Abstract
הרשתית היא השער למערכת הראייה. כדי להבין את מנגנוני עיבוד אותות חזותיים, אנו חוקרים פונקציות רשת עצביות ברשתית. נוירונים ברשתית ברשת מהווים של תת סוגים רבים. יותר מ -10 תת-סוגים של תאים דו קוטביים, תאי הגנגליון ותאי amacrine זוהו על ידי מחקרים מורפולוגיים. תת מרובה של תאי עצב ברשתית הם חשבו לקודד תכונות מובהקות של איתות חזותית, כגון תנועה וצבע, ויוצרים מספר רב של מסלולים עצביים. עם זאת, התפקידים הפונקציונליים של כל נוירון בעיבוד אותות חזותי אינם מובנים במלואם. שיטת מהדק התיקון היא שימושית כדי לטפל בשאלה יסודית זו. כאן, פרוטוקול להקליט תגובות הסינפטי אור עורר בנוירונים ברשתית עכבר באמצעות הקלטות מהדק תיקון בתנאים כהים מותאם מסופק. עיני העכבר הן כהות מותאם O / N, והכנות פרוסת רשתית הם גזורים בחדר חשוך באמצעות תאורה וצופים אינפרא אדום. אור אינפרא אדום לאלהפעיל קולטני אור בעכבר ובכך שומר על היענות האור שלהם. מהדק תיקון משמש להקלטת תגובות אור עורר בנוירונים ברשתית. צבע ניאון מוזרק במהלך הקלטות לאפיין תת מורפולוגיות עצביות. הליך זה מאפשר לנו לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של כל נוירון ברשתית העכבר.
Protocol
הצהרת אתיקה: נהלים כרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטה וויין סטייט.
1. הכנת פתרון ניסויי
- הכן את הפתרון לנתח 1 יום 1 בשבוע שלפני הניסוי בפועל. השתמש בפתרון חיץ HEPES לנתיחה רשתית בגלל יכולת החציצה החזקה שלה בטמפרטורות נמוכות יותר 16. מערבבים את כל החומרים הכימיים כדלקמן (מ"מ): 115 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl 2, 1.0 MgCl 2, 10 HEPES, גלוקוז 28. התאם ל- pH 7.4 עם NaOH. שמור את הפתרון במקרר עד השבוע 1.
- פתרון ההקלטה הוא המדיום 'איימס, שהוא נוזל מוחי מלאכותי השדרה (aCSF) המיועד להכנות רשתית 17. מהיום ליום של הניסוי, לשקול את האבקה "איימס (4.4 גר 'לפתרון 500 מיליליטר) בצינור. כמו כן, לשקול את NaHCO 3 (0.95 גר 'ל -500 מיליליטר פתרון) ומערבבים עםהאבקה 'mes.
- הכן את פתרון פיפטה תאית עבור הקלטות מהדק תיקון מהיום ליום של הניסוי. מערבבים את כל החומרים הכימיים כדלקמן (מ"מ): 111 K-גלוקונאט, 1.0 CaCl 2, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 10 NaCl, 1.0 MgCl 2, 5 ATP-Mg, ו1.0 GTP-Na. התאם ל- pH 7.2 עם KOH. סנן את פתרון פיפטה עם מסנן מזרק קונבנציונלי. הפוך ~ 500 aliquots μl ולאחסן אותם במקפיא או במקפיא עמוק.
2. הכנה ליום של ניסוי
- בלילה שלפני הניסוי, למקם את עכבר בכלוב (C57BL / 6J או רקע דומה, 4-8 שבועות, זכר) בחלל חשוך לO / N הסתגלות כהה.
- הכנה לנתיחה:
- מלא לנתח פתרון (100 - 200 מיליליטר) בכוס זכוכית, מניח אותו על קרח, ואת הבועה עם חמצן במשך לפחות 10 דקות.
- התחל חמצון של התיבה הכהה לאחסון הכנת רשתית.
