रिकॉर्डिंग पैच दबाना तकनीकों का प्रयोग काले अनुकूलित, माउस रेटिना टुकड़ा तैयारी में न्यूरॉन्स में में postsynaptic प्रतिक्रियाएँ प्रकाश पैदा

Abstract

रेटिना दृश्य प्रणाली के लिए प्रवेश द्वार है। दृश्य सिग्नल प्रोसेसिंग तंत्र को समझने के लिए, हम रेटिना तंत्रिका नेटवर्क के कार्यों की जांच। नेटवर्क में रेटिना न्यूरॉन्स कई उपप्रकार के शामिल। द्विध्रुवी कोशिकाओं, नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं, और amacrine कोशिकाओं के 10 से अधिक उपप्रकार रूपात्मक अध्ययन के द्वारा पहचान की गई है। रेटिना न्यूरॉन्स के कई उपप्रकार इस तरह के प्रस्ताव और रंग के रूप में दृश्य संकेतन के विशिष्ट सुविधाओं, सांकेतिक शब्दों में बदलना है, और कई तंत्रिका रास्ते फार्म लगा रहे हैं। हालांकि, दृश्य सिग्नल प्रोसेसिंग में प्रत्येक न्यूरॉन के कार्यात्मक भूमिका पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं। पैच दबाना विधि इस मौलिक सवाल का पता करने के लिए उपयोगी है। इधर, एक प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है काले अनुकूलित परिस्थितियों में पैच दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग माउस रेटिना न्यूरॉन्स में प्रकाश पैदा synaptic प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए। माउस आँखों हे / एन काले अनुकूलित कर रहे हैं, और रेटिना टुकड़ा तैयारी अवरक्त रोशनी और दर्शकों का उपयोग करते हुए एक अंधेरे कमरे में विच्छेदित कर रहे हैं। इन्फ्रारेड प्रकाश नहीं करतामाउस फोटोरिसेप्टर को सक्रिय करने और इस प्रकार उनके प्रकाश जवाबदेही बरकरार रखता है। पैच दबाना रेटिना न्यूरॉन्स में प्रकाश पैदा प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है। एक फ्लोरोसेंट रंजक न्यूरोनल रूपात्मक उपप्रकार चिह्नित करने के लिए रिकॉर्डिंग के दौरान इंजेक्शन है। यह प्रक्रिया माउस रेटिना में प्रत्येक न्यूरॉन के शारीरिक कार्यों को निर्धारित करने के लिए सक्षम बनाता है।

Protocol

आचार कथन: पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाएं वेन स्टेट यूनिवर्सिटी में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया।

प्रयोगात्मक समाधान के 1. तैयारी

1. वास्तविक प्रयोग से पहले विदारक समाधान एक दिन के सप्ताह एक करने के लिए तैयार करते हैं। क्योंकि कम तापमान ¹⁶ में अपनी मजबूत बफरिंग क्षमता की रेटिना विच्छेदन के लिए एक HEPES बफर समाधान का उपयोग करें। (मिमी में) के रूप में इस प्रकार है सभी रसायनों मिक्स: 115 सोडियम क्लोराइड, 2.5 KCl, 2.5 ₂ CaCl, 1.0 ₂ MgCl, 10 HEPES, 28 ग्लूकोज। NaOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करें। एक सप्ताह के लिए एक रेफ्रिजरेटर में समाधान रखें।
2. रिकॉर्डिंग समाधान रेटिना की तैयारी ¹⁷ के लिए बनाया गया एक कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी द्रव (ACSF) है, जो एम्स 'मध्यम है। प्रयोग के दिन तक एक ट्यूब में एम्स 'पाउडर (500 मिलीलीटर समाधान के लिए 4.4 ग्राम) बाहर तौलना। इसके अलावा, ₃ NaHCO (500 मिलीलीटर समाधान के लिए 0.95 छ) वज़न और एक साथ मिश्रणएम ई पाउडर।
3. प्रयोग के दिन से पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए इंट्रासेल्युलर पिपेट समाधान तैयार है। (मिमी में) के रूप में इस प्रकार है सभी रसायनों मिक्स: 111 कश्मीर gluconate, 1.0 ₂ CaCl, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 10 सोडियम क्लोराइड, 1.0 MgCl _2, 5 एटीपी मिलीग्राम, और 1.0 जीटीपी ना। KOH के साथ 7.2 पीएच को समायोजित करें। एक पारंपरिक सिरिंज फिल्टर के साथ पिपेट समाधान फ़िल्टर। ~ 500 μl aliquots बनाओ और एक फ्रीजर या एक डीप फ्रीजर में उन्हें दुकान।

