Summary
Her præsenterer vi en protokol til løbende kvantificere celleadhæsion og de-adhæsionsprocesser med høj tidsmæssig opløsning på en ikke-invasiv måde ved celle-substrat impedans og live cell imaging analyser. Disse metoder afslører dynamikken af celleadhæsion / de-adhæsionsprocesser udløst af matrix modifikation og deres tidsmæssige forhold til adhæsionsafhængige signal- begivenheder.
Abstract
Cell-matrix adhæsion spiller en vigtig rolle i kontrollen cellemorfologi og signalering. Stimuli, der forstyrrer celle-matrix adhæsion (f.eks myeloperoxidase og andre matrix-modificerende oxidanter / enzymer frigives under inflammation) er impliceret i at udløse patologiske ændringer i cellulær funktion, fænotype og levedygtigheden i en række sygdomme. Her beskriver vi, hvordan celle-substrat impedans og levende celle billedteknik kan let anvendes til nøjagtigt at kvantificere realtid ændringer i celleadhæsion og de-vedhæftning induceret af matrix modifikation (ved hjælp af endotelceller og myeloperoxidase som et patofysiologisk matrix-modificerende stimulus) med høj tidsmæssig opløsning og i en ikke-invasiv måde. Den xCELLigence celle-substrat impedans systemet kontinuerligt kvantificerer området celle-matrix adhæsion ved at måle den elektriske impedans ved celle-substrat-grænsefladen i celler dyrket på guld mikroelektrode arrays. Billedanalyse af time-lapse differenoplys- kontrast interferens film kvantificerer ændringer i det projicerede område af individuelle celler over tid, der repræsenterer ændringer i området cellematrixkonstruktion kontakt. Begge teknikker præcist tal på hurtige ændringer i cellulær adhæsion og de-adhæsionsprocesser. Cell-substrat impedans på mikroelektrode biosensor arrays giver en platform for robust, high-throughput målinger. Live-cell imaging analyser give yderligere detaljer vedrørende arten af og dynamikken i de morfologiske ændringer kvantificeret ved celle-substrat impedansmålinger. Disse komplementære metoder giver værdifuld ny indsigt i, hvordan myeloperoxidase-katalyseret oxidativ modifikation af subcellulære ekstracellulære matrixkomponenter udløser hurtige ændringer i celleadhæsion, morfologi og signalering i endotelceller. Disse metoder kan også anvendes til at studere cellulær adhæsion dynamik som svar på andre matrix-modificerende stimuli og i relaterede adhærerende celler (f.eks epitelceller).
Introduction
Stabile klæbende kontakt mellem celler og deres omgivende ekstracellulære matrix er nødvendige for vedligeholdelse af væv homeostase. For eksempel endotelcelleadhæsion til subendoteliale matrix i blodkar spiller en kritisk rolle i at opretholde integriteten af endothellaget og homeostatiske funktion som regulerende, semipermeabel vaskulære barriere 1. Aktincytoskelettet er mekanisk koblet til klæbende matrix-molekyler på steder med celle-matrix adhæsion og klæbende kontakter på celle-matrix-grænsefladen spille en vigtig rolle i bestemmelse af positionen af cellemembranen ved at modstå centralt rettede actomyosin trækkræfter. Ekstracellulære stimuli, der ændrer celle-matrix adhæsion nødvendigvis ændre magtbalancen på celle-matrix interface, en begivenhed, der er hurtigt "fornemmede 'ved mekanisk-sensitive signalproteiner, hvilket resulterer i transduktion af" outside-in signaler ". Denne krydstale between celler og deres omgivende ekstracellulære matrix spiller en central rolle i at kontrollere celle form, motilitet, funktion, spredning og overlevelse 2.
Diverse patofysiologiske processer (fosterudvikling, inflammation, sårheling og cancer metastase) er karakteriseret ved dynamiske omformning af klæbende matrix substrater ved matrix-nedbrydende oxidanter og / eller enzymer 3,4. For eksempel, klæbende subendotele matrixproteiner i blodkar (f.eks fibronectin) er impliceret som vigtige mål for modifikation eller nedbrydning i humane inflammatoriske sygdomme som følge af lokaliseret produktion af reaktive oxidanter (f.eks hypochlorsyrling, HOCl) af leukocytafledte enzym myeloperoxidase (MPO), der akkumuleres i subendotel under inflammatoriske vaskulær sygdom (figur 1) 5-9. Ændringer i celle-matrix adhæsion induceret af MPO-afledte oxidanter og andre matrix-modificerende stimuli er likely at spille vigtige roller i ændring vaskulær homeostase i en række patologiske processer, fx ved at ændre endotelcelle signalering, morfologi og levedygtighed, som igen forstyrrer endotelfunktion og barriere integritet. Imidlertid er de morfologiske og cellesignalering reaktioner adhærente celler til ekstracellulære matrix ændringer kun begynder at blive forstået.
For at forstå, hvordan matrix modifikationer drev ændringer i celleadhæsion dynamik og adhæsionsafhængige celle signalveje, er teknikker, der kræves der nøjagtigt kvantificere ændringer i celle-matrix adhæsion i realtid med høj tidsmæssig opløsning. Her beskriver vi komplementær celle-substrat impedans og levende celle billeddannende teknikker, som opfylder disse kriterier, og tilvejebringer en platform til at kvantificere celleadhæsion og de-adhæsionsprocesser i en ikke-invasiv måde.