- הכן coverslips פלסטיק עם פסי שומן מחדשהכנות פרוסה tinal ולמקם כל אחד מהם בצלחת פלסטיק 35 מ"מ.
- צרף סכין גילוח חדש למסוק (מבצעה רקמה).
- חותך קרום מסנן לשני חצאים. זה מיועד לחיתוך ברשתית.
- יישר את הכלים לנתח וטפטפות העברה ליד מיקרוסקופ לנתח. אזור העבודה חייב להיות מאורגן היטב, כך שכל כלי ניתן לגשת בקלות בחושך.
- הכנה להקלטות מהדק תיקון:
- לפזר האבקה 'איימס וNaHCO 3 במים מזוקקים (איימס 4.4 g וNaHCO 3 0.95g / 500 מיליליטר DDH 2 O). בינוני הבועה 'איימס מעורב חמצן (O 95% CO 2 ו- 5% 2) לפחות 30 דקות בזמן חימום לרמת טמפרטורת הקלטה (~ 35 ° C). התאם את ה- pH 7.4 עם NaHCO 3 ועדיין מבעבעים.
- להפשיר את פתרון פיפטה הפנימי במהלך הניתוח. לאחר שהפשיר, להוסיף 0.01% sulforhodamine B עבור מכתים תאיים.
3. הרשתית Dissection
- בחדר חשוך, להרדים את העכבר באמצעות פחמן דו חמצני וחזה אוויר דו-צדדי. לאחר 2-3 דקות של שימוש בפחמן דו חמצני, העכבר יאבד את הכרתו.
- כאשר סמן העכבר כבר לא מגיב לקמצוץ זנב, enucleate במהירות את העיניים ומניחים אותם בפתרון לנתח קר בצלחת פלסטיק. בצע את pneumothorax דו-צדדי, כדי להבטיח את מותו של בעל החיים. מהירות לאחסן את העיניים בצלחת בתיבה הכהה. השתמש בצופת אינפרא אדום לנהל את ההליך בחושך.
הערה: לחלופין, isoflurane, עריפת ראש, או נקע בצוואר הרחם יכולה לשמש להמתת חסד. השיטה של המתת חסד צריכה לעקוב אחר ההנחיות של המכון הלאומי לבריאות (NIH) ו / או ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים. - בחדר חשוך, להתאים את מיקרוסקופ לנתח ותאורת אינפרא אדום. מתחת למיקרוסקופ, להעביר עין מהמנה שלה לתוך צלחת פלסטיק 10 סנטימטרים wה- i הפתרון לנתח המקורר. ברציפות חמצן בועה דרך צינורות שהונח על החלק התחתון של צלחת הפלסטיק. התאם את נפח הזרימה כך שזה לא נמוך מדי, אבל לוודא שהוא לא גבוה מספיק כדי להפריע לנתיחה.
- קרנית ועדשת ההסרה:
- עושה חתך בחלק העליון של הקרנית עם סכין מיקרו-כירורגית. מחזיק את עצב הראייה בקצה השני של גלגל העין מונע את העין לנוע. להאריך את החתך באמצעות מספריים כירורגית. חותך את הקרנית עם כמה לובן העין סביבו.
- תפוס את העדשה עם מלקחיים עדינים ולשלוף את העדשה באיטיות. אם הזגוגית דביקה מדי כדי להסיר את העדשה, לחתוך את הזגוגית עם זוג מספריים.
- ברגע שעיני הכוס הוא עשה, בעדינות לשפוך פתרון קר, חומץ לנתח לעיינית עם טפטפת העברה קטן.
הערה: גלגל העין מתפחסת במהירות לאחר מבצעים חתך בקרנית. חשוב לשמור על הצורה של עין כעיוות עין במהלך פרו זהcedure יפגע הרשתית ולגרום להיפרדות רשתית.
