记录光诱发神经元突触后反应在暗适应，小鼠视网膜切片准备利用膜片钳技术

Abstract

视网膜是通往视觉系统。要了解视觉信号处理机制，我们研究视网膜神经网络的功能。网络中的视网膜神经元包括许多亚型。超过10种亚型双极细胞，神经节细胞，和无长突细胞已经鉴定了形态学研究。视网膜神经元的多个亚型被认为编码可视信令的显着特征，例如运动和颜色，并形成多个神经通路。然而，在视频信号处理的每个神经元的功能角色尚未完全了解。膜片钳的方法是有用的，解决这一根本问题。在这里，一个协议来记录使用膜片钳记录在暗适应条件鼠标视网膜神经元光诱发突触反应提供。鼠标眼睛的暗适应O / N，和视网膜切片准备使用红外照明和解剖观众在黑暗的房间。红外灯不激活鼠标光感受器，从而保留了它们的光响应。膜片钳是用来记录在视网膜神经元的光诱发反应。在录音表征神经元形态亚型荧光染料注入。此过程使我们能够确定在小鼠视网膜的每个神经元的生理功能。

Protocol

伦理学声明：涉及动物对象的程序批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）韦恩州立大学。

1.准备实验解决方案

1. 实际实验之前准备解剖溶液1天到1周。使用的，因为在较低温度下¹⁶其较强的缓冲能力视网膜解剖一个HEPES缓冲溶液。混合所有化学物质如下（单位mm）：115氯化钠，氯化钾2.5，2.5 _氯化钙 ，氯化镁1.0 _2，10 HEPES，28葡萄糖。调节pH至7.4，用NaOH。存放在冰箱中长达1周的解决方案。
2. 记录溶液埃姆斯是'中，它是一个人工脑脊髓液（ACSF）设计用于视网膜制剂^17。由该实验的当天，称出在管埃姆斯'粉末（4.4克500毫升溶液）。此外，掂量出_碳酸氢钠 （0.95克500毫升解决方案），并与混合MES“粉体。
3. 由实验当天制备用于膜片钳记录细胞内吸移管溶液。混合所有的化学品如下（以mM计）：111葡萄糖酸钾，1.0氯化钙_2，10 HEPES，1.1 EGTA，10的NaCl，1.0的MgCl _2，5 ATP的Mg和1.0 GTP钠。调节pH至7.2，用KOH。过滤与常规注射器过滤的移液管溶液。使〜500微升等分试样，并将其存储在冷冻或深冷冻机。

2.准备用于实验的当天

1. 晚上在实验前，将鼠标在笼子里（C57BL / 6J或相似的背景，4 - 8周龄，雄）在一个黑暗的空间O / N暗适应。
2. 解剖准备：
   1. 填解剖溶液 - 在玻璃烧杯中（100 200毫升）中，将其放置在冰上，并用气泡氧气至少10分钟。
   2. 启动暗箱视网膜制备存储的氧合。
   3. 准备的塑料盖玻片重新油脂轨tinal片的准备，并把他们每个人在35毫米的塑料盘。
   4. 安装一个新的刀片来菜刀（组织切片机）。
   5. 切断滤膜成两半。这是对视网膜切片。
   6. 对齐解剖显微镜附近的解剖工具和移液管。工作区必须有良好的组织，使每个工具可以在黑暗中很容易地访问。
3. 膜片钳录音准备工作：
   1. 溶解埃姆斯'粉末和的NaHCO ₃在蒸馏水（艾姆斯4.4克和的NaHCO _30.95克/500毫升DDH ₂ O _的 ）。气泡埃姆斯'中混合氧气（95％O ₂和5％CO _2）的至少30分钟，同时加热到记录温度水平（〜35℃）。将pH调节至7.4用NaHCO _3，同时仍然鼓泡。
   2. 解冻解剖过程中的内部移液器解决方案。它解冻后，细胞内染色增加0.01％磺酰罗丹明B。

3.视网膜解剖

1. 在黑暗的房间里，用安乐死二氧化碳和双侧气胸鼠标。经过2 - 使用二氧化碳3分钟，鼠标会失去意识。
2. 当鼠标不再响应尾巴捏，迅速剜除眼睛和它们放置在一个塑料盘感冒解剖的解决方案。执行双侧气胸，以确保动物的死亡。快速存储眼睛中在黑暗中的菜。使用红外线观众进行的程序在黑暗中。
   注：可替代地，异氟醚，断头，或颈脱位可用于安乐死。安乐死的方法应遵循美国国家卫生研究院（NIH）的和/或机构动物护理和使用委员会的指导方针。
3. 在黑暗的房间，调整解剖显微镜和红外照明。在显微镜下，将其从培养皿转眼成10cm的塑料培养皿瓦特第i个冷却解剖的解决方案。连续地通过管道气泡氧放置在塑料培养皿的底部。调节流量，所以它不是太低，而是确保它没有高到足以扰乱解剖。
4. 角膜和晶状体摘除：
   1. 就用微手术刀对角膜的顶部的切口。保持视神经在眼球的另一端防止眼睛移动。延长使用一对手术剪的剪。切出的角膜周围有一些巩膜。
   2. 抢镜头用细镊子慢慢拉镜头了。如果玻璃体太粘除去透镜，切玻璃体用剪刀。
   3. 一旦眼杯制成，轻轻倒入冷，含氧解剖溶液进入眼罩用小移液管。
      注：眼球快速放气后的切口是在角膜。它维持眼球的形状，因为这有利于在变形眼是非常重要的cedure会损坏视网膜而引起视网膜脱离。
5. 确定视网膜的背，腹两面：
   注意：由于绿色和紫外（UV）不均匀分布的锥体^18中 ，识别特定的视网膜区域为光响应录制重要。
   1. 识别线横跨视网膜眼罩通过视神经头附近去。此线通过大多横跨视神经腹侧;侧包括视神经是背侧，而另一种是腹侧^19。看到这一具有里程碑意义显然在红外观众。
   2. 根据实验的目的，使得在不必要侧的切口。这将是从眼罩分离视网膜之后是有用的。
6. 玻璃体切除：
   1. 任选地，孵育眼杯与透明质酸酶（0.5毫克/毫升）15分钟。
   2. 删除与特细镊子玻璃体。玻璃体主要是附着在底部和眼杯的外边缘。轻轻拉出，不要触摸或戳视网膜。由于玻璃体可能会被紧紧地贴在眼罩，轻轻取出，避免从眼杯视网膜脱离。继续拉，直到没有张力感觉。
      注意：此步骤是为解剖小鼠视网膜尤其重要;然而，这不是对其他物种的视网膜，如大鼠或蝾螈的问题。
7. 隔离从眼杯视网膜。抓住巩膜并轻轻剥离使用镊子的背侧视网膜。
   注：整个安装的视网膜制剂可以从分离的视网膜进行。使三至四个切口处的边缘和扁平视网膜，或切割视网膜成几片。
8. 修剪视网膜并丢弃不必要的视网膜的一半（ 步骤3.5）。在相同的塑料盘，切剩下的视网膜成两块。对于每一块的视网膜，切断边缘作视网膜平板，并修剪折叠边缘。
9. 转移视网膜板坯上使用大移液管（〜2ml）中的玻璃板。吸起来用小吸管的过量溶液，可使用一片滤纸弄平板坯，然后迅速将一块滤膜上的组织的顶部。
   1. 使用小移液管，将一滴解剖上的过滤膜溶液。等待〜15秒，直到溶液散布在膜中。在这段时间内，视网膜组织会粘到过滤膜上。
   2. 倒在和周围的过滤器越冷解剖的解决方案。与过滤膜的视网膜组织将漂浮。抢用钳子过滤膜，并将其放置在切片室。倾解剖溶液在组织中，并存储该制剂在黑暗中。
      注意：这里介绍的方法是至关重要的。以确保它是快速执行这些步骤重要的是视网膜组织附着在过滤器mem的期Brane，不干燥。
10. 用一把菜刀，切视网膜组织切片。大约200微米厚度的膜片钳研究可行的。
11. 将塑料盖玻片，在切片室油脂轨。传输视网膜切片上的油脂轨顶部的塑料盖玻片。旋转片90°，以使横截面是可见的。按过滤膜片向下到盖玻片，然后，覆盖滤纸的侧面与油脂。
    1. 后片被固定在塑料盖玻片，抢盖玻片并将其转移到35毫米的塑料培养皿中。倒入冷解剖解决方案到视网膜准备和淹没的准备。储存在黑暗中的每个菜，应连续地氧化。
       注：整个过程需要仔细地进行，以使滤膜不​​变形。否则，视网膜切片容易分离的过滤膜。

1. 录制的准备：
   1. 总理灌注管与艾姆斯“媒介。让所有的泡沫通过填充管时。
   2. 使膜片钳记录移液器与车夫。以填充用吸管溶液，浸在吸移管的背侧吸移管，持续1分钟，直到枪头回填。接着，使用微量移液器填料填充吸管〜三分之一。存放在潮湿的吸管盒每个吸管。
   3. 打开设备的膜片钳记录的;包括计算机，放大器，CCD摄像头，和显微镜。
2. 关闭房间的灯。将使用红外线观众视网膜切片准备到显微镜阶段室。它被固定后，开始连续灌注。设置灌注温度在33至37℃。
3. 查看片表面与CCD相机。专注于目标位置，目标CELL类型驻留。选择膜片钳记录一个看起来健康的细胞（ 即，它应具有光滑的表面寻找和良好的细胞形态）。
4. 将在吸管持有人一个记录吸管。推进吸管切片准备。当它接近所述片制剂（〜2毫米以上），以中，找到与显微镜的吸移管的尖端。一旦枪头在显微镜下是可见的，移动的前端向下朝向目标小区。
5. 设置放大器。调整吸管在0毫伏/ 0 PA（零），并开始一个连续的电脉冲〜5的MV〜10赫兹。检查吸液管电阻;理想的电阻为5至10兆欧大多数视网膜神经细胞。
6. 开始从尖端吹出。使用一个吹口，或使用注射器，施加正压时的吸管蘸入浴溶液中。连续地吹出的内部溶液，直到前端在靶细胞的表面上。
   1. 当正压力使得在th小凹坑ê细胞表面，推进尖端轻微并停止吹出来的。检查吸管阻力，这应增加。如果它被连续地增加，离开它并监视电阻，直到达到> 1GΩ（千兆欧密封）。如果电阻不会自发增加，轻轻施加负压，直到它变成一个千兆欧密封。
7. 在千兆欧密封实现后，改变保持电位-70毫伏。然后，间歇地施加负压破裂枪头内的膜。当进行全细胞构造中，吸液管电阻可以是500兆欧和1GΩ以及电容电流看出之间。有时自发突触后电流可以观察到。
8. 记录从-80到+40毫伏的IV关系。不同类型的电压门控通道的激活取决于细胞类型。
9. 记录光诱发突触电流或电压。

Representative Results

代表性的切片制备示于图1的片制剂是在一条直线的位置，示出在一个平面上的光感受器向神经节细胞，并没有从滤纸分离。如果一个切片是倾斜的，制剂的仅有部分为焦点，这使得它很难确定适当的细胞用于膜片钳。对于录音，它选择一个良好的索玛，通常有一个光亮的表面，均匀的圆形，并没有明显的暗斑是很重要的。被做了全细胞构造后，将切片暴露于背景光，然后到步骤光（ 图2）。光诱发的兴奋性突触后电位（L-，EPSPS）被诱发响应于步骤光（定时示于黄色）。峰值振幅和取决于细胞类型和子类型而变化的衰减时间。一个神经节细胞响应明亮的刺激（ 图2 D＆E）产生动作电位。在CEL升类型及其形态学亚型是由生理记录（ 图2右侧）后磺酰罗丹明标记显示。

图1.视网膜片的准备工作。（A）视网膜切片准备了10X客观观察。视网膜切片准备（顶部）被附连到一片滤纸（底部）。 （B）中的四图像汇编表示视网膜切片准备用60X物镜观看。每个细胞层清楚地观察到（ONL：外核层，OPL：外丛状层，INL：内核层，彩光：内网状层，GCL：神经节细胞层） ，请点击这里查看此图的放大版本。

图2.光诱发的兴奋性突触后电位（L-，EPSPS）从视网膜神经细胞 。步骤光诱发L-性兴奋（左）。光照强度为30 - 60％韦伯对比。背景光自适应级为4×10 ⁴个光子/微米² /秒。磺酰罗丹明B膜片钳记录形象化记录的神经元（右）在注射。一种记录吸管仍然附着胞体（A）L-性兴奋和磺酰罗丹明染色从ON锥双极细胞。 （B）的关视锥双极细胞。 （C）无长突细胞。 （ 四）神经节细胞。 （E）OFF神经节细胞。比例尺为2或5 mV的如前所述。光刺激应用于1秒。 请点击这里查看该图的放大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice (28-60 days old, male)	Jackson laboratory	C57BL/6J strain
Ames' medium powder	Sigma	A1420	excellent
Stereo microscope	Nikon	SMZ745	excellent
Dissecting tool: forceps	Dumont	#4, #5, #55	excellent
Dissecting tool: scissors	Roboz	RS-5605	excellent
Dissecting tool: surgery knife	Surgistar	7514	excellent
Razor blade (for chopper)	EMS	71970	excellent
Chopper	handmade
Infrared viewer	Night Owl Optics	NOBG1	It shows bright view. Focusing small objects is an issue.
Puller	Sutter	P-1000	excellent; makes consistent size pipettes.
Dark box	Pelican	dark box	excellent
Patch clamp system	Scientifica	slice scope 2000	Excellent setup. Most key components are included in one package. Micromanipulators are excellent.
Amplifier	Molecular Devices	multiclamp 700B	Excellent and easy control.
Acquiring software	Molecular Devices	pClamp software	Excellent and easy control.
Light source (LED)	Cool LED	pE-2 4 channel system	Excellent
CCD camera	Q-imaging	Retiga 2000	Excellent
Faraday cage	handmade