Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Inspelning Ljus framkallade Postsynaptiska svar i nervceller i Dark-anpassade, mus näthinnan Slice Förberedelser Använda Patch Clamp Tekniker

Published: February 11, 2015 doi: 10.3791/52422

Abstract

Näthinnan är porten till det visuella systemet. För att förstå visuella mekanismer signalbehandling, vi undersöker retinala neurala nätverksfunktioner. Näthinnans nervceller i nätverket består av ett stort antal undertyper. Mer än 10 subtyper av bipolära celler, ganglieceller och amakrina celler har identifierats av morfologiska studier. Flera subtyper av näthinnans nervceller tros koda distinkta drag av visuell signalering, såsom rörelse och färg, och bildar flera nervbanor. Emellertid är de funktionella rollerna för varje neuron i visuell signalbehandling inte helt klarlagda. Plåstret clamp-metoden är användbar för att lösa detta grundläggande fråga. Här, till ett protokoll registrera ljus framkallade synaptiska svar i mus näthinnans nervceller med patch clamp inspelningar i mörka anpassade villkor tillhandahålls. Musen ögon är mörka anpassade O / N och retinala slice förberedelser dissekeras i ett mörkt rum med hjälp av infraröd belysning och tittare. Infrarött ljus inteaktivera mus fotoreceptorer och därmed bevarar deras ljus lyhördhet. Patch klämma används för att registrera ljus framkallade svar i näthinnans nervceller. En fluorescerande färgämne injiceras under inspelningarna att karakterisera neuronala morfologiska subtyper. Detta förfarande gör det möjligt för oss att bestämma de fysiologiska funktionerna hos varje neuron i mus näthinnan.

Protocol

Etik Uttalande: Rutiner som involverar djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Wayne State University.

1. Beredning av experimentell lösning

  1. Förbered dissekera lösningen 1 dag till 1 vecka innan själva experimentet. Använd en HEPES buffertlösning för retinal dissektion på grund av dess starka buffrande förmåga vid lägre temperaturer 16. Blanda alla kemikalier enligt följande (i mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl2, 1,0 MgCl2, 10 HEPES, 28 glukos. Justera pH till 7,4 med NaOH. Förvara lösningen i kylskåp fram till en vecka.
  2. Inspelningen lösningen är Ames 'medium, vilket är en konstgjord cerebrospinalvätska (aCSF) avsedd för retinala preparat 17. Genom dagen för experimentet, väg upp Ames 'pulver (4,4 g för 500 ml lösning) i ett rör. Också, väg upp NaHCOa 3 (0,95 g för 500 ml lösning) och blanda med Ames "pulver.
  3. Förbered den intracellulära pipett lösningen för patch clamp inspelningar från dagen för experimentet. Blanda alla kemikalier enligt följande (i mM): 111 K-glukonat, 1,0 CaCl2, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 10 NaCl, 1,0 MgCl2, 5 ATP-Mg och 1,0 GTP-Na. Justera pH till 7,2 med KOH. Filtrera pipetten lösningen med en konventionell sprutfilter. Gör ~ 500 l alikvoter och lagra dem i en frys eller en frys.

2. Förberedelse för Dag Experiment

  1. Kvällen innan experimentet, placera en mus i en bur (C57BL / 6J eller liknande bakgrund, 4-8 veckor gamla, hane) i ett mörkt utrymme för O / N mörk anpassning.
  2. Förberedelse för dissektion:
    1. Fyll dissekera lösning (100-200 ml) i en glasbägare, placera den på is, och bubbla med syre i minst 10 minuter.
    2. Starta syresättning av den mörka rutan för retinal beredning lagring.
    3. Förbered plasttäck med fett skenor för retinal slice förberedelser och placera en av dem i en 35 mm plastskål.
    4. Bifoga ett nytt rakblad till en chopper (vävnads skivare).
    5. Skär ett filtermembran i två halvor. Detta är för retinal skivning.
    6. Rikta in dissekera verktyg och överföringspipetter nära dissekera mikroskop. Arbetsområdet skall vara väl organiserad så att varje verktyg kan lätt nås i mörker.
  3. Förberedelse för patch clamp inspelningar:
    1. Lös Ames 'pulver och NaHCO 3 i destillerat vatten (Ames 4,4 g och NaHCO 3 0,95 g / 500 ml DDH 2 O). Bubble Ames 'medium med blandad syre (95% O2 och 5% CO2) i minst 30 minuter under upphettning till en inspelningstemperaturnivå (~ 35 ° C). Justera pH till 7,4 med NaHCOs 3 samtidigt bubblar.
    2. Tina interna pipett lösningen under dissekering. Efter det tinas, till 0,01% sulforodamin B för intracellulär färgning.