- זיהוי הצדדים גב וגחון של הרשתית:
הערה: בגלל חלוקה לא שווה של ירוק והסגול (UV) קונוסים 18, זיהוי אזור ברשתית ספציפי חשוב להקלטות תגובת אור.- זהה את הקו הולך על פני כוס עין הרשתית עוברת ליד ראש עצב הראייה. קו זה עובר ברובו מעבר לצד הגחוני של עצב הראייה; הצד כולל את עצב הראייה הוא צד הגב, ואילו השני הוא הגחון 19. ראה אתר זה בבירור תחת צופים אינפרא אדום.
- בהתאם לצורך הניסוי, לעשות חתך בצד המיותר. זה יהיה שימושי לאחר שבודד הרשתית מכוס עין.
- הסרת זגוגית:
- לחלופין, דגירה עין-הכוס עם hyaluronidase (0.5 מ"ג / מיליליטר) במשך 15 דקות.
- הסר את הזגוגית עם מלקחיים נוספים-בסדר. הזגוגית היא בעיקרמצורף בתחתית והקצה החיצוני של העין-הכוס. בעדינות להסיר אותו בלי לגעת או דוקרים את הרשתית. כזגוגית עשויה להיות קשורה באופן הדוק לעיינית, להסיר בעדינות כדי למנוע היפרדות רשתית מהעין-הכוס. תמשיך למשוך עד אין מתח מורגש.
הערה: שלב זה הוא חשוב במיוחד עבור לנתח רשתית העכבר; עם זאת, זה לא בעיה עבור הרשתיות של מינים אחרים כגון עכברים או סלמנדרה.
- לבודד את הרשתית מהעין-הכוס. תפוס את לובן העין ובעדינות לקלף את הרשתית באמצעות הישבן של מלקחיים.
הערה: Whole-Mount הכנות רשתית יכולה להיות עשויה מהרשתית המבודדת. הפוך 03:57 קיצוצים בקצוות ולשטח את הרשתית, או לחתוך את הרשתית למספר חלקים. - חתוך את הרשתית וזורקים את המחצית המיותרת של הרשתית (שלב 3.5). באותה צלחת פלסטיק, לחתוך את הרשתית שנותרה לשני חלקים. לכל פיסה של הרשתית, לחתוך את הקצוות כדי להפוך אתלוח רשתית, וחתוך את הקצוות מתקפלים.
- העבר את לוח רשתית על צלחת זכוכית בעזרת פיפטה גדולה העברה (~ 2 מיליליטר). להתחנף הפתרון העודף עם טפטפת קטן, להשתמש בפיסת נייר סינון כדי לשטח את הלוח, ולאחר מכן למקם במהירות חתיכת קרום המסנן על גבי הרקמה.
- בעזרת פיפטה העברה קטנה, במקום ירידה של ביתור פתרון בקרום המסנן. חכה ~ 15 שניות עד הפתרון משתרע על פני הקרום. במהלך תקופה זו, רקמת הרשתית תדבק קרום המסנן.
- יוצקים פתרון לנתח קר יותר מתחת ומסביב למסנן. רקמת הרשתית עם קרום המסנן תצוף. תפוס את הקרום המסנן עם מלקחיים ומניח אותו בתא החיתוך. יוצקים לנתח פתרון על הרקמה, ולאחסן את ההכנה בתיבה הכהה.
הערה: ההליך המתואר כאן הוא קריטי. חשוב לבצע את הפעולות הבאות במהירות על מנת להבטיח כי מקלות רקמת רשתית לmem המסנן brane ולא להתייבש.
- באמצעות מסוק, לחתוך את רקמת הרשתית לפרוסות. סביב 200 מיקרומטר עובי אפשרי ללימודי מהדק תיקון.
- מניחים coverslip פלסטיק עם פסי שומן בתא החיתוך. העבר את פרוסת רשתית על גבי מסילות השומן על coverslip פלסטיק. סובב את הפרוסה 90 מעלות כך שהסעיף הרוחבי גלוי. לחץ על קרום המסנן כלפי מטה על coverslip, אז, לכסות את הצדדים של נייר הסינון עם גריז.
