Abstract
इन्फ्लूएंजा संक्रमण के बारे में 36,000 लोगों की मृत्यु और संयुक्त राज्य अमेरिका में 200,000 से अधिक अस्पताल में भर्ती हर साल के साथ जुड़ा हुआ है। उत्परिवर्तन और फिर से वर्गीकरण के कारण नया इन्फ्लूएंजा वायरस उपभेदों के सतत उद्भव वायरस के नियंत्रण पेचीदा और उपन्यास दवाओं और टीकों के स्थायी विकास जरूरी है। इन्फ्लूएंजा की प्रयोगशाला आधारित अध्ययन वायरस के प्रसार के लिए एक विश्वसनीय और लागत प्रभावी विधि की आवश्यकता है। इधर, एक व्यापक प्रोटोकॉल लगातार उच्च अनुमापांक वायरल शेयरों पैदावार जो उपजाऊ चिकन अंडे में इन्फ्लुएंजा ए वायरस के प्रसार के लिए प्रदान की जाती है। 11 दिन - संक्षेप में, सीरम रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ़) निषेचित चिकन अंडे 37 डिग्री सेल्सियस और 10 के लिए 55-60% नमी में incubated रहे हैं। इस अवधि के दौरान, भ्रूण के विकास को आसानी से एक अंडा Candler का उपयोग करते हुए नजर रखी जा सकती है। वायरस टीका एक सुई का उपयोग allantoic गुहा में वायरस शेयर के इंजेक्शन के द्वारा किया जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के दो दिनों के बाद, अंडे कर रहे हैं4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 4 घंटे के लिए ठंडा। हवा की थैली और chorioallantoic झिल्ली से ऊपर खोल तो ध्यान से खुल रहे हैं, और वायरस युक्त द्रव्य काटा जाता है। तरल पदार्थ, centrifugation द्वारा मलबे से मंजूरी दे दी aliquoted और लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस को सौंप दिया है। बड़ी राशि आम तौर पर इस प्रोटोकॉल के साथ हासिल की है और जो उच्च वायरस अनुमापांक (वायरस युक्त अंडा प्रति तरल पदार्थ के 5-10 मिलीग्राम) बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है जो इन विट्रो अध्ययन के लिए विशेष रूप से, वायरस तैयारी हमारे अनुकूल विधि के लिए अंडे का उपयोग कर दिया गया है वायरस की, जिसमें एक ही वायरस शेयर की उच्च dosages की जरूरत है।
Introduction
इन्फ्लुएंजा एक मानव स्वास्थ्य के लिए एक बड़ा खतरा बना हुआ है। यह एक बड़े वैश्विक बोझ दुनिया भर में प्रतिवर्ष एक 500,000 से होने वाली मौतों के लिए ऊपर के कारण के साथ एक संभावित विनाशकारी सांस की बीमारी है। इन्फ्लुएंजा वायरस परिवार Orthomyxoviridae में हैं और उनके जीनोम 1,2 में आठ नकारात्मक भावना एकल असहाय शाही सेना ले। वायरल जीनोम की उच्च mutability (यानी, प्रतिजनी "बहाव") लंबी अवधि के उन्मुक्ति को रोकता है। इसके अलावा, इन्फ्लूएंजा विरोधी वायरल दवाओं 3 के लिए तेजी से प्रतिरोधी है।
2009 H1N1 इन्फ्लूएंजा महामारी इन्फ्लूएंजा रोग (महामारी तनाव, विरोधी वायरल प्रतिरोध, देरी वैक्सीन उत्पादन) के साथ जुड़े सभी चुनौतीपूर्ण मुद्दों पर प्रकाश डाला। टीका तैयार करने की संभावना सबसे अधिक रोगजनक इन्फ्लूएंजा उपभेदों 4 (H1N1, H3N2 और इन्फ्लूएंजा बी के लिए एक-एक) के लिए विश्व स्वास्थ्य संगठन द्वारा प्रतिवर्ष निर्धारित किया जाता है। इस विधि की भविष्यवाणी इन्फ्लूएंजा तनाव पर आधारित है क्योंकिएस, रोगजनक उपभेदों कभी कभी गलत ढंग से पहचान की है और टीका प्रभावकारिता नाटकीय रूप से बूँदें हैं। इसके अलावा, उपन्यास इन्फ्लूएंजा उपभेदों की उपस्थिति महामारी रोग 2 के कारण इन preventative के कार्यक्रमों को दरकिनार कर सकते हैं।
