60 ל10-11 ימים.
Candling 2. ביצה
- השתמש קנדלר ביצה לבחון את הביצה נגד אור בהיר בחדר חשוך כדי לבדוק ביצים לבעיות פוריות בcandling לאחר כ -7 או 8 ימים של דגירה.
- נגב את קנדלר הביצה עם אתנול 70%. לשנות כפפות לעתים קרובות ולחטא עם אתנול 70% כדי לצמצם את הסיכון לזיהום על ידי פתוגנים.
- הסר את הביצים מן החממה ולמקם אותם בקרטונים ביצים ריקים.
- כבה את האורות בחדר.
- החזק את הקצה הרחב של כל ביצה אחת בכל פעם נגד קנדלר.
- שים לב לביצה לdeterminדואר אם זה פורה או לא פורה.
הערה: כלי דם דקים מובילים לעובר בצורת שעועית צריכה להיות ברור לעין. ביצים מופרה תופיע ככתם דם קטן עם חלמון ביצת עין.
- השלך ביצים כי הם מופרה, ולהחזיר את ביצי קיימא לחממה. אל תשאיר ביצים מחוץ לחממה עבור יותר מ -30 דקות. אם המצב של ביצה לא ניתן לאשר, לסמן אותו, ולבחון אותו מאוחר יותר.
3. הכנת הבידוד וירוס
- לדלל מניות וירוס שפעת לכ 10 מרס - 10 אפריל pfu / מיליליטר PBS סטרילי המכיל 10 מ"מ HEPES (pH 7.4). צעד קריטי: לדלל את מניות הווירוס מייד לפני השימוש ולשמור את הווירוס בדילול מלא על קרח כל הזמן.
4. הרכבת חיסון שפעת וירוס דרך כביש allantoic
- ביום של חיסון וירוס (יום 10 או 11), נר הביצים שוב ולחסל את כל עוברים מתים. להבחין עוברים חיים על ידימחפש תנועה בתוך הביצה.
- הסר את שלוש ביצים מן החממה, ולסדר את הביצים בבעל נפרד עם שק האוויר למעלה.
- סמן את המרחב האווירי של הביצים עם סמן קבע.
- לשטוף את קליפת הביצה מעל המרחב האווירי עם 70% אתנול.
- שים את הביצים עם החלל עד האוויר בקרטון ביצים ולמכסת מנוע בטיחות ביולוגי (BSL-2).
- שימוש במחט 18G סטרילי אגרוף חור קטן בקליפה מעל שק האוויר של כל ביצה. היזהר שלא להכניס את המחט עמוקה מדי, כדי למנוע דקירת העובר או חלמון.
- צייר את נגיף השפעת המדולל לתוך מזרק 1 מיליליטר סטרילי ולצרף מחט 22g.
- לקדם בזהירות את המזרק עם מחט בזווית של 45 מעלות לתוך חלל allantoic.
- להזריק 0.2 מיליליטר של נגיף שפעת בדילול מלא.
- חזור על הזריקה עם שתי ביצים האחרות, ואז להשליך את המזרק ומחט.
- לאטום את החור עם ירידה של דבק מאקדח דבק (או שעוות פרפין נמס). Bדואר זהיר כי דבק לא ידלוף בתוך הביצה.
- מניחים את הביצים בחזרה לתוך חממת הביצה עם המרחב האווירי הצביע כלפי מעלה.
- חזור על שלבים 4.2-4.12 עד שכל הביצים כבר מחוסנת.
5. דגירה זמן
- לדגור על הביצים נגועות מבלי להפוך על 37 מעלות צלזיוס ולחות ~ 60%.
- בחר זמן דגירה אופטימלי בהתאם לסוג וירוס שפעת. דגירה שפעת במשך 48 שעות; דגירה השפעת B ו- C למשך 72 שעות.
6. וירוס שפעת קציר
- לאחר תקופת דגירה, לצנן את הביצים על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של 4 שעות (או O / N) כדי להרוג את העובר ולהצר את כלי הדם כדי להפחית את הסיכון של זיהום נוזל allantoic הנגוע בדם. לעשות את זה כדי למנוע את תאי דם האדומים מפני ספיגת הווירוס, אשר מפחית את התשואה. לחלופין, ביצי צינה למשך 30 דקות ב -20 ° C; אולם זה מגביר את הסיכון לזיהום בדם.