- אחרי פרוסה היא משותקת על coverslip פלסטיק, לתפוס את coverslip ולהעביר אותו לצלחת פלסטיק 35 מ"מ. יוצקים פתרון לנתח קר על הכנת הרשתית ולהטביע את ההכנה. אחסן כל מנה בתיבה הכהה, שאמור להיות מחומצן ברציפות.
הערה: כל ההליך צריך להיעשות בזהירות, כדי שקרום הסינון אינו מעוות. אחרת, פרוסת הרשתית בקלות מפרידה מן קרום המסנן.
- אחרי פרוסה היא משותקת על coverslip פלסטיק, לתפוס את coverslip ולהעביר אותו לצלחת פלסטיק 35 מ"מ. יוצקים פתרון לנתח קר על הכנת הרשתית ולהטביע את ההכנה. אחסן כל מנה בתיבה הכהה, שאמור להיות מחומצן ברציפות.
ss = "jove_title"> 4. הצמד תיקון הקלטות מרשתית Slice הכנה
- הקלטת הכנה:
- ראש צינורות זלוף עם המדיום 'איימס. לאפשר לכל הבועות כדי לעבור בעת מילוי צינורות.
- הפוך טפטפות הקלטת מהדק תיקון עם חולץ. כדי למלא את פיפטה עם פתרון פיפטה, לטבול בישבן של פיפטה דקות 1 עד קצה פיפטה backfilled. בשלב הבא, למלא ~ 1/3 של פיפטה באמצעות מילוי מיקרו-פיפטה. אחסן כל פיפטה בתיבת פיפטה לחה.
- הפעל את הציוד להקלטות מהדק תיקון; כולל מחשב, מגבר, מצלמת CCD, ומיקרוסקופ.
- לכבות את האור בחדר. הנח הכנת פרוסה רשתית על תא הבמה מיקרוסקופ באמצעות צופה אינפרא אדום. אחרי זה הוא משותק, להתחיל זלוף הרציף. הגדר את טמפרטורת זלוף ב33-37 מעלות צלזיוס.
- הצג את פני השטח הפרוסה עם מצלמת CCD. להתמקד במיקום היעד שבו ce היעדסוגי ll מתגוררים. בחר תא בריא למראה להקלטת מהדק תיקון (כלומר, זה צריך להיות משטח מראה חלק וצורת תא טובה).
- הנח פיפטה הקלטה במחזיק פיפטה. לקדם את פיפטה להכנת פרוסה. כשהיא קרובה להכנת פרוסה (~ 2 מ"מ מעל), למצוא את הקצה של פיפטה עם מיקרוסקופ. ברגע שקצה פיפטה גלוי מתחת למיקרוסקופ, להזיז את הקצה מטה לכיוון תא המטרה.
- הגדר את המגבר. התאם את פיפטה ב0 mV / 0 הרשות הפלסטינית (איפוס) ולהתחיל דופק חשמלי רציף של ~ 5 mV ב ~ 10 Hz. בדוק את התנגדות פיפטה; התנגדות אידיאלית היא בין 5 ל 10 MΩ עבור רוב נוירונים ברשתית.
- התחל נשיפה מהקצה. השתמש בשופר, או להשתמש במזרק, להפעיל לחץ חיובי כאשר פיפטה טובלת לתוך פתרון האמבטיה. ברציפות לכבות את הפתרון הפנימי עד הקצה הוא על פני השטח של תא המטרה.
- כאשר הלחץ החיובי עושה גומה קטנה על הפני תא דואר, לקדם את הקצה מעט ולהפסיק נשיפה. בדוק את התנגדות פיפטה, אשר אמור להגדיל. אם הוא עולה בהתמדה, להשאיר אותו ולפקח על ההתנגדות עד שהוא מגיע> GΩ 1 (gigaseal). אם ההתנגדות אינה מעלה באופן ספונטני, בעדינות להפעיל לחץ שלילי עד שהוא הופך gigaseal.
