Abstract
Netthinnen er inngangsporten til det visuelle systemet. For å forstå visuelle signalprosesseringsmekanismer, undersøker vi retinal nevrale nettverksfunksjoner. Retinale nevroner i nettverket består av flere undertyper. Mer enn 10 undertyper av bipolare celler, ganglion celler, og amacrine celler har blitt identifisert av morfologiske studier. Flere undergrupper av netthinnens nerveceller er tenkt å kode forskjellige funksjoner som optisk varsling, for eksempel bevegelse og farge, og danne flere nervebaner. Imidlertid er de funksjonelle rollene til hver nervecelle i visuell signalbehandling ikke fullt ut forstått. Den patch clamp metoden er nyttig for å løse dette grunnleggende spørsmål. Her, til en protokoll registrere lys-fremkalt synaptiske responser i muse retinal nevroner med patch clamp opptak i mørke-tilpasset forholdene er gitt. Muse øyne er mørk-tilpasset O / N, og retinal slice preparater er dissekert i et mørkt rom ved hjelp av infrarød belysning og seere. Infrarødt lys gjør ikkebruk mus fotoreseptorene og dermed bevarer sitt lys respons. Patch klemme brukes til å registrere lys-fremkalt responser i netthinnens nerveceller. En fluorescerende fargestoff injiseres under opptak for å karakterisere nevronale morfologiske subtyper. Denne fremgangsmåten gjør oss i stand til å bestemme fysiologiske funksjoner i hver nervecelle i musen netthinnen.
Protocol
Etikk Uttalelse: Prosedyrer som involverer forsøksdyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Wayne State University.
1. Utarbeidelse av Experimental Solution
- Forbered dissekere løsning en dag til en uke før selve eksperimentet. Bruk en HEPES-buffer-løsning for retinal disseksjon grunn av sin sterke bufferevne ved lavere temperaturer 16. Bland alle kjemikalier som følger (i mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCI2, 1,0 MgCI2, 10 HEPES, 28 glukose. Juster pH til 7,4 med NaOH. Hold løsningen i kjøleskap opp til en uke.
- Opptaks løsning er Ames-medium, noe som er en kunstig cerebral spinalvæske (aCSF) beregnet for retinale preparater 17. Ved dagen for eksperimentet, veie ut Ames-pulver (4,4 g i 500 ml oppløsning) i et rør. Også veie ut NaHCO3 (0,95 g i 500 ml oppløsning) og blander seg med Ames 'pulver.
- Forberede den intracellulære pipette løsning for patch clamp opptak av dagen for forsøket. Bland alle kjemikalier som følger (i mM): 111 K-glukonat, 1,0 CaCI2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 10 NaCl, 1,0 MgCl2, 5 ATP-Mg, og 1,0 GTP-Na. Juster pH til 7,2 med KOH. Filtrer den pipette-løsning med en konvensjonell sprøytefilter. Gjør ~ 500 ul porsjoner og lagre dem i en fryser eller en dypfryser.
2. Forberedelse til Day of Experiment
- Natten før forsøket, plassere en mus i et bur (C57BL / 6J eller lignende bakgrunn, 4 - 8 uker gammel, mann) i et mørkt rom for O / N mørk tilpasning.
- Forberedelse for disseksjon:
- Fyll dissekere løsning (100-200 ml) i en glassbeholder, legg det på is, og boble med oksygen i minst 10 min.
- Starte oksygenering av den mørke boksen for retinal forberedelse lagring.
- Forberede plast Dekk med fett rails for retinal slice forberedelser og plassere hver av dem i en 35 mm plast tallerken.
- Fest en ny barberblad til en chopper (vev slicer).
- Skjær et filter membran i to halvdeler. Dette er for retinal slicing.
- Rett inn dissekere verktøy og overføre pipetter nær disseksjonsmikroskop. Arbeidsområdet må være godt organisert slik at hvert verktøy kan være lett tilgjengelig i mørket.