एक सार्वभौमिक इन्फ्लूएंजा टीका के निर्माण के लिए 5 मायावी किया गया है। इसलिए, अनुसंधान फेफड़ों की चोट के रोगजनन को समझने में जारी रहना चाहिए। सुविधा प्रयोगशाला अनुसंधान करने के लिए, कई तरीकों वायरल अलगाव और प्रचार 6 के लिए विकसित किया गया है। मानव इन्फ्लूएंजा वायरस स्तनधारी सेल substrates के एक किस्म में परिलक्षित किया जा सकता है। हालांकि, बड़ी मात्रा में पैदा करने के लिए उच्च अनुमापांक वायरस सबसे अच्छा embryonated अंडे में प्राप्त कर रहे हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल इन्फ्लूएंजा के लिए मौजूदा वायरस शेयरों से एक वायरस के प्रसार और भंडारण के लिए एक तकनीक का वर्णन है।
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Protocol
जनरल की टिप्पणी: नोट: बाँझ शर्तों के तहत अंडे के हेरफेर से जुड़े सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन, और बाँझ तकनीक तदनुसार इस्तेमाल किया जाना चाहिए। 70% इथेनॉल के साथ सभी उपकरण उपयोग करने से पहले प्री-साफ। सामान्य में, इन्फ्लूएंजा वायरस टीका और फसल एक बीएसएल -2 प्रयोगशाला में आयोजित किया जाना चाहिए। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का प्रचार करने के लिए प्रयोग किया जाता है और अधिक रोगजनक इन्फ्लूएंजा वायरस (जैसे, महामारी और पूर्व महामारी उपभेदों, मुर्गी और पशुओं, उच्च रोगजनक एवियन इन्फ्लूएंजा उपभेदों, 1918 H1N1 के तनाव के लिए खतरा उत्पन्न कि उपभेदों), उच्च जैव सुरक्षा का स्तर और कुछ मामलों में, biosecurity सावधानियों और प्राधिकरण की आवश्यकता है। स्थानीय संस्थागत जैव सुरक्षा समिति इन्फ्लूएंजा वायरस से जुड़े सभी शोध को मंजूरी देना चाहिए।
टीका के लिए अंडे की 1. तैयारी
- एक उपयुक्त विक्रेता से सीरम रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ़) हौसले से निषेचित एवियन अंडे प्राप्त करते हैं। आमतौर पर, चिकन अंडे किया जाता है। अंडे हमें होना चाहिएतुरंत आगमन पर एड।
- एक स्वत: अंडा टर्नर के साथ एक humidified अंडे इनक्यूबेटर में आगमन जगह अंडे नियमित रूप से अंडे बारी बारी से करने के लिए पर। एक स्वत: अंडा टर्नर उपलब्ध नहीं है, तो मैन्युअल रूप से कम से कम 2-3 बार एक दिन (दस्ताने पहनते हैं और संभव के रूप में बाँझ के रूप में सब कुछ रखने के लिए सुनिश्चित कर लें) अंडे बारी बारी से।
- 37 डिग्री सेल्सियस और 10-11 दिनों के लिए 55-60% नमी में अंडे सेते हैं।
2. अंडे Candling
- ऊष्मायन के बारे में सात या आठ दिनों के बाद Candling द्वारा बांझपन के लिए अंडे की जांच करने के लिए एक अंधेरे कमरे में एक उज्ज्वल प्रकाश के खिलाफ अंडे की जांच के लिए एक अंडे Candler का प्रयोग करें।
- 70% इथेनॉल के साथ अंडा Candler साफ कर लें। अक्सर दस्ताने बदलें और रोगजनकों द्वारा संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित।