प्रयोग के दिन के लिए 2. तैयारी

1. हे / एन अंधेरे अनुकूलन के लिए एक अंधेरे अंतरिक्ष में - (पुरुष, 8 सप्ताह पुराने 4, C57BL / 6J या इसी तरह की पृष्ठभूमि) रात प्रयोग से पहले, एक पिंजरे में एक माउस जगह है।
2. विच्छेदन के लिए तैयारी:
   1. कम से कम 10 मिनट के लिए ऑक्सीजन के साथ, एक गिलास बीकर में - (200 मिलीलीटर 100) यह बर्फ पर जगह है, और बुलबुला समाधान विदारक भरें।
   2. रेटिना तैयारी भंडारण के लिए अंधेरे बॉक्स की oxygenation शुरू करो।
   3. पुनः के लिए तेल रेल के साथ प्लास्टिक coverslips तैयार करेंtinal टुकड़ा तैयारी एक 35 मिमी प्लास्टिक पकवान में उनमें से हर जगह और।
   4. एक हेलिकॉप्टर (ऊतक slicer) के लिए एक नई धार देते हैं।
   5. दो हिस्सों में एक फिल्टर झिल्ली कट। यह रेटिना टुकड़ा करने की क्रिया के लिए है।
   6. विदारक माइक्रोस्कोप के पास विदारक उपकरण और हस्तांतरण pipettes संरेखित करें। प्रत्येक उपकरण आसानी से अंधेरे में पहुँचा जा सकता है इतना है कि काम के क्षेत्र में अच्छी तरह से आयोजित किया जाना चाहिए।
3. पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए तैयारी:
   1. एम्स 'पाउडर और आसुत जल में ₃ NaHCO (एम्स 4.4 जी और ₃ NaHCO 0.95g / 500 मिलीलीटर DDH ₂ ओ) भंग। मिश्रित ऑक्सीजन के साथ बुलबुला एम्स 'मध्यम (95% ओ ₂ और 5% सीओ ₂₎ में कम से कम 30 मिनट के लिए, जबकि एक रिकॉर्डिंग तापमान स्तर तक हीटिंग (~ 35 डिग्री सेल्सियस)। अभी भी बुदबुदाती जबकि ₃ NaHCO के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करें।
   2. विच्छेदन के दौरान आंतरिक पिपेट समाधान गला लें। यह thawed है, के बाद से intracellular धुंधला के लिए 0.01% sulforhodamine बी जोड़ें।