- Forberedelse for patch clamp opptak:
- Oppløse Ames 'pulver og NaHCO3 i destillert vann (Ames 4,4 g og NaHCO3 0,95 g / 500 ml DDH 2 O). Boble Ames 'medium med blandet oksygen (95% O 2 og 5% CO2) i minst 30 minutter under oppvarming til en opptakstemperaturnivå (~ 35 ° C). Juster pH til 7,4 med NaHCO3 mens fortsatt bobler.
- Tine den interne pipette løsning i løpet av disseksjon. Etter at den er tint, legg 0,01% sulforhodamin B for intracellulær farging.
3. Retinal Dissection
- I et mørkt rom, avlive musen med karbondioksid og bilateral pneumothorax. Etter 2 - 3 minutter ved bruk av karbondioksyd, vil musen miste bevisstheten.
- Når musen reagerer ikke lenger en hale klype, raskt enucleate øynene og plassere dem i en kald dissekere løsning i en plastskål. Utføre den bilaterale pneumothorax å sikre dyrets død. Raskt lagre øyet i fatet i den mørke boksen. Bruke en infrarød betrakteren til å gjennomføre prosedyren i mørket.
MERK: Alternativt isofluran, halshogging, eller halsdislokasjon kan brukes til aktiv dødshjelp. Metoden for aktiv dødshjelp bør følge retningslinjene i National Institute of Health (NIH) og / eller Institutional Animal Care og bruk komité. - I et mørkt rom, justere disseksjonsmikroskop og infrarød belysning. Under mikroskopet, overføre et øye fra sin rett i en 10 cm plast tallerken wed den avkjølte dissekere løsning. Kontinuerlig boble oksygen gjennom rør som er lagt inn på undersiden av plastskål. Justere volumstrømmen slik at den ikke er for lav, men sikre at det ikke er høy nok til å forstyrre disseksjon.
- Hornhinnen og linsen fjerning:
- Lage et snitt på toppen av hornhinnen med en mikro-kirurgisk kniv. Holder synsnerven i den andre enden av øyeeplet hindrer øyet fra å bevege seg. Forlenge kutt ved hjelp av et par av kirurgiske saks. Skjær ut hornhinnen med noen sclera rundt det.
- Grab linsen med en fin pinsett og trekk linsen ut. Hvis glasslegemet er for klissete å fjerne linsen, kuttet glasslegemet med en saks.
- Når øye-cup er gjort, forsiktig helle kaldt, oksygenrikt dissekere løsning i øyemusling med en liten overføring pipette.
MERK: Øyeeplet tømmes raskt etter et snitt i hornhinnen. Det er viktig å opprettholde formen av øyet som deformeres øyet under denne promåten vil skade netthinnen og forårsake netthinneavløsning.
- Identifisere dorsal og ventral sider av netthinnen:
MERK: På grunn av ujevn fordeling av den grønne og den ultrafiolett (UV) kjegler 18, identifisere en bestemt retinal område er viktig for lette respons innspillinger.- Identifisere linjen går over retinal øye cup passerer nær synsnervehodet. Denne linjen går stort sett over ventral side av synsnerven; side inkludert synsnerven er den dorsale side, mens den andre er ventrale 19. Se dette landemerket tydelig under infrarøde seere.
- Avhengig av formålet for eksperimentet, gjør et kutt på unødvendig side. Dette vil være nyttig etter isolering av retina fra øyet koppen.
- Glasslegemet fjerning:
- Eventuelt inkuber øyet-cup med hyaluronidase (0,5 mg / ml) i 15 min.
- Ta av glasslegemet med ekstra fin pinsett. Glasslegemet er hovedsakeligfestet til bunnen, og den ytre kant av øyet-koppen. Forsiktig fjerne den uten å berøre eller poking netthinnen. Som glasslegemet kan være tett knyttet til øyemusling, fjern forsiktig for å unngå netthinneavløsning fra øyet-cup. Fortsett å trekke inntil ingen spenning er filt.
MERK: Dette trinnet er spesielt viktig for å dissekere musehinnen; men det er ikke et problem for retina fra andre arter som rotte eller salamander.
- Isoler netthinnen fra øyet-cup. Ta tak i sclera og forsiktig skrelle av netthinnen ved hjelp av baksiden av tang.