- इनक्यूबेटर से अंडे निकालें और खाली अंडे डिब्बों में उन्हें जगह है।
- कमरे में लाइट बंद।
- Candler के खिलाफ एक बार में एक अंडा एक की बड़ी अंत पकड़ो।
- Determin अंडे का निरीक्षणई यह उपजाऊ या बांझ है।
नोट: एक सेम के आकार भ्रूण को प्रमुख पतली रक्त वाहिकाओं स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए। Unfertilized अंडे एक दृश्य अंडे की जर्दी के साथ एक छोटे से रक्त स्थल के रूप में दिखाई देगा।
- Unfertilized हैं कि अंडे त्यागें, और इनक्यूबेटर व्यवहार्य अंडे वापसी। अधिक से अधिक 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर के बाहर अंडे मत छोड़ो। एक अंडे की स्थिति की पुष्टि नहीं की जा सकती है, यह निशान, और बाद में यह निरीक्षण करते हैं।
वायरस inoculum 3. तैयारी
- 10 मिमी HEPES (7.4 पीएच) युक्त बाँझ पीबीएस में 10 4 pfu / मिलीलीटर - के बारे में 10 से 3 इन्फ्लूएंजा वायरस शेयर पतला। महत्वपूर्ण कदम: तुरंत उपयोग करने से पहले वायरस शेयर पतला और बर्फ पर हर समय पतला वायरस रहते हैं।
Allantoic मार्ग के माध्यम से 4. इन्फ्लुएंजा वायरस टीका
- वायरस टीका (10 दिन या 11) के दिन, फिर अंडे मोमबत्ती और किसी भी मृत भ्रूण को खत्म करने। द्वारा लाइव भ्रूण भेदअंडे के अंदर आंदोलन के लिए देख रहे हैं।
- इनक्यूबेटर से तीन अंडे निकालें, और हवा की थैली ऊपर के साथ एक अलग धारक में अंडे की व्यवस्था।
- एक स्थायी मार्कर के साथ अंडे की हवा अंतरिक्ष निशान।
- 70% इथेनॉल के साथ हवा अंतरिक्ष से ऊपर खोल धो लें।
- एक अंडा दफ़्ती में और एक जैव सुरक्षा हुड (बीएसएल -2) में हवा अंतरिक्ष के साथ अंडे रखो।
- प्रत्येक अंडे की हवा की थैली से अधिक खोल में एक छोटा सा छेद पंच के लिए एक बाँझ 18G सुई का प्रयोग करें। भ्रूण या जर्दी छुरा से बचने के लिए भी गहराई से सुई डालने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
- एक बाँझ 1 मिलीलीटर सिरिंज में पतला इन्फ्लूएंजा वायरस ड्रा और एक 22G सुई देते हैं।
- ध्यान से allantoic गुहा में एक 45 डिग्री के कोण पर सुई के साथ सिरिंज अग्रिम।
- पतला इन्फ्लूएंजा वायरस के 0.2 मिलीलीटर इंजेक्षन।
- अन्य दो अंडे के साथ इंजेक्शन दोहराएँ, और फिर सिरिंज और सुई त्यागें।
- एक गोंद बंदूक (या पिघल पैराफिन मोम) से गोंद की एक बूंद के साथ छेद सील। बीई गोंद अंडे के अंदर लीक नहीं करता है कि सावधान।
- हवा अंतरिक्ष ऊपर की ओर इशारा के साथ अंडा इनक्यूबेटर में अंडे वापस जगह है।
- दोहराएँ 4.2 कदम - 4.12 सभी अंडे टीका दिया गया है जब तक।
5. ऊष्मायन समय
- 37 डिग्री सेल्सियस और ~ 60% नमी में बदल के बिना संक्रमित अंडे सेते हैं।
- इन्फ्लूएंजा वायरस के प्रकार पर निर्भर करता है इष्टतम ऊष्मायन समय चुनें। 48 घंटे के लिए इन्फ्लूएंजा ए सेते हैं; 72 घंटा के लिए इन्फ्लूएंजा बी और सी सेते हैं।
6. इन्फ्लुएंजा वायरस हार्वेस्ट