- לאחר gigaseal מושגת, לשנות את פוטנציאל החזקה ל-70 mV. לאחר מכן, לסירוגין להפעיל לחץ שלילי להתפקע הקרום בתוך קצה פיפטה. כאשר התצורה כל התא מורכב, התנגדות פיפטה יכולה להיות בין 500 MΩ וGΩ 1, ונוכחי קיבולי נראה. לפעמים ניתן לראות זרמי postsynaptic ספונטניים.
- רשום את מערכת היחסים IV מ-80 ל+40 mV. סוגים שונים של ערוצי מתח מגודרת מופעלים בהתאם לסוג התא.
- שיא אור עורר זרמים או מתחים הסינפטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכנת פרוסה נציג מוצגת באיור 1. הכנת פרוסה נמצאת בעמדה ישרה, מראה קולטניים אור לתאי הגנגליון במשטח שטוח, ולא ניתוק מנייר הסינון. אם הפרוסה מוטה, רק חלק מההכנה הוא בפוקוס, מה שהופך את זה קשה לזהות תא מתאים להידוק תיקון. להקלטות, חשוב לבחור סומה טובה, אשר בדרך כלל יש משטח מבריק, צורה אפילו עגולה, ולא לוחות כהים גלויים. אחרי כל תצורת התא נעשתה, הפרוסה נחשפה לאור רקע ולאחר מכן לצעד-אור (איור 2). פוטנציאלי postsynaptic מעוררים אור עורר (L-EPSPs) היו עורר בתגובה לצעד-אור (עיתוי הוא בצבע צהוב). המשרעת השיא וזמן הדעיכה מגוונת בהתאם לסוג התא ותת-הסוג. תא גנגליון שנוצר פוטנציאל פעולה בתגובה לגירויים בהירים (איור 2 D & E). Cel סוג l ותת הסוג מורפולוגיים נחשפו על ידי תיוג sulforhodamine אחרי הקלטות פיסיולוגיות (איור 2, מימין).
1. הכנות איור רשתית פרוסה. (א) הכנת פרוסה רשתית נצפתה עם מטרת 10X. הכנת פרוסה רשתית (למעלה) הייתה מחוברת לפיסת נייר סינון (למטה). אוסף ארבע-תמונה המציג הכנת פרוסה רשתית נצפתה עם מטרת 60x (B). כל שכבת תא בבירור הוא ציינה (ONL: שכבה חיצונית גרעינית, OPL: שכבה חיצונית plexiform, INL: שכבת גרעין פנימית, IPL: שכבת plexiform פנימית, GCL: שכבת תא גנגליון) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
.within-page = "תמיד"> 
איור 2. פוטנציאלים עוררי אור מעורר postsynaptic (L-EPSPs) מתאי עצב ברשתית. צעד-אור עורר L-EPSPs (משמאל). עוצמת האור הייתה 30 - 60% לעומת ובר. רמת הסתגלות אור הרקע הייתה 4 x 10 4 פוטונים / מיקרומטר 2 / sec. Sulforhodamine B הוזרק במהלך מהדק תיקון הקלטה כדי להמחיש את הנוירונים נרשמו (מימין). פיפטה הקלטה עדיין מחוברת לסומה () L-EPSPs וצביעת sulforhodamine מתא דו קוטבי חרוט ON. (ב) OFF תא דו קוטבי חרוט. תא amacrine (C). (ד) בתא גנגליון. (E) OFF תא גנגליון. בר סולם עולה 2 או 5 mV כאמור. גירוי אור יושם עבור 1 שניות. אנא לחץ כאןכדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (28-60 days old, male) | Jackson laboratory | C57BL/6J strain | |
| Ames' medium powder | Sigma | A1420 | excellent |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | excellent |
| Dissecting tool: forceps | Dumont | #4, #5, #55 | excellent |
| Dissecting tool: scissors | Roboz | RS-5605 | excellent |
| Dissecting tool: surgery knife | Surgistar | 7514 | excellent |
| Razor blade (for chopper) | EMS | 71970 | excellent |
| Chopper | handmade | ||
| Infrared viewer | Night Owl Optics | NOBG1 | It shows bright view. Focusing small objects is an issue. |
| Puller | Sutter | P-1000 | excellent; makes consistent size pipettes. |
| Dark box | Pelican | dark box | excellent |
| Patch clamp system | Scientifica | slice scope 2000 | Excellent setup. Most key components are included in one package. Micromanipulators are excellent. |
| Amplifier | Molecular Devices | multiclamp 700B | Excellent and easy control. |
| Acquiring software | Molecular Devices | pClamp software | Excellent and easy control. |
| Light source (LED) | Cool LED | pE-2 4 channel system | Excellent |
| CCD camera | Q-imaging | Retiga 2000 | Excellent |
| Faraday cage | handmade |
References
- Werblin, F. S., Dowling, J. E. Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording. J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Lukasiewicz, P., Werblin, F. A slowly inactivating potassium current truncates spike activity in ganglion cells of the tiger salamander retina. J Neurosci. 8 (12), 4470-4481 (1988).