MERK: Hel-mount retinal forberedelser kan gjøres fra den isolerte netthinnen. Gjør 03:57 kutt i kantene og flate netthinnen, eller kuttet netthinnen i flere biter. - Trimme netthinnen og kast unødvendig halvdel av netthinnen (trinn 3.5). I samme plastskål, klipp den resterende netthinnen i to deler. For hver del av netthinnen, avskåret kantene for å gjøre enretinal skive, og trimme brettekantene.
- Overføre en retinal skive på en glassplate ved hjelp av en stor overførings pipette (~ 2 ml). Suge opp overflødig oppløsning med en liten pipette, bruke et stykke filterpapir til flat skive, og deretter raskt plassere et stykke av filtermembranen på toppen av vev.
- Ved hjelp av en liten overføring pipette, plassere en dråpe dissekere løsning på filter membran. Vent ~ 15 sek inntil oppløsningen sprer seg over membranen. I løpet av denne tiden, vil netthinnevev holde seg til filtermembranen.
- Helle mer kald dissekere løsning under og rundt filteret. Den netthinnevev med filtermembranen vil flyte. Grab filtermembranen med en pinsett og legg den i slicing kammeret. Hell dissekere løsning over vev, og lagre forberedelse i den mørke boksen.
MERK: Fremgangsmåten som beskrives her er kritisk. Det er viktig å utføre disse trinnene raskt for å sikre at de netthinnevev pinner til filter memBrane og ikke tørker ut.
- Ved hjelp av et helikopter, kutt netthinnevev i skiver. Rundt 200 mikrometer tykkelse er gjennomførbart for patch clamp studier.
- Plasser en plast dekkglass med fett skinner i slicing kammeret. Overføre en retinal skive på toppen av fett skinner på en plast dekkglass. Rotere skive 90 °, slik at den tverrgående delen er synlig. Trykk på filtermembranen ned på dekkglass, og deretter dekke sidene av filterpapir med fett.
- Etter stykket er immobilisert på en plast dekkglass, ta tak i dekkglass og overføre den til en 35 mm plast tallerken. Helle kaldt dissekere løsning på retinal forberedelse og senk forberedelse. Lagre hver rett i den mørke boksen, som bør være kontinuerlig oksygenrikt.
MERK: Hele prosedyren må gjøres forsiktig slik at filteret membranen ikke er deformert. Ellers, retinal skive lett løsner fra filtermembranen.
- Etter stykket er immobilisert på en plast dekkglass, ta tak i dekkglass og overføre den til en 35 mm plast tallerken. Helle kaldt dissekere løsning på retinal forberedelse og senk forberedelse. Lagre hver rett i den mørke boksen, som bør være kontinuerlig oksygenrikt.
- Innspilling forberedelse:
- Prime perfusjon rør med Ames 'medium. Tillate alle boblene å passere gjennom når du fyller slangen.
- Gjør patch clamp opptak pipetter med en avtrekker. For å fylle en pipette med pipetten løsning, dukkert i baksiden av en pipette for 1 min før pipettespissen er backfilled. Deretter fylle ~ 1/3 av pipetten ved hjelp av en mikro-pipette filler. Lagre hvert pipette i et fuktig pipette boks.
- Skru på utstyret for patch clamp opptak; inkludert datamaskinen, forsterker, CCD-kamera, og mikroskop.
- Steng av lyset i rommet. Plasser en retinal skive forberedelse på mikroskop scenen kammeret ved hjelp av en infrarød seer. Etter at den er immobilisert, begynner kontinuerlig perfusjon. Still perfusjon temperaturen ved 33 til 37 ° C.
- Vis stykket underlag med CCD-kamera. Fokusere på målet stedet der målet cell typer bor. Velg en sunn celle for patch clamp opptak (dvs., bør den ha glatt utseende overflate og en god cellen form).
- Plasser en innspilling pipette i en pipette holder. Advance pipetten til stykket forberedelse. Når det er nær stykket preparat (~ 2 mm over), finner spissen av pipetten med mikroskopet. Når pipettespissen er synlig under mikroskop, flytte spissen ned mot målet celle.
