Abstract
A infecção por influenza está associada com cerca de 36.000 mortes e mais de 200 mil internações por ano nos Estados Unidos. O surgimento contínuo de novas estirpes do vírus da influenza, devido a mutação e de re-sortido complica o controlo do vírus e necessita o desenvolvimento permanente de novas drogas e vacinas. O estudo baseado em laboratório da gripe requer um método confiável e de custo eficaz para a propagação do vírus. Aqui, um protocolo global prestada para influenza A propagação do vírus em ovos de galinhas férteis, que consistentemente produz stocks virais título elevado. Em breve, isentos de agentes patogénicos (SPF) de ovos de galinha fertilizados de soro são incubadas a 37 ° C e 55-60% de humidade durante 10-11 dias. Durante este período, o desenvolvimento do embrião pode ser facilmente monitorizado utilizando um candler ovo. A inoculação do virus é realizada por injecção de estoque de vírus na cavidade alantóide usando uma agulha. Após 2 dias de incubação a 37 ° C, os ovos sãorefrigeradas durante pelo menos 4 horas a 4 ° C. A casca de ovo de cima do saco de ar e a membrana corioalantóica são então cuidadosamente aberto e o fluido alantóide que contém o vírus é colhido. O fluido é limpa de detritos por centrifugação, aliquotado e transferido para -80 ° C para armazenamento a longo prazo. A grande quantidade (5-10 ml de fluido por ovo contendo vírus) e título de alta vírus quais geralmente são obtidas com este protocolo fez com que o uso de ovos para a preparação de vírus nosso método favorável, em particular, para estudos in vitro que necessitem de grandes quantidades de vírus em que são necessárias doses elevadas da mesma reserva de vírus.
Introduction
Influenza A continua a ser uma grande ameaça para a saúde humana. É uma doença respiratória potencialmente devastador com uma grande carga global causando até 500.000 mortes no mundo anualmente 1. Os vírus da gripe estão na família Orthomyxoviridae e levar de cadeia simples RNA 8 negativas-sense em seu genoma 1,2. A mutabilidade alta (isto é, "deriva" antigénico) do genoma viral impede a imunidade a longo prazo. Além disso, a gripe é cada vez mais resistentes aos medicamentos anti-virais 3.
A pandemia de gripe H1N1 2009 em destaque todas as questões desafiadoras associados à doença influenza (estirpe pandémica, a resistência anti-viral, a produção de vacinas em atraso). A formulação da vacina é determinado anualmente pela Organização Mundial de Saúde para as cepas de influenza provavelmente patogênicos (um para cada H1N1, H3N2 e influenza B) 4. Uma vez que este método é baseado na estirpe da gripe previus, estirpes patogénicas são ocasionalmente incorretamente identificado e eficácia da vacina cai drasticamente. Além disso, o surgimento de novas cepas de influenza pode contornar esses programas preventivos que causam doenças pandêmicas 2.
A criação de uma vacina contra a gripe universal tem sido difícil 5. Portanto, a pesquisa deve continuar na compreensão da patogênese da lesão pulmonar. Para pesquisas de laboratório instalação, vários métodos foram desenvolvidos para o isolamento viral e propagação 6. Os vírus influenza humanos pode ser amplificado em uma variedade de substratos de células de mamíferos. No entanto, gerando vírus de título elevado em grandes quantidades são atingidas mais facilmente em ovos embrionados. O protocolo seguinte descreve uma técnica para a propagação de vírus influenza A e armazenamento de stocks de vírus existentes.
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Protocol
NOTA: Observações gerais: executar todos os procedimentos que envolvem a manipulação do ovo em condições estéreis, e uma técnica estéril deve ser usado em conformidade. Pré-limpa todos os equipamentos com etanol 70% antes do uso. Em geral, a inoculação e colheita vírus influenza deve ser realizado em um laboratório BSL-2. No entanto, se esse protocolo é usado para propagar muito mais patogênico vírus da gripe (por exemplo, cepas pandêmicas e pré-pandemia, estirpes que representam um perigo para as aves de capoeira e, cepas altamente patogênicas da gripe aviária, o H1N1 estirpe 1918 gado), níveis de biossegurança mais elevadas e em alguns casos, as precauções de biosegurança e autorizações são necessários. O Comitê de Biossegurança Institucional local deve aprovar todas as pesquisas envolvendo o vírus da gripe.