- ऊष्मायन अवधि के बाद, भ्रूण को मारने और खून से संक्रमित द्रव्य contaminating के जोखिम को कम करने के लिए रक्त वाहिकाओं कसना 4 घंटा (या हे / एन) की एक न्यूनतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंडे ठंडा। उपज कम कर देता है जो वायरस, अवशोषित से लाल रक्त कोशिकाओं को रोकने के लिए यह मत करो। वैकल्पिक रूप से, ठंड अंडे 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर; हालांकि इस रक्त संक्रमण के जोखिम बढ़ जाता है।
- अंडे पर्याप्त ठंडा कर दिया गया है के बाद, एक जैव सुरक्षा हुड के लिए अंडे हस्तांतरण। हवा की थैली का सामना करना पड़ के साथ एक फर्म धारक में अंडे रखें। 70% इथेनॉल के साथ अंडे की सतह को साफ करें।
- हवा की थैली से ऊपर खोल खोलने के लिए बाँझ कैंची का प्रयोग करें। Chorioallantoic झिल्ली को नष्ट करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, जबकि हवा की थैली के आसपास खोल निकालें।
- बाँझ कुंद संदंश के साथ chorioallantoic झिल्ली खोलें। धीरे भ्रूण और एक छोटा सा रंग या चम्मच से जर्दी थैली तरफ ले जाते हैं। जर्दी टूटना नहीं ख्याल रखना।
- एक 1 मिलीलीटर Eppendorf पिपेट का प्रयोग, ध्यान द्रव्य इकट्ठा। यदि आवश्यक हो, ओर करने के लिए एक बिट के रूप में ज्यादा तरल पदार्थ के रूप में संभव इकट्ठा करने के लिए अंडा झुकाव।
- एक 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब में सभी अंडे से द्रव्य का मिश्रण। वायरस फसल के दौरान सभी समय पर बर्फ पर ट्यूबों रखें। एक अंडा पैदावार 5 - एक थोड़ा पीले रंग के तरल पदार्थ के 10 मिलीलीटर।
- 4 में 10 मिनट के लिए 1,000 XG पर वायरस युक्त द्रव्य स्पिन6, सी मलबे गोली। एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्पष्ट तरल हस्तांतरण बर्फ पर रखा। एक बीएसएल -2 अपशिष्ट कंटेनर में अंडे फेकें।
7. संग्रहण
- इसके तत्काल बाद allantoic स्पष्ट तरल पदार्थ (जैसे, 50, 100 या 500 उल aliquots) विभाज्य और तस्वीर फ्रीज तरल नाइट्रोजन में। जमे हुए वायरस शेयरों लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर पर स्थानांतरण।
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Representative Results
कई तरीकों इन्फ्लूएंजा वायरस अनुमापांक करने के लिए विकसित किया गया है। एक उपयुक्त विधि का चयन करते समय एक विचार कुछ व्यवहार्य virions का आकलन करेंगे, जो की परवाह किए बिना दूसरों की संक्रामकता के आधार पर कर रहे हैं, जबकि व्यवहार्यता (जैसे, hemagglutinin परख) की कुल कणों का निर्धारण करता है (उदाहरण के लिए, पट्टिका परख) 6। इधर, एक माउस अनुकूलित इन्फ्लूएंजा वायरस (ए / पीआर / 8/34) के साथ inoculated चिकन अंडे से एकत्र द्रव्य के वायरल अनुमापांक पट्टिका परख (चित्रा 1) और hemagglutination परख (चित्रा 2) द्वारा निर्धारित किया गया था।
इन्फ्लूएंजा वायरस के संक्रमण की कोशिकाओं की एक monolayer पर फार्म सजीले टुकड़े में परिणाम है कि एक कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव (lysed कोशिकाओं के परिपत्र क्षेत्र) का कारण बनता है। सजीले क्रिस्टल वायलेट के साथ कोशिकाओं को धुंधला द्वारा कल्पना कर रहे थे, और 65 सजीले वायरस के 10 -12 कमजोर पड़ने (चित्रा 1) के साथ कुएं में गिना रहे थे। पतला वायरल शेयर के 500 एल डब्ल्यू क्योंकिकोशिकाओं पर रखा, के रूप में अंतिम अनुमापांक 1.3 एक्स 10 से 14 pfu / मिलीलीटर है।