3. Retinal Dissection

  1. I ett mörkt rum, avliva musen med hjälp av koldioxid och bilateral pneumothorax. Efter 2-3 min av att använda koldioxid, kommer musen att förlora medvetandet.
  2. När musen inte längre svarar på en svans nypa, snabbt enucleate ögonen och placera dem i en kall dissekera lösning i en plastskål. Utför bilaterala Pneumothorax att säkerställa djurets död. Snabbt lagra ögat i skålen i mörkret rutan. Använd en infraröd betraktaren att genomföra förfarandet i mörkret.
    OBS: Alternativt, isofluran, halshuggning, eller cervikal dislokation kan användas för eutanasi. Metoden för dödshjälp bör följa riktlinjerna i National Institute of Health (NIH) och / eller Institutional Animal Care och användning kommittén.
  3. I ett mörkt rum, justerar dissekera mikroskop och infraröd belysning. Under mikroskop, överföra ett öga från sin skål i en 10 cm plastskål wed den kylda dissekera lösningen. Kontinuerligt bubbla syre genom slangen placerad på botten av plastskål. Justera flödesvolymen så det är inte för lågt, men se till att det inte är tillräckligt hög för att störa dissekering.
  4. Hornhinnan och linsen borttagning:
    1. Gör ett snitt på toppen av hornhinnan med en mikrokirurgisk kniv. Håll synnerven vid den andra änden av ögongloben förhindrar ögat från att röra sig. Förläng snittet med användning av ett par av kirurgiska saxar. Klipp ut hornhinnan med lite sklera runt den.
    2. Ta objektivet med en fin pincett och dra långsamt ut objektivet. Om glaskroppen är för klibbigt att ta bort objektivet, skär glaskroppen med en sax.
    3. När ögonkoppen görs, försiktigt hälla kallt, syresatt dissekera lösningen i ögonmusslan med en liten överföringspipett.
      OBS: Den ögonglob töms snabbt efter ett snitt görs i hornhinnan. Det är viktigt att bibehålla formen på ögat som deformerar ögat under denna proförfarande skadar näthinnan och orsaka näthinneavlossning.
  5. Identifiera de dorsala och ventrala sidor av näthinnan:
    OBS: På grund av ojämn fördelning av den gröna och ultraviolett (UV) kottar 18, identifiera en specifik retinal område är viktigt för lätta svars inspelningar.
    1. Identifiera den linje som går tvärs över retinal ögonkoppen passerar nära papillen. Denna linje passerar mestadels över ventrala sidan av synnerven; den sida inklusive synnerven är ryggsidan, medan den andra är ventrala 19. Se denna milstolpe tydligt i infrarött tittare.
    2. Beroende på syftet med experimentet, gör ett snitt på onödig sida. Detta kommer att vara användbart efter isolering av näthinnan från ögonkoppen.
  6. Vitreous borttagning:
    1. Eventuellt inkubera ögat-koppen med hyaluronidas (0,5 mg / ml) under 15 min.