- לאחר הביצים היו מספיק קרות, להעביר את הביצים למכסת מנוע בטיחות ביולוגית. מניחים את הביצה לתוך בעל משרד עם שק האוויר פונה כלפי מעלה. נקה את משטח הביצה עם אתנול 70%.
- השתמש במספרי סטרילי כדי לפתוח את קליפת הביצה מעל שק האוויר. הסר את הקליפה סביב שק האוויר והקפד לא להרוס את קרום chorioallantoic.
- פתח את קרום chorioallantoic עם מלקחיים בוטים סטרילי. בעדינות להזיז הצידה את העובר וצק החלמון עם מרית קטנה או כף. יש להיזהר שלא לקרוע את החלמון.
- בעזרת פיפטה Eppendorf 1 מיליליטר, לאסוף בזהירות את נוזל allantoic. במידת הצורך, להטות את הביצה קצת לצד כדי לאסוף כנוזל עד כמה שניתן.
- מערבבים את נוזל allantoic מכל הביצים לתוך צינור חרוטי פלסטיק 50 מיליליטר. שמרו צינורות על קרח בכל העת במהלך קציר וירוס. תשואות ביצה אחת 5 - 10 מיליליטר של נוזל צהבהב במקצת.
- ספין נוזל allantoic המכיל וירוס XG ב 1000 במשך 10 דקות ב 46; C עד גלולה פסולת. העבר את הנוזל השקוף לתוך צינור 50 מיליליטר חדש כל הזמן על קרח. השלך ביצים לתוך מיכל פסולת BSL-2.
7. חפצים
- מייד aliquot הנוזל הבהיר allantoic (למשל, 50, 100 או 500 aliquots ul) וsnap-הקפאה בחנקן נוזלי. העבר את מניות וירוס קפוא ל-80 ° C במקפיא לאחסון לטווח ארוך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מספר שיטות פותחו כדי כייל נגיף שפעת. שיקול אחד בעת בחירת שיטה מתאימה הוא שחלק לקבוע חלקיקים כולל, ללא קשר ליכולת קיום (למשל, assay hemagglutinin) ואילו אחרים מבוססים על infectivity, אשר יהיה להעריך virions קיימא (למשל, assay פלאק) 6. כאן, כייל הנגיף של נוזל allantoic נאסף מביצי תרנגולת מחוסנת עם נגיף שפעת מותאם עכבר (/ יחסי ציבור / 8/34) נקבע על ידי assay פלאק (איור 1) וassay hemagglutination (איור 2).
זיהום בנגיף שפעת גורם לאפקט cytopathic שיגרום ללוחות (אזורים מעגליים של תאי lysed) כדי ליצור על monolayer של תאים. לוחות היו דמיינו ידי מכתים את התאים עם סגול גביש, ו -65 לוחות נספרו בהיטב עם 10 -12 הדילול של וירוס (איור 1). בגלל 500 L של מניית ויראלי מדוללת wכמונח על התאים, כייל הסופי הוא 1.3 x 10 14 PFU / מיליליטר.
Assay hemagglutination הוא שיטה לtiter בסיסי נגיף שפעת על יכולתו של הנגיף להיצמד אל פני השטח של תאי דם אדומים. השעיה ויראלי תהיה לְהִצְטָמֵד תאי דם האדומים, ובכך מונעת מהם היישוב מהשעיה. על ידי שימוש בדילולי סדרתי של נגיף בצלחת 96-היטב (או V- או תחתונה עגול) והוספת סכום קבוע של תאי דם אדומים, ניתן לקבוע כייל הנגיף. תוצאה ברורה שלילית נצפתה עם 1: 2 10 הדילול של וירוס ב -50 μl (איור 2). לכן, כייל הסופי הוא 2.1 x 10 4 HAU / מיליליטר.