3. रेटिना विच्छेदन

1. एक अंधेरे कमरे में, कार्बन डाइऑक्साइड और द्विपक्षीय वातिलवक्ष का उपयोग कर माउस euthanize। 2 के बाद - कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग करने का 3 मिनट, माउस चेतना खो देंगे।
2. माउस अब एक पूंछ चुटकी करने के लिए जवाब है, तो जल्दी से आँखें मालूम करना और एक प्लास्टिक की थाली में एक ठंड विदारक समाधान में उन्हें जगह है। पशु की मौत सुनिश्चित करने के लिए द्विपक्षीय वातिलवक्ष प्रदर्शन करते हैं। जल्दी अंधेरा बॉक्स में डिश में आंख की दुकान। अंधेरे में प्रक्रिया का संचालन करने के लिए एक अवरक्त दर्शक का प्रयोग करें।
   नोट: वैकल्पिक रूप से, isoflurane, कत्ल, या गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था इच्छामृत्यु के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इच्छामृत्यु की विधि के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) और / या संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों का पालन करना चाहिए।
3. एक अंधेरे कमरे में, विदारक माइक्रोस्कोप और अवरक्त रोशनी समायोजित करें। माइक्रोस्कोप के तहत, एक 10 सेमी प्लास्टिक पकवान डब्ल्यू में अपने पकवान से एक आँख का स्थानांतरणठंडा विदारक समाधान रबर। लगातार ट्यूबिंग के माध्यम से बुलबुला ऑक्सीजन प्लास्टिक डिश के तल पर रखा गया। यह भी कम नहीं है तो प्रवाह की मात्रा समायोजित करें, लेकिन यह विच्छेदन परेशान करने के लिए पर्याप्त नहीं है कि सुनिश्चित करते हैं।
4. कॉर्निया और लेंस हटाने:
   1. एक सूक्ष्म शल्य चाकू के साथ कॉर्निया के शीर्ष पर एक चीरा बनाओ। नेत्रगोलक के दूसरे छोर पर ऑप्टिक तंत्रिका होल्डिंग बढ़ने से आंख को रोकता है। शल्य कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर काट बढ़ाएँ। इसके चारों ओर कुछ श्वेतपटल साथ कॉर्निया काट दिया।
   2. एक ठीक संदंश के साथ लेंस ले लो और धीरे धीरे लेंस बाहर खींच। कांच का लेंस को दूर करने के लिए बहुत चिपचिपा है, तो कैंची की एक जोड़ी के साथ कांच का काटा।
   3. आंख कप किया जाता है एक बार, धीरे से एक छोटा सा हस्तांतरण विंदुक के साथ eyecup में ठंड, ऑक्सीजन विदारक समाधान डालना।
      ध्यान दें: एक चीरा कॉर्निया में किया जाता है के बाद नेत्रगोलक जल्दी deflates। यह इस समर्थक के दौरान आंख deforming के रूप में आंख के आकार को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैcedure रेटिना को नुकसान पहुंचा है और रेटिना टुकड़ी का कारण होगा।
5. रेटिना के पृष्ठीय और उदर पक्षों की पहचान:
   नोट: हरे और पराबैंगनी (यूवी) के असमान वितरण के एक विशिष्ट रेटिना क्षेत्र की पहचान करने, ¹⁸ शंकु क्योंकि प्रकाश प्रतिक्रिया रिकॉर्डिंग के लिए महत्वपूर्ण है।
   1. ऑप्टिक तंत्रिका सिर के पास से गुजर रहा रेटिना आंख कप के पार जा रहा लाइन को पहचानें। यह पंक्ति ज्यादातर ऑप्टिक तंत्रिका के उदर पक्ष भर में गुजरता है; अन्य ¹⁹ उदर है, जबकि ऑप्टिक तंत्रिका सहित पक्ष, पृष्ठीय पक्ष है। अवरक्त दर्शकों के तहत स्पष्ट रूप से इस ऐतिहासिक देखें।
   2. प्रयोग के उद्देश्य पर निर्भर करता है, अनावश्यक पक्ष पर एक कटौती करते हैं। यह आंख कप से रेटिना अलग-थलग करने के बाद उपयोगी हो जाएगा।
6. शीशे हटाने:
   1. वैकल्पिक रूप से, 15 मिनट के लिए hyaluronidase (0.5 मिलीग्राम / एमएल) के साथ आंख-कप सेते हैं।