1. Preparação de ovos para a inoculação
- Obter ovos de aves (SPF) isentos de agentes patogénicos recém-fertilizado de soro de um fornecedor adequado. Tipicamente, os ovos de galinha são utilizados. Os ovos devem ser nósed imediatamente após a chegada.
- Após ovos lugar chegada em uma incubadora de ovos umidificado com uma turner ovo automática para rodar ovos regularmente. Se um turner ovo automática não está disponível, rodar manualmente ovos pelo menos 2-3 vezes por dia (certifique-se de usar luvas e manter tudo tão estéril quanto possível).
- Incubar os ovos a 37 ° C e 55-60% de humidade durante 10-11 dias.
2. Egg Candling
- Use um candler ovo para examinar o ovo contra a luz em um quarto escuro para verificar os ovos para a infertilidade por candling após cerca de 7 ou 8 dias de incubação.
- Limpe a candler ovo com etanol 70%. Mudar de luvas frequentemente e desinfectar com etanol a 70% para minimizar o risco de contaminação por agentes patogénicos.
- Retire os ovos da incubadora e colocá-los em caixas de ovos vazias.
- Desligue as luzes na sala.
- Segurar a extremidade mais larga de cada ovo, um de cada vez contra a candler.
- Observar o ovo para determine se é fértil ou estéril.
NOTA: os vasos sanguíneos finos que conduzem a um embrião em forma de feijão deve ser claramente visível. Ovos não fertilizados aparece como uma mancha de sangue pequena, com uma gema de ovo visível.
- Descartar os ovos que são não fertilizado, e devolver os ovos viáveis para a incubadora. Não deixar ovos fora da incubadora durante mais de 30 min. Se o status de um ovo não pode ser confirmada, marcá-lo e observá-lo mais tarde.
3. Preparação de Vírus Inoculante
- Diluir stock de virus da gripe e cerca de marco 10-abril 10 pfu / ml em PBS estéril contendo 10 mM de HEPES (pH 7,4). Passo crítico: Diluir a reserva de vírus imediatamente antes da utilização e manter o vírus diluído em gelo durante todo o tempo.
4. Influenza inoculação do vírus através da Route alantóica
- No dia da inoculação com o vírus (dia 10 ou 11), os ovos novamente vela e eliminar quaisquer embriões mortos. Distinguir embriões vivos porolhando para o movimento no interior do ovo.
- Remova três ovos da incubadora, e organizar os ovos em um suporte em separado com o saco de ar para cima.
- Marque o espaço aéreo dos ovos com um marcador permanente.
- Lava-se a casca de ovo, acima do espaço de ar com etanol a 70%.
- Coloque os ovos com o espaço-se ar em uma caixa de ovos e em uma capa de biossegurança (BSL-2).
- Use uma agulha de 18G estéril para perfurar um pequeno buraco no shell sobre o saco de ar de cada ovo. Tenha cuidado para não inserir a agulha muito profundamente para evitar esfaquear o embrião ou gema.
- Elaborar o vírus influenza diluído em uma estéril seringa de 1 ml e anexar uma agulha 22G.
- Cuidadosamente avançar a seringa com a agulha com um ângulo de na cavidade alantóide de 45 °.
- Injectar 0,2 mL de vírus da gripe diluiu-se.
- Repetir a injecção com os outros dois ovos, e, em seguida, descartar a seringa e agulha.
- Selar o buraco com uma gota de cola de uma pistola de cola (ou cera de parafina derretida). Be cuidado que a cola não vaza dentro do ovo.
- Coloque os ovos de volta para a incubadora de ovos com o espaço aéreo apontou para cima.
- Repita os passos 4,2-4,12 até que todos os ovos foram inoculados.
5. Tempo de Incubação
- Incubar os ovos infectados sem virar a 37 ° C e ~ 60% de humidade.
- Escolha tempo de incubação óptimo, dependendo do tipo de vírus da gripe. Incubar a influenza A por 48 h; incubar gripe B e C durante 72 h.