hemagglutination परख लाल रक्त कोशिकाओं की सतह को संलग्न करने के लिए वायरस की क्षमता पर इन्फ्लूएंजा वायरस अड्डों अनुमापांक करने के लिए एक विधि है। एक वायरल निलंबन इस प्रकार निलंबन से बाहर बसने से उन्हें रोकने, लाल रक्त कोशिकाओं सरेस से जोड़ा हुआ होगा। एक 96 अच्छी तरह से थाली (वि या दौर नीचे) में वायरस के धारावाहिक dilutions का उपयोग करते हुए और लाल रक्त कोशिकाओं की एक निश्चित राशि जोड़कर, वायरल अनुमापांक निर्धारित किया जा सकता है। 50 μl (चित्रा 2) में वायरस की 2 10 कमजोर पड़ने: एक स्पष्ट रूप से नकारात्मक परिणाम एक साथ मनाया गया। इसलिए, अंतिम अनुमापांक 2.1 एक्स 10 4 हाओ / एमएल है।
चित्रा 1. मात्रा पट्टिका परख द्वारा PR8 वायरस टिटर की। MDCK कोशिकाओं की एक monolayer 10 गुना SERIA से संक्रमित किया गया थाPR8 के एल dilutions के (10 -1 - 10 -12) 1 घंटे के लिए, धोया, और फिर एक 0.6% agarose समाधान के साथ मढ़ा। 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद, अगर ध्यान से हटा दिया गया था, और कोशिकाओं तय की और 0.25% क्रिस्टल वायलेट के साथ दाग रहे थे। पट्टिका गठन एक असंक्रमित नियंत्रण (सीटीआर) के लिए की तुलना की गई थी। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
टिटर अंडा व्युत्पन्न PR8 इन्फ्लूएंजा वायरस के लिए चित्रा 2. hemagglutination (हेक्टेयर) परख। PR8 वायरस क्रमानुसार पीबीएस में 2 गुना पतला और 0.5% तुर्की लाल रक्त कोशिकाओं के 50 एल के साथ मिलाया गया था। Dilutions quadruplicates में तैयार किया गया था, और तस्वीरें आरटी पर 1 घंटे ऊष्मायन के बाद लिया गया। नकारात्मक परिणाम सकारात्मक परिणाम जबकि कुओं के केंद्र में डॉट्स के रूप में दिखाई देते हैंअच्छी तरह से भर में एक समान लाल रंग के रूप में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इन्फ्लुएंजा बीमारी की एक बड़ी वैश्विक बोझ का कारण बनता है, और काम फेफड़ों की चोट 7 के रोगजनन को समझने में जारी है। इस घातक बीमारी में मदद की अनुसंधान करने के लिए विभिन्न तरीकों इन्फ्लूएंजा वायरस 6 प्रचार करने के लिए विकसित किया गया है। यहाँ, हम चिकन अंडे में इन्फ्लूएंजा वायरस के उत्पादन के लिए एक तकनीक का वर्णन है। इस पद्धति का लाभ यह अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और अक्सर इन विट्रो अध्ययन के लिए आवश्यक है, जो उच्च अनुमापांक इन्फ्लूएंजा वायरस शेयरों की बड़ी मात्रा में यह परिणाम है।
अधिकांश प्रयोगशालाओं न्यूनतम शुरू लागत के साथ जल्दी और आसानी से इस प्रोटोकॉल विकसित करने में सक्षम हो जाएगा। हम स्वत: टर्नर के साथ एक अंडे इनक्यूबेटर में निवेश करने की सिफारिश हालांकि, इस प्रोटोकॉल में इस तरह के उपकरणों के बिना पूरा किया जा सकता है, लेकिन अधिक कठिन हो जाएगा। हम भी अंडे की स्थिरता और बाँझपन गारंटी करने के लिए निषेचित अंडे की खरीद के लिए व्यावसायिक अनुसंधान विक्रेताओं का उपयोग करना चाहिये। Laborat के कार्यालयइंसानियत की देखभाल और प्रयोगशाला