   2. अतिरिक्त ठीक संदंश के साथ कांच निकालें। कांच का मुख्य रूप से हैनीचे और आंख कप के बाहरी छोर से जुड़ी। धीरे छूने या रेटिना poking के बिना इसे हटा दें। कांच का कसकर eyecup से सम्बद्ध किया जा सकता है, आंख-कप से रेटिना टुकड़ी से बचने के लिए धीरे हटा दें। कोई तनाव महसूस किया है जब तक खींचने के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: यह कदम माउस रेटिना विदारक के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है; हालांकि, यह इस तरह के चूहे या समन्दर के रूप में अन्य प्रजातियों के retinas के लिए एक समस्या नहीं है।
7. आंख-कप से रेटिना अलग। श्वेतपटल ले लो और धीरे संदंश की पीठ का उपयोग कर रेटिना दूर छील।
   नोट: रेटिना की तैयारी पूरे माउंट अलग रेटिना से बनाया जा सकता है। किनारों पर 3-4 कटौती करने और रेटिना को समतल, या कई टुकड़ों में रेटिना में कटौती।
8. रेटिना ट्रिम और रेटिना के अनावश्यक आधा त्यागने (3.5 कदम)। एक ही प्लास्टिक पकवान में, दो टुकड़ों में शेष रेटिना काटा। रेटिना के एक टुकड़े के लिए, एक बनाने के लिए किनारों को काट दियारेटिना स्लैब, और तह किनारों ट्रिम।
9. एक बड़े हस्तांतरण पिपेट (~ 2 मिलीलीटर) का उपयोग कर एक गिलास प्लेट पर एक रेटिना स्लैब स्थानांतरण। एक छोटे से विंदुक के साथ अतिरिक्त समाधान चूसना स्लैब समतल करने के लिए फिल्टर पेपर के एक टुकड़े का उपयोग करें, और फिर जल्दी से ऊतक के शीर्ष पर फिल्टर झिल्ली का एक टुकड़ा जगह है।
   1. एक छोटे से हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करना, फिल्टर झिल्ली पर समाधान विदारक की एक बूंद जगह है। समाधान झिल्ली भर में फैलता है जब तक ~ 15 सेकंड रुको। इस समय के दौरान, रेटिना ऊतक फिल्टर झिल्ली के लिए रहना होगा।
   2. के तहत और फिल्टर के आसपास और अधिक ठंड विदारक समाधान डालो। फिल्टर झिल्ली के साथ रेटिना ऊतक जारी करेगी। एक संदंश के साथ फिल्टर झिल्ली को पकड़ो और टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष में जगह है। ऊतक पर समाधान विदारक डालो, और अंधेरे बॉक्स में तैयारी की दुकान।
      नोट: यहाँ वर्णित प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करने के लिए जल्दी से इन चरणों को पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण है कि फिल्टर मेम को रेटिना ऊतक की छड़ेंbrane और बाहर सूखा नहीं है।
10. एक हेलिकॉप्टर का उपयोग करना, स्लाइस में रेटिना ऊतक में कटौती। लगभग 200 माइक्रोन मोटाई पैच दबाना अध्ययन के लिए संभव है।
11. टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष में तेल रेल के साथ एक प्लास्टिक coverslip जगह। एक प्लास्टिक coverslip पर तेल रेल के शीर्ष पर एक रेटिना टुकड़ा स्थानांतरण। अनुप्रस्थ अनुभाग दिखाई दे रहा है तो यह है कि टुकड़ा 90 डिग्री घुमाएँ। है, तो, coverslip पर नीचे फिल्टर झिल्ली प्रेस तेल के साथ फिल्टर पेपर के पक्षों को कवर किया।
    1. टुकड़ा एक प्लास्टिक coverslip पर स्थिर है, के बाद coverslip के हड़पने के लिए और एक 35 मिमी प्लास्टिक पकवान को हस्तांतरण। रेटिना तैयारी पर ठंड विदारक समाधान डालो और तैयारी डूब। लगातार ऑक्सीजन की जानी चाहिए जो अंधेरे बॉक्स में प्रत्येक पकवान, स्टोर।
       नोट: इस पूरी प्रक्रिया में फिल्टर झिल्ली विकृत नहीं है कि इतनी सावधानी से किया जाना चाहिए। अन्यथा, रेटिना टुकड़ा आसानी से फिल्टर झिल्ली से अलग करती है।