    2. Ta bort glaskroppen med extra fin pincett. Glaskroppen är huvudsakligenfäst till botten och den yttre kanten av ögat-koppen. Försiktigt bort det utan att röra eller peta näthinnan. Som glaskroppen kan vara tätt knuten till ögonmusslan, ta bort försiktigt för att undvika näthinneavlossning från ögat-cup. Fortsätt att dra tills ingen spänning känns.
      OBS: Detta steg är särskilt viktigt för att dissekera musen näthinnan; Det är dock inte ett problem för de näthinnor av andra arter såsom råtta eller salamandern.
  7. Isolera näthinnan från ögat-cup. Ta sklera och försiktigt dra av näthinnan med hjälp av baksidan av pincett.
    OBS: Hela-mount retinala preparat kan göras från den isolerade näthinnan. Gör tre till fyra skär i kanterna och platta näthinnan, eller skär näthinnan i flera bitar.
  8. Trimma näthinnan och kassera onödiga halvan av näthinnan (steg 3,5). I samma plastskål, skär resterande näthinnan i två delar. För varje del av näthinnan, avskurna kanterna för att göra enretinal platta, och trimma hopfällbara kanterna.
  9. Överför en retinal platta på en glasplatta med användning av en stor överföringspipett (~ 2 ml). Sug upp överskottslösningen med en liten pipett, använd en bit filterpapper för att platta till platta, och sedan snabbt placera en bit av filtermembranet ovanpå vävnaden.
    1. Med hjälp av en liten överföringspipett, placera en droppe av dissekera lösningen på filtermembranet. Vänta ~ 15 sek tills lösningen sprider sig över membranet. Under denna tid kommer den näthinnevävnad fastnar på filtermembranet.
    2. Häll mer kall dissekera lösning under och runt filtret. Den näthinnevävnad med filtermembranet flyter. Ta filtermembranet med en pincett och placera den i skivkammaren. Häll dissekera lösning över vävnaden, och förvara preparatet i mörkret rutan.
      OBS: Det förfarande som beskrivs här är kritisk. Det är viktigt att utföra dessa steg snabbt för att säkerställa att de retinala vävnads fastnar filter memBrane och inte torkar ut.
  10. Med hjälp av en helikopter, skära näthinnevävnad i skivor. Omkring 200 ìm tjocklek är möjligt för patch clamp studier.
  11. Placera en plast täck med fett skenor i skivkammaren. Överför en retinal skiva ovanpå fettskenorna på en plasttäckglas. Rotera skiva 90 °, så att den tvärgående sektionen är synlig. Tryck filtermembranet ned på täckglas, sedan, täcka de sidor av filterpapper med fett.
    1. Efter segmentet immobiliseras på en plasttäck, greppa täckglas och överföra den till en 35 mm plastskål. Häll kallt dissekera lösningen på näthinnan förberedelse och dränka beredningen. Förvara varje maträtt i mörkret rutan, vilket bör kontinuerligt syresatt.
      OBS: Hela proceduren måste göras noggrant så att filtermembranet inte deformeras. Annars den retinala slice separerar lätt från filtermembranet.