6. Vírus da Influenza Colheita
- Após o período de incubação, refrigerar os ovos a 4 ° C durante um mínimo de 4 h (ou S / N) para matar o embrião e a constrição dos vasos sanguíneos para reduzir o risco de contaminação do fluido alantóico infectado com sangue. Fazer isso para evitar que as células vermelhas do sangue de absorção do vírus, o que reduz o rendimento. Alternativamente, os ovos frio durante 30 min a -20 ° C; no entanto, isso aumenta o risco de contaminação por sangue.
- Depois que os ovos tenham sido suficientemente refrigerados, transferir os ovos para uma capa de biossegurança. Coloque o ovo em um suporte firme com o saco de ar voltada para cima. Limpe a superfície do ovo com etanol 70%.
- Use uma tesoura esterilizada para abrir a casca de ovo por cima do saco de ar. Retire a casca ao redor do saco de ar, tendo o cuidado para não destruir a membrana corioalantóide.
- Abrir a membrana corioalantóica com fórceps estéreis rombas. Gentilmente afastar o embrião e do saco vitelino com uma pequena espátula ou colher. Tome cuidado para não romper a gema.
- Utilizando uma pipeta de Eppendorf de 1 mL, cuidadosamente recolher o fluido alantóico. Se necessário, incline o ovo um pouco para o lado para coletar o máximo possível de líquidos.
- Combina-se o fluido alantóico a partir de todos os ovos em 50 ml de um tubo cónico de plástico. Manter tubos em gelo em todos os momentos durante a colheita de vírus. Um ovo rendimentos de 5 - 10 ml de um fluido de cor ligeiramente amarelada.
- Girar o fluido alantóide que contém o vírus a 1.000 xg durante 10 min a 46; C para sedimentar os detritos. Transferir o fluido límpido para um novo tubo de 50 ml mantido em gelo. Descarte ovos em um recipiente de resíduos BSL-2.
7. Armazenamento
- Aliquotar imediatamente o líquido alantóico clarificado (por exemplo, 50, 100 ou 500 ul aliquotas) e encaixe por congelação em azoto líquido. Transferir stocks de vírus congeladas a -80 ° C congelador para armazenamento a longo prazo.
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Representative Results
Vários métodos têm sido desenvolvidos para titular o vírus da gripe. Uma consideração na escolha de um método adequado é que alguns determinar partículas totais, independentemente da viabilidade (por exemplo, o ensaio de hemaglutinina), enquanto outros são baseados em infectividade, que avaliará virions viáveis (por exemplo, teste de placas) 6. Aqui, o título virai de líquido alantóico recolhidas a partir de ovos de galinha inoculados com um vírus da gripe adaptada-rato (A / PR / 8/34) foi determinada pelo ensaio de placa (Figura 1) e ensaio de hemaglutinação (Figura 2).
Infecção por vírus da gripe causa um efeito citopático, que resultam em placas (zonas circulares de células lisadas) para formar sobre uma monocamada de células. As placas foram visualizadas por coloração das células com violeta de cristal, e 65 placas foram contadas no poço com a diluição de 10 -12 de vírus (Figura 1). Porque 500 L de estoque viral diluído wtal como é colocada sobre as células, o título final é de 1,3 x 10 14 PFU / ml.
O ensaio de hemaglutinação é um método para titular bases do vírus da gripe sobre a capacidade do vírus para fixar à superfície de células vermelhas do sangue. Uma suspensão virai vai aglutinar os glóbulos vermelhos do sangue, impedindo-as assim de sedimentação da suspensão. Usando diluições seriadas de vírus em uma placa de 96 poços (ou V ou de fundo redondo) e adição de uma quantidade fixa de células vermelhas do sangue, o título viral pode ser determinada. Um resultado negativo foi observado claramente com a diluição de 1: 2 10 do vírus em 50 ul (Figura 2). Portanto, o título final é de 2,1 x 10 4 HAU / ml.
Figura 1. A quantificação do vírus PR8 Titer pela Plaque Assay. Uma monocamada de células MDCK foram infectadas com 10 vezes sérial diluições de PR8 (10 -1 - 10 -12) durante 1 h, lavadas, e depois cobertas com uma solução de agarose a 0,6%. Após incubação a 37 ° C durante 72 h, o agar foi cuidadosamente removido, e as células foram fixadas e coradas com violeta de cristal a 0,25%. A formação de placa foi comparar a um controle não infectado (CTR). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. hemaglutinação (HA) Ensaio de ovo Titer-PR8 da gripe derivado de vírus. Vírus PR8 foi diluída em série de 2 vezes em PBS e misturados com 50 litros de 0,5% de peru células vermelhas do sangue. As diluições foram preparadas em quadruplicado e as fotografias foram tiradas depois de 1 hora de incubação à temperatura ambiente. Os resultados negativos aparecer como pontos no centro dos poços ao passo que os resultados positivosformar uma cor avermelhada uniforme em todo o bem. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Influenza provoca uma grande carga global de doenças, eo trabalho continua para a compreensão da patogênese da lesão pulmonar 7. Para facilitar a investigação nesta doença mortal, vários métodos têm sido desenvolvidos para propagar o vírus da gripe 6. Aqui, descrevemos uma técnica para produzir vírus influenza em ovos de galinha. A vantagem deste método é que é altamente reprodutível e resulta em grandes quantidades de estoques de vírus de título elevado gripe, o que é muitas vezes necessário para estudos in vitro.
A maioria dos laboratórios serão capazes de desenvolver este protocolo de forma rápida e facilmente com os custos de arranque mínimos. Embora seja recomendável investir em uma incubadora de ovos com turner automática, este protocolo pode ser concluída sem esses equipamentos, mas será mais trabalhoso. Também recomendamos o uso de fornecedores de pesquisa comerciais para a compra de ovos fertilizados para garantir a consistência e esterilidade dos ovos. O Escritório de Laboratory Bem-Estar Animal (OLAW) interpretação da Política de Serviço de Saúde Pública (PHS) em Humane Cuidado e Uso de Animais de Laboratório Membros para a utilização de pesquisa de ovos de aves embrionados ao vivo que a política PHS só é aplicável após a eclosão. Portanto, a maioria das instituições não exigirá aprovação IACUC para este protocolo. No entanto, as políticas variam entre as instituições, e aprovação pela Comissão de Biossegurança Institucional serão necessários antes de iniciar este protocolo.
Ao trabalhar com o vírus, é fundamental para manter o vírus a 4 ° C depois de colher o fluido alantóide do ovo embrionados infectado. Cada ovo deverá produzir entre 5-10 ml de fluido alantóico, e o título depende da estirpe do vírus da gripe. Nosso laboratório tem rotineiramente utilizado este método para propagar uma estirpe da gripe H1N1 adaptado-rato (A / PR / 8/34). Este protocolo pode também ser utilizada para amostras clínicas, mas nesta situação, a inoculação da cavidade amniótica pode ser preferível devido à pRESENÇA de ácidos siálicos com ligações 2,6-necessário para ligação dentro do revestimento amniótico 8,9. Outra consideração é que este método pode não ser ideal para a propagação de vírus da gripe aviária (por exemplo, cepas H5N1), devido à patogenicidade para o embrião.
Vários métodos de titulação do vírus da gripe têm sido desenvolvidos os quais têm as suas vantagens e desvantagens. Com efeito, a quantificação viral pode ser à base de proteínas (por exemplo, ensaio de hemaglutinina, ELISA), (por exemplo, o ensaio de placa virai) nucleico (por exemplo, PCR, quantitativo), funcional à base de ácido ou 6. Ensaios não-funcionais irá determinar os títulos virais totais independentemente de se eles estão vivendo ou partículas virais mortas. Portanto, o teste para a atividade infecciosa do vírus influenza medirá vírus vivo e permitir a equivalência funcional comparável de lote para lote. O ensaio de formação de placas é um ensaio vulgarmente utilizado que pode avaliar os títulos de vir influenza vivonós, mas pode ser lento e pesado para realizar 10. Em comparação, o ensaio hemaglutinina é simples e direta, mas não avalia a viabilidade e determina todas as partículas da gripe.
Aqui, nós fornecemos um método relativamente fácil de propagar o vírus da gripe de título elevado. O início de novo deste protocolo em um laboratório é simples, e as matérias-primas e equipamentos são relativamente baratos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | ||
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol>99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
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