1. तैयारी रिकॉर्डिंग:
   1. एम्स 'के माध्यम से प्रधानमंत्री छिड़काव ट्यूबों। ट्यूबिंग भरने जब सभी बुलबुले के माध्यम से पारित करने की अनुमति दें।
   2. एक खींचने के साथ पैच दबाना रिकॉर्डिंग pipettes बनाओ। विंदुक टिप backfilled है जब तक कि एक मिनट के लिए एक पिपेट की पीठ में पिपेट समाधान, डुबकी के साथ एक विंदुक भरने के लिए। इसके बाद, एक माइक्रो पिपेट भराव का उपयोग कर पिपेट की ~ 1/3 भरें। एक नम पिपेट बॉक्स में प्रत्येक पिपेट स्टोर।
   3. पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए उपकरणों पर बारी; कंप्यूटर, एम्पलीफायर, सीसीडी कैमरा, और माइक्रोस्कोप भी शामिल है।
2. कमरे की बत्ती बंद करो। एक अवरक्त दर्शक का उपयोग कर खुर्दबीन मंच चैम्बर पर एक रेटिना टुकड़ा तैयारी रखें। यह स्थिर है, के बाद निरंतर छिड़काव शुरू करते हैं। 33-37 डिग्री सेल्सियस पर छिड़काव तापमान सेट करें।
3. सीसीडी कैमरा के साथ टुकड़ा सतह देखें। लक्ष्य स्थान पर फोकस जहां लक्ष्य सीईकरूँगा प्रकार रहते हैं। पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए एक स्वस्थ दिखने सेल का चयन करें (यानी, यह चिकनी दिखने सतह और एक अच्छा सेल आकार का होना चाहिए)।
4. एक विंदुक धारक में एक रिकॉर्डिंग पिपेट रखें। टुकड़ा तैयारी करने के लिए पिपेट अग्रिम। यह टुकड़ा तैयारी (~ ऊपर 2 मिमी) के करीब हो गया है, माइक्रोस्कोप के साथ पिपेट की नोक पर दिखेगा। विंदुक टिप खुर्दबीन के नीचे दिखाई दे रहा है एक बार, लक्ष्य सेल की ओर टिप नीचे चलते हैं।
5. एम्पलीफायर सेट करें। (Zeroing) 0 एम वी / 0 फिलीस्तीनी अथॉरिटी में पिपेट समायोजित और 10 हर्ट्ज ~ में ~ 5 एम वी की एक सतत बिजली पल्स शुरू करते हैं। पिपेट प्रतिरोध की जाँच करें; आदर्श प्रतिरोध सबसे रेटिना न्यूरॉन्स के लिए 5 और 10 के बीच MΩ है।
6. टिप से बाहर बह शुरू करो। एक मुखपत्र का प्रयोग करें, या पिपेट स्नान समाधान में dips जब सकारात्मक दबाव लागू करने के लिए, एक सिरिंज का उपयोग करें। टिप लक्ष्य सेल की सतह पर है जब तक लगातार आंतरिक समाधान बाहर उड़ा।
   1. सकारात्मक दबाव वें पर एक छोटे से डिंपल बनाता हैई कोशिका की सतह, थोड़ा टिप अग्रिम और बाहर उड़ाने बंद करो। वृद्धि करनी चाहिए जो पिपेट प्रतिरोध, की जाँच करें। यह लगातार बढ़ रही है, तो इसे छोड़ दो और यह> एक GΩ (gigaseal) तक पहुँच जाता है जब तक प्रतिरोध की निगरानी। प्रतिरोध अनायास वृद्धि नहीं होती है, तो यह एक gigaseal हो जाता है, जब तक धीरे नकारात्मक दबाव लागू होते हैं।
7. Gigaseal हासिल करने के बाद, एमवी -70 के लिए होल्डिंग क्षमता बदल जाते हैं। फिर, रहकर विंदुक टिप के अंदर झिल्ली टूटना करने के लिए नकारात्मक दबाव लागू होते हैं। पूरे सेल विन्यास किया जाता है, पिपेट प्रतिरोध 500 MΩ और एक GΩ, और capacitive वर्तमान में देखा जाता है के बीच हो सकता है। कभी कभी सहज पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं मनाया जा सकता है।
8. -80 से 40 एम वी के लिए चतुर्थ संबंध रिकार्ड। वोल्टेज-गेटेड चैनलों के विभिन्न प्रकार के सेल प्रकार के आधार पर सक्रिय कर रहे हैं।
9. रिकॉर्ड अन्तर्ग्रथनी धाराओं या voltages के प्रकाश पैदा।