  1. Inspelning preparatet:
    1. Prime perfusion rören med Ames 'medium. Tillåt alla bubblor för att passera igenom när du fyller slangen.
    2. Gör patch clamp inspelning pipetter med en avdragare. Att fylla en pipett med pipetten lösningen, dopp i baksidan av en pipett för 1 min tills pipettspetsen återfylls. Därefter fyller ~ 1/3 av pipetten med hjälp av en mikro-pipett filler. Förvara varje pipett i en fuktig pipett låda.
    3. Slå på utrustning för patch clamp inspelningar; inklusive dator, förstärkare, CCD-kamera, och mikroskop.
  2. Stäng av rumsbelysning. Placera en retinal skiva beredning på mikroskop scenen kammare med en infraröd betraktaren. Efter att det har immobiliserats, börjar kontinuerlig perfusion. Ställ perfusionen temperaturen vid 33 till 37 ° C.
  3. Visa segmentet ytan med CCD-kamera. Fokus på målplatsen där målet cell typer bosatta. Välj ett fräschare cell för patch clamp inspelning (dvs, bör den ha släta utseende yta och en god cellform).
  4. Placera en inspelning pipett i en pipett hållare. Advance pipetten till skiva beredning. När det är nära till beredningen slice (~ 2 mm ovanför), hitta spetsen på pipetten med mikroskopet. När pipettspetsen är synlig under mikroskopet, flytta toppen nedåt mot målcellen.
  5. Ställ förstärkaren. Justera pipetten vid 0 mV / 0 pA (nollställning) och starta en kontinuerlig elektrisk puls på ~ 5 mV vid ~ 10 Hz. Kontrollera pipetten motståndet; ideal motstånd är mellan 5 och 10 Mohm för de flesta näthinnans nervceller.
  6. Börja blåser ut från spetsen. Använd ett munstycke, eller använda en spruta, för att tillämpa positivt tryck när pipetten doppar in i badlösningen. Kontinuerligt blåsa ut den inre lösningen tills spetsen befinner sig på ytan av målcellen.
    1. När det positiva trycket gör en liten grop på the cellytan, avancera spetsen något och sluta blåsa ut. Kontrollera pipetten motståndet, vilket bör öka. Om det ökar hela tiden, lämna det och övervaka motståndet tills den når> 1 GΩ (gigatätning). Om motståndet inte spontant ökar försiktigt tillämpa undertryck tills det blir en gigatätning.
  7. Efter gigatätning uppnås, ändra innehavet potential att -70 mV. Sedan, intermittent tillämpa undertryck att brista membranet inuti pipettspetsen. När konfigurationen helcell-görs, kan pipetten motståndet vara mellan 500 Mohm och en GΩ, och den kapacitiva strömmen ses. Ibland kan observeras spontana postsynaptiska strömmar.
  8. Anteckna IV förhållande från -80 till +40 mV. Olika typer av spänningskänsliga kanaler aktiveras beroende på celltypen.
  9. Record ljus framkallade synaptiska strömmar eller spänningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En representativ skiva beredning visas i figur 1. Den skiva beredning är i en rak position, som visar fotoreceptorer till ganglieceller i en plan yta, och ingen lösgörande från filterpapper. Om en skiva lutas, är bara en del av förberedelserna i fokus, vilket gör det svårt att identifiera en lämplig cell för patch fastspänning. För inspelningar, är det viktigt att välja en bra soma, som vanligtvis har en blank yta, en jämn rund form, och inga synliga mörka plack. Efter hela cellkonfigurationen gjordes, var segmentet exponeras för bakgrundsljus och sedan till en steg-ljus (Figur 2). Ljus framkallade excitatoriska postsynaptiska potentialer (L-EPSP) var framkallade som svar på en steg-ljus (timing visas i gult). Toppamplituden och avklingningstiden varieras beroende på celltyp och subtyp. En gangliecell genererade aktionspotentialer som svar på ljusa stimuli (Figur 2 D & E). Den cell typ och dess morfologiska subtyp avslöjades av sulforodamin märkning efter fysiologiska inspelningar (Figur 2, höger).