के जानवरों के इस्तेमाल पर सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा (PHS) नीति के ory पशु कल्याण (OLAW) व्याख्या PHS नीति अंडे सेने के बाद ही लागू है कि लाइव embryonated एवियन अंडे के अनुसंधान के उपयोग के लिए राज्यों। इसलिए, सबसे संस्थानों इस प्रोटोकॉल के लिए IACUC अनुमोदन की आवश्यकता नहीं होगी। हालांकि, नीतियों संस्थानों के बीच भिन्नता है, और संस्थागत जैव सुरक्षा समिति के अनुमोदन के इस प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले आवश्यक हो जाएगा।
वायरस के साथ काम कर रहा है, यह संक्रमित embryonated अंडे से द्रव्य कटाई के बाद 4 सेल्सियस पर वायरस रखने के लिए सर्वोपरि है। प्रत्येक अंडे द्रव्य के 5-10 मिलीलीटर के बीच उत्पादन की उम्मीद है, और अनुमापांक इन्फ्लूएंजा वायरस के तनाव पर निर्भर करता है। हमारी प्रयोगशाला नियमित रूप से एक माउस अनुकूलित H1N1 इन्फ्लूएंजा तनाव (ए / पीआर / 8/34) का प्रचार करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया गया है। इस प्रोटोकॉल की वजह से पी करने के लिए नैदानिक नमूनों के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस स्थिति में, एमनियोटिक गुहा का टीका बेहतर हो सकता है2,6-लिंक्ड सियालिक एसिड की resence एमनियोटिक अस्तर 8,9 भीतर बाध्य करने के लिए की जरूरत है। दूसरा विचार यह इस पद्धति की वजह से भ्रूण को pathogenicity के लिए प्रचार एवियन इन्फ्लूएंजा वायरस (जैसे, H5N1 के उपभेदों) के लिए आदर्श नहीं हो सकता है।
इन्फ्लूएंजा वायरस titering के विभिन्न तरीकों के अपने फायदे और नुकसान है, जो सभी के लिए विकसित किया गया है। दरअसल, वायरल मात्रा का ठहराव हो सकता है प्रोटीन आधारित (जैसे, hemagglutinin परख, एलिसा), न्यूक्लिक एसिड आधारित (जैसे, मात्रात्मक पीसीआर), या कार्यात्मक (उदाहरण के लिए, वायरल पट्टिका परख) 6। गैर कार्यात्मक assays के चाहे वे जीवित या मृत वायरल कणों कर रहे हैं की कुल वायरल titers का निर्धारण करेगा। इसलिए, इन्फ्लूएंजा वायरस के संक्रामक गतिविधि के लिए परीक्षण वायरस रहने वाले मापने के लिए और बहुत से बहुत कुछ करने के लिए तुलनीय कार्यात्मक तुल्यता के लिए अनुमति देगा। पट्टिका के गठन परख लाइव इन्फ्लूएंजा वीर की titers आकलन कर सकते हैं कि आमतौर पर इस्तेमाल किया परख हैहमें, लेकिन धीमी गति से और 10 प्रदर्शन करने के लिए बोझिल हो सकता है। इसकी तुलना में, hemagglutinin परख सरल और सीधा है, लेकिन व्यवहार्यता का आकलन नहीं करता है और सभी इन्फ्लूएंजा कणों को निर्धारित करता है।
इस के साथ साथ, हम उच्च अनुमापांक इन्फ्लूएंजा वायरस का प्रचार करने के लिए एक अपेक्षाकृत आसान तरीका प्रदान करते हैं। एक प्रयोगशाला में इस प्रोटोकॉल के नए सिरे से दीक्षा सीधा है, और शुरू सामग्री और उपकरणों अपेक्षाकृत कम खर्चीली हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | ||
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol>99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
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