Representative Results

एक प्रतिनिधि टुकड़ा तैयारी टुकड़ा तैयारी एक सपाट सतह में नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं को फोटोरिसेप्टर दिखा रहा है, एक सीधी स्थिति में है। चित्रा 1 में दिखाया गया है, और फिल्टर पेपर से कोई टुकड़ी है। एक टुकड़ा झुका हुआ है, तो तैयारी का ही हिस्सा है कि यह मुश्किल पैच clamping के लिए एक उपयुक्त सेल की पहचान करने के लिए बनाता है, जो ध्यान में है। रिकॉर्डिंग के लिए, यह आमतौर पर एक चमकदार सतह है जो एक अच्छा सोमा, एक भी गोल आकार, और कोई दिखाई अंधेरे सजीले चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। पूरे सेल विन्यास बाद किया गया था, टुकड़ा एक कदम प्रकाश (चित्रा 2) के लिए तो पृष्ठभूमि प्रकाश के संपर्क में है और किया गया था। प्रकाश पैदा उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षमता (एल EPSPs) (समय पीले रंग में दिखाया गया है) एक कदम प्रकाश के जवाब में पैदा हुए थे। शिखर आयाम और सेल प्रकार और उप प्रकार के आधार पर विविध क्षय समय। एक नाड़ीग्रन्थि सेल उज्ज्वल उत्तेजनाओं (चित्रा 2 डी और ई) के जवाब में कार्रवाई क्षमता उत्पन्न। सेलएल प्रकार और उसके रूपात्मक उप प्रकार शारीरिक रिकॉर्डिंग (दाएं चित्रा 2,) के बाद sulforhodamine लेबलिंग से पता चला रहे थे।

चित्रा 1. रेटिना टुकड़ा तैयारी। (ए) के एक 10x उद्देश्य के साथ देखा एक रेटिना टुकड़ा तैयारी। एक रेटिना टुकड़ा तैयारी (ऊपर) फिल्टर पेपर (नीचे) के एक टुकड़े से जुड़ा था। (बी) के एक 60x उद्देश्य के साथ देखा एक रेटिना टुकड़ा तैयारी दिखा एक चार छवि संकलन। प्रत्येक कोशिका परत स्पष्ट रूप से मनाया जाता है (: बाहरी परमाणु परत, OPL: बाहरी plexiform परत, लीग: भीतर परमाणु परत, आईपीएल: ONL भीतरी plexiform परत, GCL: नाड़ीग्रन्थि सेल परत) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा रेटिना न्यूरॉन्स से 2. प्रकाश पैदा उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षमता (एल EPSPs)। चरण-प्रकाश एल EPSPs (बाएं) पैदा की। 60% वेबर विपरीत - प्रकाश की तीव्रता में 30 था। पृष्ठभूमि प्रकाश अनुकूलन स्तर 4 एक्स 10 ⁴ फोटॉनों / माइक्रोन ² / सेक था। Sulforhodamine बी (दाएं) दर्ज न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए रिकॉर्डिंग पैच दबाना दौरान इंजेक्ट किया गया था। एक रिकॉर्डिंग पिपेट अभी भी एक पर शंकु द्विध्रुवी सेल से सोमा (ए) एल EPSPs और sulforhodamine धुंधला से जुड़ा था। (बी) बंद शंकु द्विध्रुवी सेल। (सी) amacrine सेल। नाड़ीग्रन्थि सेल पर (डी)। नाड़ीग्रन्थि सेल रवाना (ई)। के रूप में विख्यात स्केल बार 2 या 5 एम वी इंगित करता है। प्रकाश उत्तेजना एक सेकंड के लिए लागू किया गया था। यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice (28-60 days old, male)	Jackson laboratory	C57BL/6J strain
Ames' medium powder	Sigma	A1420	excellent
Stereo microscope	Nikon	SMZ745	excellent
Dissecting tool: forceps	Dumont	#4, #5, #55	excellent
Dissecting tool: scissors	Roboz	RS-5605	excellent
Dissecting tool: surgery knife	Surgistar	7514	excellent
Razor blade (for chopper)	EMS	71970	excellent
Chopper	handmade
Infrared viewer	Night Owl Optics	NOBG1	It shows bright view. Focusing small objects is an issue.
Puller	Sutter	P-1000	excellent; makes consistent size pipettes.
Dark box	Pelican	dark box	excellent
Patch clamp system	Scientifica	slice scope 2000	Excellent setup. Most key components are included in one package. Micromanipulators are excellent.
Amplifier	Molecular Devices	multiclamp 700B	Excellent and easy control.
Acquiring software	Molecular Devices	pClamp software	Excellent and easy control.
Light source (LED)	Cool LED	pE-2 4 channel system	Excellent
CCD camera	Q-imaging	Retiga 2000	Excellent
Faraday cage	handmade