Figur 1
Figur 1. näthinnan Slice preparat. (A) En retinal slice förberedelse ses med en 10X objektiv. En retinal beredning slice (överst) fästes till en bit filterpapper (nederst). (B) En fyra-bild sammanställning visar en retinal skiva beredning ses med en 60X objektiv. Varje cellskiktet är tydligt observeras (ENDA: yttre kärnlagret, OPL: yttre plexiform lagret, INL: inre nukleära lagret, IPL: inre plexiform lagret, GCL: ganglion cellager) Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 2. Ljus framkallade excitatoriska postsynaptiska potentialer (L-EPSPS) från näthinnans nervceller. Steg-ljus framkallad L-EPSP (vänster). Ljusintensiteten var 30 - 60% Weber kontrast. Bakgrund ljusanpassning nivån var 4 x 10 4 fotoner / um 2 / sek. Sulforhodamine B injicerades under patch clamp inspelning för att visualisera de inspelade nervceller (höger). En inspelning pipett fortfarande fäst vid soma (A) L-EPSP och sulforodamin färgning från en ON kon bipolär cell. (B) OFF kon bipolär cell. (C) amakrina cell. (D) på gangliecell. (E) FRÅN gangliecell. Skala stapel anger två eller 5 mV som noterats. Ljus stimulering applicerades under 1 sek. Klicka härför en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice (28-60 days old, male) Jackson laboratory C57BL/6J strain
Ames' medium powder Sigma A1420 excellent
Stereo microscope Nikon SMZ745 excellent
Dissecting tool: forceps Dumont #4, #5, #55 excellent
Dissecting tool: scissors Roboz RS-5605 excellent
Dissecting tool: surgery knife Surgistar 7514 excellent
Razor blade (for chopper) EMS 71970 excellent
Chopper handmade
Infrared viewer Night Owl Optics NOBG1 It shows bright view. Focusing small objects is an issue.
Puller Sutter P-1000 excellent; makes consistent size pipettes.
Dark box Pelican dark box excellent
Patch clamp system Scientifica slice scope 2000 Excellent setup. Most key components are included in one package. Micromanipulators are excellent.
Amplifier Molecular Devices multiclamp 700B Excellent and easy control.
Acquiring software Molecular Devices pClamp software Excellent and easy control.
Light source (LED) Cool LED pE-2 4 channel system Excellent
CCD camera Q-imaging Retiga 2000 Excellent
Faraday cage handmade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Werblin, F. S., Dowling, J. E. Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording. J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).
  2. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  3. Lukasiewicz, P., Werblin, F. A slowly inactivating potassium current truncates spike activity in ganglion cells of the tiger salamander retina. J Neurosci. 8 (12), 4470-4481 (1988).
  4. Kaneko, A., Tachibana, M. Effects of L-glutamate on the anomalous rectifier potassium current in horizontal cells of Carassius auratus retina. J Physiol. 358, 169-182 (1985).
  5. Kamermans, M., Werblin, F. GABA-mediated positive autofeedback loop controls horizontal cell kinetics in tiger salamander retina. J Neurosci. 12 (7), 2451-2463 (1992).
  6. Cook, P. B., McReynolds, J. S. Lateral inhibition in the inner retina is important for spatial tuning of ganglion cells. Nat Neurosci. 1 (8), 714-719 (1998).
  7. Pang, J. J., Gao, F., Wu , J. S. Light-evoked current responses in rod bipolar cells, cone depolarizing bipolar cells and AII amacrine cells in dark-adapted mouse retina. J Physiol. 558 (Pt. 558 (Pt 3), 897-912 (2004).
  8. Euler, T., Masland , R. H. Light-evoked responses of bipolar cells in a mammalian retina). J Neurophysiol. 83 (4), 1817-1829 (2000).
  9. Berntson, A., Taylor , W. R. Response characteristics and receptive field widths of on-bipolar cells in the mouse retina. J Physiol. 524 Pt. 524 (Pt 3), 879-889 (2000).
  10. Sterling, P., Smith, R. G. Design for a binary synapse. Neuron. 41 (3), 313-315 (2004).
  11. Borghuis, B. G., Marvin, J. S., Looger, L. L., Demb, J. B. Two-photon imaging of nonlinear glutamate release dynamics at bipolar cell synapses in the mouse retina. J Neurosci. 33 (27), 10972-10985 (2013).
  12. Dowling, J. E., Sidman, R. L. Inherited retinal dystrophy in the rat. J Cell Biol. 14, 73-109 (1962).
  13. Eggers, E. D., Lukasiewicz, P. D. GABA(A), GABA(C) and glycine receptor-mediated inhibition differentially affects light-evoked signalling from mouse retinal rod bipolar cells. J Physiol. 572 (Pt 1), 215-225 (2006).
  14. Ichinose, T., Lukasiewicz, P. D. The mode of retinal presynaptic inhibition switches with light intensity). J Neurosci. 32 (13), 4360-4371 (2012).
  15. Ichinose, T., Fyk-Kolodziej, B., Cohn, J. Roles of ON cone bipolar cell subtypes in temporal coding in the mouse retina. J Neurosci. 34 (26), 8761-8771 (2014).
  16. Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
  17. Ames, A. 3rd, Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
  18. Haverkamp, S., et al. The primordial, blue-cone color system of the mouse retina. J Neurosci. 25 (22), 5438-5445 (2005).
  19. Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
  20. Farre, C. G., M Bruggemann, A., Fertig, N. Ion channel screening - automated patch clamp on the rise. Drug discovery today. Technologies. 5 (1), e1-e34 (2008).

Tags

Neurovetenskap Retina Patch clamp inspelning lätta svar mus mörk anpassning infraröd
Inspelning Ljus framkallade Postsynaptiska svar i nervceller i Dark-anpassade, mus näthinnan Slice Förberedelser Använda Patch Clamp Tekniker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hellmer, C. B., Ichinose, T.More

Hellmer, C. B., Ichinose, T. Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques. J. Vis. Exp. (96), e52422, doi:10.3791/52422 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter