Abstract
La infección por influenza se asocia con alrededor de 36,000 muertes y más de 200,000 hospitalizaciones cada año en los Estados Unidos. La aparición continua de nuevas cepas de virus de la gripe debido a la mutación y re-surtido complica el control del virus y requiere el desarrollo permanente de nuevos fármacos y vacunas. El estudio de laboratorio de influenza requiere de un método fiable y rentable para la propagación del virus. Aquí, se proporciona un protocolo completo para la gripe A la propagación de virus en huevos de pollo fértiles, que produce consistentemente stocks virales de alto título. En resumen, (SPF) huevos de gallina fertilizados libres de patógenos de suero se incuban a 37 ° C y 55-60% de humedad durante 10 - 11 días. Durante este período, el desarrollo del embrión se puede controlar fácilmente con un candler huevo. La inoculación del virus se lleva a cabo mediante la inyección de stock de virus en la cavidad alantoidea usando una aguja. Después de 2 días de incubación a 37 ° C, los huevos sonrefrigerada durante al menos 4 horas a 4 ° C. La cáscara de huevo por encima de la bolsa de aire y la membrana corioalantoidea continuación, se abrió cuidadosamente, y el fluido alantoideo que contiene el virus se recoge. El líquido se elimina de los desechos por centrifugación, se dividió en alícuotas y se transfiere a -80 ° C para almacenamiento a largo plazo. La gran cantidad (5-10 ml de virus que contiene fluido por huevo) y de alto título de virus que se consigue normalmente con este protocolo ha hecho que el uso de huevos para la preparación de virus nuestro método favorable, en particular para los estudios in vitro que requieren grandes cantidades de virus en los que se necesitan altas dosis de la misma stock de virus.
Introduction
La gripe A sigue siendo una amenaza importante para la salud humana. Es una enfermedad respiratoria potencialmente devastadora con una gran carga mundial que causa más de 500.000 muertes en el mundo cada año 1. Los virus de influenza son de la familia Orthomyxoviridae y llevan 8 de sentido negativo de ARN de cadena sencilla en su genoma 1,2. La alta mutabilidad (es decir, "deriva" antigénica) del genoma viral impide inmunidad a largo plazo. Por otra parte, la gripe es cada vez más resistente a los medicamentos antivirales 3.
La pandemia de gripe H1N1 2009 ponía de relieve todas las cuestiones difíciles asociados con la enfermedad de la gripe (cepa pandémica, la resistencia antiviral, la producción de vacunas retardada). La formulación de la vacuna es determinada anualmente por la Organización Mundial de la Salud para las cepas de gripe más probable patógenos (uno cada uno para H1N1, H3N2 y la influenza B) 4. Debido a que este método se basa en la cepa de gripe previstas, las cepas patógenas son ocasionalmente incorrectamente identificados y eficacia de la vacuna se reduce drásticamente. Por otra parte, la aparición de nuevas cepas puede eludir estos programas preventivos que causan enfermedad pandémica 2.
La creación de una vacuna contra la gripe universal ha sido difícil de alcanzar 5. Por lo tanto, la investigación debe continuar en la comprensión de la patogénesis de la lesión pulmonar. Para la investigación de laboratorio instalación, varios métodos se han desarrollado para el aislamiento viral y la propagación 6. Virus de influenza humana pueden ser amplificados en una variedad de substratos de células de mamíferos. Sin embargo, la generación de virus de alta titulación en grandes cantidades se logran mejor en huevos embrionados. El siguiente protocolo describe una técnica para la gripe A la propagación de virus y el almacenamiento de reservas de virus existentes.
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Protocol
NOTA: Observaciones generales: Llevar a cabo todos los procedimientos que implican la manipulación del huevo en condiciones estériles, y una técnica estéril debería utilizarse en consecuencia. Pre-limpie todo el equipo con etanol al 70% antes de su uso. En general, la inoculación del virus de la influenza y la cosecha deben llevarse a cabo en un laboratorio BSL-2. Sin embargo, si este protocolo se utiliza para propagar mucho más patógeno virus de la gripe (por ejemplo, las cepas pandémicas y prepandémicas, cepas que representan un peligro para las aves de corral y el ganado, las cepas de influenza aviar altamente patógena, la cepa H1N1 1918), los niveles de bioseguridad más altos y en algunos casos, se requieren precauciones de bioseguridad y autorizaciones. El Comité Institucional de Bioseguridad local debe aprobar toda la investigación con virus de la gripe.
1. Preparación de los huevos para la inoculación
- Obtener huevos de aves de suero libres de patógenos (SPF) recién fecundado de un proveedor adecuado. Típicamente, se utilizan huevos de gallina. Los huevos deben ser nosotrosed inmediatamente a su llegada.
- Al lugar de llegada huevos en una incubadora de huevos humidificado con un tornero de huevo automático para girar los huevos con regularidad. Si un tornero de huevo automático no está disponible, gire manualmente los huevos por lo menos 2-3 veces al día (asegúrate de usar guantes y mantener todo lo más estéril posible).
- Incubar huevos a 37 ° C y 55-60% de humedad durante 10-11 días.
Candling 2. Huevo
- Utilice un candler huevo para examinar el huevo contra una luz brillante en un cuarto oscuro para comprobar los huevos para la infertilidad por candling después de unos 7 u 8 días de incubación.
- Limpie la candler huevo con etanol al 70%. Cambiar los guantes a menudo y desinfectar con etanol al 70% para reducir al mínimo el riesgo de contaminación por patógenos.
- Retire los huevos de la incubadora y colocarlos en cajas de huevos vacías.
- Apague las luces en la habitación.
- Mantenga el extremo grande de cada huevo de una en una en contra de la candler.
- Observe que el huevo se determine si es fértil o estéril.
NOTA: los vasos sanguíneos finos que conducen a un embrión en forma de frijol debe ser claramente visible. Los huevos no fertilizados aparecerá como una pequeña mancha de sangre con una yema de huevo visible.
- Deseche los huevos que son sin fertilizar, y devolver los huevos viables a la incubadora. No deje los huevos fuera de la incubadora durante más de 30 min. Si el estado de un huevo no se puede confirmar, marcarlo, y observar más tarde.
3. Preparación de inóculo del virus
- Diluir virus de la gripe de stock a alrededor de 03 10 hasta 04 10 pfu / ml en PBS estéril que contiene HEPES 10 mM (pH 7,4). Paso crítico: Diluir el stock de virus inmediatamente antes de su uso y mantener el virus diluido en hielo todo el tiempo.
4. Influenza inoculación del virus a través de la Ruta alantoideo
- En el día de la inoculación del virus (día 10 o 11), Vela los huevos de nuevo y eliminar cualquier embriones muertos. Distinguir embriones vivos poren busca de movimiento dentro del huevo.
- Retire los tres huevos de la incubadora, y organizar los huevos en un soporte independiente con la bolsa de aire hacia arriba.
- Marca el espacio de aire de los huevos con un marcador permanente.
- Lavar la cáscara del huevo por encima del espacio de aire con etanol al 70%.
- Poner los huevos con el espacio hasta el aire en un cartón de huevos y en una campana de bioseguridad (BSL-2).
- Use una aguja 18G estéril para perforar un pequeño orificio en la cubierta sobre el saco de aire de cada huevo. Tenga cuidado de no insertar la aguja demasiado profundamente para evitar apuñalando al embrión o yema.
- Elaborar el virus de la influenza diluida en una jeringa de 1 ml estéril y conecte una aguja 22G.
- Avanzar con cuidado la jeringa con la aguja en un ángulo de 45 ° en la cavidad alantoidea.
- Inyectar 0,2 ml de virus de la gripe diluida.
- Repetir la inyección con los otros dos huevos, y luego desechar la jeringa y la aguja.
- Sellar el agujero con una gota de pegamento de una pistola de pegamento (o cera de parafina fundida). Be cuidado de que el pegamento no se filtre en el interior del huevo.
- Coloque los huevos de nuevo en la incubadora de huevo con el espacio de aire apuntando hacia arriba.
- Repita los pasos 04.02 a 04.12, hasta todos los huevos han sido inoculados.
5. Tiempo de incubación
- Incubar los huevos infectados sin girar a 37 ° C y ~ 60% de humedad.
- Elige tiempo óptimo de incubación dependiendo del tipo de virus de la gripe. Incubar la gripe A durante 48 h; incubar la influenza B y C durante 72 h.
6. Influenza Virus Cosecha
- Después del período de incubación, los huevos enfriar a 4 ° C durante un mínimo de 4 horas (o O / N) para matar el embrión y constreñir los vasos sanguíneos para reducir el riesgo de contaminar el fluido alantoideo infectado con sangre. Hacer esto para evitar que las células rojas de la sangre de la absorción del virus, lo que reduce el rendimiento. Alternativamente, los huevos de enfriamiento durante 30 minutos a -20 ° C; sin embargo, esto aumenta el riesgo de contaminación de la sangre.
- Después de que los huevos han sido suficientemente refrigerado, transferir los huevos a una campana de bioseguridad. Coloca el huevo en un soporte firme con la bolsa de aire hacia arriba. Limpie la superficie del huevo con etanol al 70%.
- Con unas tijeras estériles para abrir la cáscara de los huevos encima de la bolsa de aire. Retire la cáscara alrededor del saco de aire con cuidado de no destruir la membrana corioalantoidea.
- Abra la membrana corioalantoidea con unas pinzas romas estériles. Mover suavemente a un lado el embrión y el saco vitelino con una pequeña espátula o una cuchara. Tenga cuidado de no romper la yema.
- Utilizando una pipeta Eppendorf de 1 ml, recoger cuidadosamente el fluido alantoideo. Si es necesario, incline el huevo un poco hacia un lado para recoger la mayor cantidad de líquido posible.
- Combinar el fluido alantoideo de todos los huevos en un tubo cónico de plástico de 50 ml. Mantenga los tubos en hielo en todo momento durante la cosecha de virus. Los rendimientos de un huevo de 5 - 10 ml de un líquido ligeramente amarillento.
- Girar el fluido alantoideo que contiene el virus a 1.000 xg durante 10 min a 46; C para sedimentar los restos. Transferir el líquido claro en un nuevo tubo de 50 ml se mantuvo en hielo. Deseche los huevos en un recipiente de residuos BSL-2.
7. Almacenamiento
- Inmediatamente la alícuota aclarado alantoideo fluido (por ejemplo, 50, 100 o 500 alícuotas ul) y complemento de congelación en nitrógeno líquido. Transferencia de existencias congeladas virus a -80 ° C congelador para el almacenamiento a largo plazo.
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Representative Results
Múltiples métodos se han desarrollado para el título del virus de la influenza. Una consideración al momento de elegir un método apropiado es que algunos determinar partículas totales, independientemente de la viabilidad (por ejemplo, ensayo de hemaglutinina), mientras que otros se basan en la infectividad, que evaluará viriones viables (por ejemplo, la placa de ensayo) 6. Aquí, el título viral de fluido alantoideo recogido a partir de huevos de pollo inoculados con un virus de la gripe adaptada a ratón (A / PR / 8/34) se determinó mediante ensayo en placa (Figura 1) y ensayo de hemaglutinación (Figura 2).
Infección por el virus Influenza provoca un efecto citopático que se traducen en placas (zonas circulares de células lisadas) para formar en una monocapa de células. Las placas se visualizaron por tinción de las células con cristal violeta, y 65 placas fueron contadas en el pozo con la dilución de virus 10 -12 (Figura 1). Debido a 500 L de stock viral diluida wcomo colocado en las células, el título final es 1,3 x 10 14 PFU / ml.
El ensayo de hemaglutinación es un método para titular bases de virus de influenza en la capacidad del virus para unirse a la superficie de las células rojas de la sangre. Una suspensión viral se aglutinar las células rojas de la sangre, lo que les impide la sedimentación de la suspensión. Mediante el uso de diluciones en serie de virus en una placa de 96 pocillos (ya sea en V o de fondo redondo) y la adición de una cantidad fija de células rojas de la sangre, el título viral se puede determinar. Un resultado negativo se observó claramente con la dilución 1: 2 10 de virus en 50 l (Figura 2). Por lo tanto, el título final es 2,1 x 10 4 HAU / ml.
Figura 1. Cuantificación de PR8 título del virus por la placa de ensayo. Una monocapa de células MDCK fue infectado con seria 10 vecesl diluciones de PR8 (10 -1-10 -12) durante 1 hora, se lavan y luego se superpone con una solución de agarosa al 0,6%. Después de incubación a 37 ° C durante 72 h, agar se retiró cuidadosamente, y las células se fijaron y tiñeron con 0,25% de cristal violeta. La formación de placas se compara con un control no infectado (ctr). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. hemaglutinación (HA) Ensayo para derivado de huevo Titer Virus de la gripe PR8. PR8 virus se diluyó en serie 2 veces en PBS y se mezcla con 50 l de 0,5% de pavo células rojas de la sangre. Las diluciones se prepararon por cuadruplicado, y las imágenes fueron tomadas después de 1 h de incubación a temperatura ambiente. Los resultados negativos aparecen como puntos en el centro de los pocillos mientras que los resultados positivosformar un color rojizo uniforme en el pozo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La gripe causa una gran carga mundial de la enfermedad, y se sigue trabajando en la comprensión de la patogénesis de la lesión pulmonar 7. Para la investigación facilitado en esta enfermedad mortal, varios se han desarrollado métodos para propagar el virus de la gripe 6. Aquí se describe una técnica para producir virus de la gripe en huevos de gallina. La ventaja de este método es que es altamente reproducible y resulta en grandes cantidades de reservas de virus de la gripe de alta titulación, que es a menudo necesario para los estudios in vitro.
La mayoría de los laboratorios serán capaces de desarrollar este protocolo de forma rápida y sencilla con un coste mínimo de puesta en marcha. Aunque se recomienda invertir en una incubadora de huevos con turner automático, este protocolo se puede completar sin ese equipo, pero será más laborioso. También se recomienda usar proveedores de estudios comerciales para la compra de huevos fertilizados para garantizar la coherencia y la esterilidad de los huevos. La Oficina de Laboratria de Bienestar Animal (OLAW) interpretación de la Política de Servicio de Salud Pública (PHS) en Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio establece para el uso de la investigación de los huevos embrionados de aves vivas que la política PHS sólo es aplicable después de la eclosión. Por lo tanto, la mayoría de las instituciones no requerirán la aprobación del IACUC para este protocolo. Sin embargo, las políticas varían entre las instituciones, y se requerirá la aprobación del Comité Institucional de Bioseguridad antes de iniciar este protocolo.
Cuando se trabaja con el virus, es fundamental para mantener el virus a las 4 C después de cosechar el fluido alantoideo de los huevos embrionados infectados. Se espera que cada huevo para producir entre 5 a 10 ml de líquido alantoideo, y el título depende de la cepa de virus de la gripe. Nuestro laboratorio ha utilizado rutinariamente este método para propagar una cepa de la gripe H1N1 adaptada a ratón (A / PR / 8/34). Este protocolo también se puede utilizar para muestras clínicas, pero en esta situación, la inoculación de la cavidad amniótica puede ser preferible debido a la presencia de ácidos siálico 2,6 vinculados necesaria para la unión dentro de la guarnición amniótico 8,9. Otra consideración es que este método puede no ser ideal para los virus de influenza aviar de propagación (por ejemplo, las cepas H5N1), debido a la patogenicidad para el embrión.
Varios métodos de titulación de virus de la gripe se han desarrollado todos los cuales tienen sus ventajas y desventajas. De hecho, la cuantificación viral puede ser a base de proteínas (por ejemplo, ensayo de hemaglutinina, ELISA), (por ejemplo, ensayo de placa viral) a base de ácido (por ejemplo, PCR, cuantitativo), o funcional nucleico 6. Ensayos no funcionales determinarán los títulos virales en total, independientemente de si viven o partículas virales muertas. Por lo tanto, las pruebas de la actividad infecciosa del virus de la gripe medirá virus vivo y para permitir que la equivalencia funcional comparable de lote a lote. El ensayo de formación de placa es un ensayo de uso común que puede evaluar los títulos de vir influenza en directonosotros, pero puede ser lento y engorroso para llevar a cabo 10. En comparación, el ensayo de hemaglutinina es sencilla y directa, pero no evalúa la viabilidad y determina todas las partículas de la gripe.
En este documento, se proporciona un método relativamente fácil de propagar el virus de la influenza alto título. La iniciación de novo de este protocolo en un laboratorio es sencillo, y los materiales y equipos de partida son relativamente baratos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | ||
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol>99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , Wiley. (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