איור 1. כימות כייל נגיף PR8 ידי הרובד Assay. Monolayer של תאי MDCK היה נגוע בסריה של פי 10דילולים l של PR8 (10 -1 - 10 -12) במשך שעה 1, שטפו, ולאחר מכן מצופה בפתרון agarose 0.6%. לאחר דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות, אגר הוסר בזהירות, ותאים קובעו ונצבעו עם 0.25% סגולים גביש. היווצרות רובד הייתה להשוות לשליטה נגוע (CTR). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Assay איור 2. Hemagglutination (HA) לוירוס שפעת PR8 נגזר ביצת כייל. וירוס PR8 היה סדרתי מדולל פי 2 בPBS ומעורבב עם 50 l של תאי דם אדום טורקיה 0.5%. דילולים נערכו quadruplicates, ותמונות צולמו לאחר הדגירה שעה 1 בRT. תוצאות שליליות מופיעות כנקודות במרכז הבארות ואילו תוצאות חיוביותיוצר צבע אדמדם אחיד על פני היטב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שפעת גורמת לניטל עולמי גדול של מחלה, ועבודה נמשכת להבנת הפתוגנזה של פציעת ריאות 7. למחקר הקל במחלה קטלנית, שיטות שונות פותחו כדי להפיץ את נגיף שפעת 6. כאן אנו מתארים טכניקה לייצר וירוס שפעת בביצי תרנגולת. היתרון של שיטה זו הוא שזה מאוד לשחזור ותוצאות בכמויות גדולות של מניות וירוס שפעת הגבוהה titer, שלעתים קרובות יש צורך במחקרים במבחנה.
רוב המעבדות תהיה מסוגלים לפתח פרוטוקול זה במהירות ובקלות עם start-up עלויות מינימליות. למרות שאנו ממליצים על השקעה בחממת ביצה עם טרנר האוטומטי, פרוטוקול זה יכול להסתיים בלי ציוד כזה, אבל יהיה קשה יותר. כמו כן, אנו ממליצים על שימוש בספקי מחקר מסחריים לרכישת ביצים מופרות כדי להבטיח עקביות ועקרות של הביצים. משרד Laboratפרשנות אורי צער בעלי החיים (OLAW) של מדיניות שירות לבריאות הציבור (PHS) על צער בעלי חיים טיפול ושימוש בחי מעבדה קובעת לשימוש מחקר של ביצי עופות embryonated חיות שמדיניות PHS ישימה רק לאחר הבקיעה. לכן, רוב המוסדות לא ידרשו אישור IACUC לפרוטוקול זה. עם זאת, מדיניות משתנות בין מוסדות, ואישור ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית יידרש לפני ביצוע פרוטוקול זה.
כאשר עובדים עם הווירוס, זה הוא בעל חשיבות עליונה לשמור על הווירוס ב 4 C לאחר קצירת נוזל allantoic מהנגוע ביצת embryonated. כל ביצה צפויה לייצר בין 5-10 מיליליטר של נוזל allantoic, וכייל תלוי בזן של נגיף שפעת. המעבדה שלנו משמשת באופן שגרתי בשיטה זו כדי להפיץ זן H1N1 של שפעת מותאמת עכבר (/ יחסי ציבור / 8/34). גם פרוטוקול זה יכול לשמש לדגימות קליניות, אבל במצב הזה, חיסון של החלל מי השפיר עשוי להיות עדיף בשל presence של חומצות sialic 2,6 צמודות דרוש למחייב בתוך מי שפיר הבטנה 8,9. שיקול נוסף הוא ששיטה זו לא יכולה להיות אידיאלית לאיתור וירוסי התפשטות שפעת עופות (למשל, זני H5N1) בשל פתוגניות לעובר.
שיטות שונות של titering וירוס השפעת פותחו כולם יש יתרונות וחסרונות שלהם. ואכן, כימות ויראלי יכול להיות מבוסס חלבון (לדוגמא, assay hemagglutinin, ELISA), (לדוגמא, assay פלאק נגיפי) גרעין מבוסס חומצה (PCR למשל, כמותי), או פונקציונלי 6. מבחני שאינם פונקציונליים יקבעו titers ויראלי הכולל, ללא קשר אם הם חיים או מתים חלקיקים נגיפיים. לכן, הבדיקה לפעילות המדבקת של נגיף השפעת תמדוד חיים וירוסים ולאפשר לשקילות פונקציונליות דומות ממגרש למגרש. Assay יוצרי פלאק הוא assay נפוץ שיכול להעריך titers של vir שפעת החישלנו, אבל יכול להיות איטי ומסורבל לביצוע 10. לשם השוואה, assay hemagglutinin הוא פשוט וברור, אבל לא להעריך את הכדאיות וקובע את כל חלקיקי השפעת.
במסמך זה, אנו מספקים שיטה קלה יחסית כדי להפיץ וירוס שפעת גבוה כייל. ייזום דה נובו של פרוטוקול זה במעבדה הוא פשוט, וחומרי המוצא והציוד זולים יחסית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | ||
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol>99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , Wiley. (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