- Sett forsterkeren. Juster pipetten ved 0 mV / 0 pA (nullstilling) og starte en kontinuerlig elektrisk puls av ~ 5 mV på ~ 10 Hz. Sjekk pipetten motstand; ideell motstand er mellom 5 og 10 Megohm for de fleste netthinnens nerveceller.
- Begynne å blåse ut fra spissen. Bruke et munnstykke, eller bruk en sprøyte, for å søke positivt trykk når pipetten dips i badekaret løsning. Kontinuerlig blåse ut den indre løsning inntil spissen er på overflaten av målcellen.
- Når det positive trykket gjør et lite smilehull på the celleoverflaten, fremme spissen litt og slutte å blåse ut. Sjekk pipetten motstand, noe som bør øke. Hvis det er stadig økende, la det og overvåke motstand til den når> 1 GΩ (gigaseal). Hvis motstanden ikke spontant øke, forsiktig bruke undertrykk før det blir en gigaseal.
- Etter gigaseal er oppnådd, endre holde potensial til -70 mV. Deretter midlertidig gjelde undertrykk til å sprekke membranen inne pipettespissen. Når hele cellekonfigurasjonen er gjort, kan pipetten motstanden være mellom 500 Megohm og en GΩ, og kapasitiv strøm er sett. Noen ganger spontane postsynaptiske strømninger kan observeres.
- Noter IV forholdet -80 til 40 mV. Forskjellige typer av spenningsstyrte kanaler blir aktivert avhengig av celletypen.
- Rekord lys-fremkalt synaptiske strøm og spenning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En representativ skive fremstilling er vist i figur 1. Den skive preparatet er i en rett stilling, og viser fotoreseptorer til ganglion-celler i en plan flate, og ingen løsgjøring fra filterpapiret. Dersom et stykke på skrå, bare en del av fremstillingen er i fokus, hvilket gjør det vanskelig å identifisere en egnet celle for patch klem. For opptak, er det viktig å velge et godt soma, som vanligvis har en blank overflate, en jevn rund form, og ingen synlige mørke plaques. Etter at hele cellekonfigurasjonen ble gjort, ble stykket utsettes for lys bakgrunn, og deretter til et trinn-lys (figur 2). Lys-fremkalt eksitatoriske postsynaptiske potensialer (L-EPSP) ble fremkalt som svar på en step-lys (timing er vist i gult). Toppamplituden og nedbrytningstiden varieres avhengig av celletype og subtype. En ganglion celle generert aksjonspotensialer som svar på lyse stimuli (Figur 2 D & E). Cell type og dens morfologiske subtype ble avslørt av sulforhodamin merking etter fysiologiske opptak (figur 2, ikke sant).
Figur 1. Retinale slice preparater. (A) En retinal skive forberedelse sett på med en 10X objektiv. En retinal skive preparat (øverst) ble festet til et stykke filterpapir (nederst). (B) En fire-image samling som viser en retinal skive forberedelse sett på med en 60X objektiv. Hver celle laget er klart observert (onl: ytre kjernefysisk lag, OPL: ytre plexiform lag, INL: indre kjernefysisk lag, IPL: indre plexiform lag, GCL: ganglion celle laget) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Lys-fremkalt eksitatoriske postsynaptiske potensialer (L-EPSPS) fra netthinnens nerveceller. Step-lys fremkalt L-EPSP (til venstre). Lysintensiteten var 30-60% Weber kontrast. Bakgrunnslys tilpasning nivået var 4 x 10 4 fotoner / mikrometer 2 / sek. Sulforhodamin B ble injisert under patch clamp opptak å visualisere de registrerte nevroner (til høyre). Et opptak pipette var fortsatt festet til soma (A) L-EPSP og sulforhodamin flekker fra en PÅ kjegle bipolar celle. (B) OFF kjegle bipolar celle. (C) Amacrine celle. (D) PÅ ganglion celle. (E) AV ganglion celle. Skala bar indikerer 2 eller 5 mV som nevnt. Lys stimulering ble søkt om 1 sek. Klikk herfor å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (28-60 days old, male) | Jackson laboratory | C57BL/6J strain | |
| Ames' medium powder | Sigma | A1420 | excellent |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | excellent |
| Dissecting tool: forceps | Dumont | #4, #5, #55 | excellent |
| Dissecting tool: scissors | Roboz | RS-5605 | excellent |
| Dissecting tool: surgery knife | Surgistar | 7514 | excellent |
| Razor blade (for chopper) | EMS | 71970 | excellent |
| Chopper | handmade | ||
| Infrared viewer | Night Owl Optics | NOBG1 | It shows bright view. Focusing small objects is an issue. |
| Puller | Sutter | P-1000 | excellent; makes consistent size pipettes. |
| Dark box | Pelican | dark box | excellent |
| Patch clamp system | Scientifica | slice scope 2000 | Excellent setup. Most key components are included in one package. Micromanipulators are excellent. |
| Amplifier | Molecular Devices | multiclamp 700B | Excellent and easy control. |
| Acquiring software | Molecular Devices | pClamp software | Excellent and easy control. |
| Light source (LED) | Cool LED | pE-2 4 channel system | Excellent |
| CCD camera | Q-imaging | Retiga 2000 | Excellent |
| Faraday cage | handmade |
References
- Werblin, F. S., Dowling, J. E. Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording. J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Lukasiewicz, P., Werblin, F. A slowly inactivating potassium current truncates spike activity in ganglion cells of the tiger salamander retina. J Neurosci. 8 (12), 4470-4481 (1988).
- Kaneko, A., Tachibana, M. Effects of L-glutamate on the anomalous rectifier potassium current in horizontal cells of Carassius auratus retina. J Physiol. 358, 169-182 (1985).
- Kamermans, M., Werblin, F. GABA-mediated positive autofeedback loop controls horizontal cell kinetics in tiger salamander retina. J Neurosci. 12 (7), 2451-2463 (1992).
- Cook, P. B., McReynolds, J. S. Lateral inhibition in the inner retina is important for spatial tuning of ganglion cells. Nat Neurosci. 1 (8), 714-719 (1998).
- Pang, J. J., Gao, F., Wu , J. S. Light-evoked current responses in rod bipolar cells, cone depolarizing bipolar cells and AII amacrine cells in dark-adapted mouse retina. J Physiol. 558 (Pt. 558 (Pt 3), 897-912 (2004).
- Euler, T., Masland , R. H. Light-evoked responses of bipolar cells in a mammalian retina). J Neurophysiol. 83 (4), 1817-1829 (2000).
- Berntson, A., Taylor , W. R. Response characteristics and receptive field widths of on-bipolar cells in the mouse retina. J Physiol. 524 Pt. 524 (Pt 3), 879-889 (2000).
- Sterling, P., Smith, R. G. Design for a binary synapse. Neuron. 41 (3), 313-315 (2004).
- Borghuis, B. G., Marvin, J. S., Looger, L. L., Demb, J. B. Two-photon imaging of nonlinear glutamate release dynamics at bipolar cell synapses in the mouse retina. J Neurosci. 33 (27), 10972-10985 (2013).
- Dowling, J. E., Sidman, R. L. Inherited retinal dystrophy in the rat. J Cell Biol. 14, 73-109 (1962).
- Eggers, E. D., Lukasiewicz, P. D. GABA(A), GABA(C) and glycine receptor-mediated inhibition differentially affects light-evoked signalling from mouse retinal rod bipolar cells. J Physiol. 572 (Pt 1), 215-225 (2006).
- Ichinose, T., Lukasiewicz, P. D. The mode of retinal presynaptic inhibition switches with light intensity). J Neurosci. 32 (13), 4360-4371 (2012).
- Ichinose, T., Fyk-Kolodziej, B., Cohn, J. Roles of ON cone bipolar cell subtypes in temporal coding in the mouse retina. J Neurosci. 34 (26), 8761-8771 (2014).
- Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
- Ames, A. 3rd, Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Haverkamp, S., et al. The primordial, blue-cone color system of the mouse retina. J Neurosci. 25 (22), 5438-5445 (2005).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
- Farre, C. G., M Bruggemann, A., Fertig, N. Ion channel screening - automated patch clamp on the rise. Drug discovery today. Technologies. 5 (1), e1-e34 (2008).