- Kaneko, A., Tachibana, M. Effects of L-glutamate on the anomalous rectifier potassium current in horizontal cells of Carassius auratus retina. J Physiol. 358, 169-182 (1985).
- Kamermans, M., Werblin, F. GABA-mediated positive autofeedback loop controls horizontal cell kinetics in tiger salamander retina. J Neurosci. 12 (7), 2451-2463 (1992).
- Cook, P. B., McReynolds, J. S. Lateral inhibition in the inner retina is important for spatial tuning of ganglion cells. Nat Neurosci. 1 (8), 714-719 (1998).
- Pang, J. J., Gao, F., Wu , J. S. Light-evoked current responses in rod bipolar cells, cone depolarizing bipolar cells and AII amacrine cells in dark-adapted mouse retina. J Physiol. 558 (Pt. 558 (Pt 3), 897-912 (2004).
- Euler, T., Masland , R. H. Light-evoked responses of bipolar cells in a mammalian retina). J Neurophysiol. 83 (4), 1817-1829 (2000).
- Berntson, A., Taylor , W. R. Response characteristics and receptive field widths of on-bipolar cells in the mouse retina. J Physiol. 524 Pt. 524 (Pt 3), 879-889 (2000).
- Sterling, P., Smith, R. G. Design for a binary synapse. Neuron. 41 (3), 313-315 (2004).
- Borghuis, B. G., Marvin, J. S., Looger, L. L., Demb, J. B. Two-photon imaging of nonlinear glutamate release dynamics at bipolar cell synapses in the mouse retina. J Neurosci. 33 (27), 10972-10985 (2013).
- Dowling, J. E., Sidman, R. L. Inherited retinal dystrophy in the rat. J Cell Biol. 14, 73-109 (1962).
- Eggers, E. D., Lukasiewicz, P. D. GABA(A), GABA(C) and glycine receptor-mediated inhibition differentially affects light-evoked signalling from mouse retinal rod bipolar cells. J Physiol. 572 (Pt 1), 215-225 (2006).
- Ichinose, T., Lukasiewicz, P. D. The mode of retinal presynaptic inhibition switches with light intensity). J Neurosci. 32 (13), 4360-4371 (2012).
- Ichinose, T., Fyk-Kolodziej, B., Cohn, J. Roles of ON cone bipolar cell subtypes in temporal coding in the mouse retina. J Neurosci. 34 (26), 8761-8771 (2014).
- Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
- Ames, A. 3rd, Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Haverkamp, S., et al. The primordial, blue-cone color system of the mouse retina. J Neurosci. 25 (22), 5438-5445 (2005).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
- Farre, C. G., M Bruggemann, A., Fertig, N. Ion channel screening - automated patch clamp on the rise. Drug discovery today. Technologies. 5 (1), e1-e34 (2008).