Vi viser, hvordan disse celle-substrat impedans og live cell imaging hensigtsømhed kan let anvendes til (i) overvåge dynamikken i cellebinding og spredning (dvs. de novo celleadhæsion) på native og modificerede matrixsubstrater og (ii) til at måle dynamikken i celle-matrix løsrivelse (dvs. de-adhæsion ) af adhærente celler udsat for matrix-modificerende stimuli. Den xCELLigence celle-substrat impedans biosensor system giver en kontinuerlig måling af området med celle-matrix kontakt ved at kvantificere elektriske impedans på overfladen af 96 brønde guld mikroelektrode arrays og udtrykker disse elektriske impedansmålinger som »cell indeks, en dimensionsløs størrelse, som er stort set proportional med arealet af celle-substrat kontakt 10 (figur 2), samtidig med at være følsomme over for ændringer i den gennemsnitlige afstand mellem (isolerende) cellemembranen og elektroden overflade 11. En yderligere stigning i celle indeksværdier opnås også ved dannelse af en stram celle-celle-kontakter that begrænse paracellulære aktuelle strømme 11 betingelser, der ikke er fremherskende inden for de eksperimenter, der er beskrevet i denne undersøgelse. Måling af det projicerede areal af de enkelte celler over tid ved billedanalyse af time-lapse kontrast differential interferens (DIC) film giver en supplerende foranstaltning til ændringer inden for celle-substrat kontakt og giver yderligere oplysninger om den præcise karakter og dynamik i morfologiske ændringer kvantificeres ved celle-substrat impedans fremgangsmåde.
Specifikt beskriver vi anvendelsen af disse metoder til at overvåge, hvordan MPO-medieret oxidation af klæbende subendotel matrixproteiner (f.eks fibronectin) (I) reducerer de novo adhæsion af suspenderede endotelceller på oprenset fibronectin og (ii) udløser cellematrixkonstruktion de -adhesion i endotelceller med etableret vedhæftning på fibronectin. Ved at udføre parallel cellesignalering analyser over tid ved hjælp af relevant BiochemiCal assays (f.eks, Western blotting), de tidsmæssige og årsagssammenhængen mellem vedhæftning / de-adhæsionsprocesser og tilhørende ændringer i adhæsionsafhængige celle signalering begivenheder kan bestemmes.
Disse metoder blev for nylig anvendt til at vise, at ekstracellulær matrix oxidation katalyseres af subendotele aflejringer af MPO udløser en hurtig tab af celle-matrix adhæsion af endothelceller, som er drevet af allerede eksisterende actomyosin kontraktile kræfter 9. Vigtigt er det, ved at give den tidsmæssige sammenhæng mellem ændringer i både celleadhæsion og adhæsionsafhængige celle signalering, der skal fastlægges, disse tilgange identificeret at MPO-induceret matrixmodifikationen og cellulær de-adhæsion udløser ændringer i vigtige adhæsionsafhængige celle signalveje herunder Src kinase -afhængig paxillin phosphorylering og myosin let kæde II phosphorylering (figur 1) 9. Denne tilstand af redox-afhængig signalering, invOlving aktivering af intracellulære signaleringsbegivenheder af ekstracellulær oxidative reaktioner, som forstyrrer celle-matrix adhæsion, repræsenterer en ny tilstand af cellesignalering betegnet "outside-in redox signalering" (figur 1) 9.
Generelt bør disse supplerende celle-substrat impedans biosensor og levende celle billedteknik være værdifulde i at afsløre, hvordan forskellige matrix-modificerende stimuli eller agenter drive forandringer i celle adhæsion dynamik, morfologi og signaler inden for forskellige vedhængende celletyper underlagt en lang række eksperimentelle indstillinger.
Følgende protokol beskriver, hvordan at kvantificere effekten af MPO-medieret matrix oxidering på de novo endotelcelleadhæsion (forsøg 1) og endotelcelle de-vedhæftning (forsøg 2) processer. MPO binder ivrigt til fibronectin og andre adhæsive subendotele ekstracellulære matrixproteiner og oses hydrogenperoxid (H 2 O 2) til at konvertere chloridioner (Cl -) til det meget reaktive chloreringsmiddel oxidant chlorundersyrling (HOCI), der reagerer lokalt med disse matrixproteiner og forstyrrer deres celle klæbeegenskaber (figur 1) 8,9, 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generelt Endothelial Cell Culture
- Kultur okseaortaendotelceller (passager 4-9) på gelatineovertrukne vævskulturkolber (coat vævskultur overflade med 0,1% w / v gelatine i PBS ved stuetemperatur i 15 min) i EGM-2-medier (med EGM-2 bullet kit indeholdende 5% føtalt bovint serum, vækstfaktorer og alle kosttilskud leveret af producenten, undtagen for hydrocortison).
- Når celler er nær-sammenflydende (ca. 3 dage efter podning efter en 1: 4 split), høst celler ved behandling med 0,05% w / v trypsin / 0,02% w / v EDTA i PBS ved 37 ° C. Efter de fleste af cellerne er fritliggende, tilføje komplette EGM-2-medier for at standse trypsin og derefter centrifugeres (100 xg 5 min).
- Forbered celler til undersøgelser af de novo adhæsion af endothelceller til fibronectin (Eksperiment 1: Afsnit 2) og den efterfølgende de-adhæsion af endothelceller med etablerede vedhæftning på dette substrat (Eksperiment 2: Afsnit 3).
- Vask høstetceller én gang med serumfrit medium 199 indeholdende 1% vægt / vol bovint serumalbumin (BSA) og re-centrifuge (100 xg 5 min).
- Resuspender celler i serum-frit medium 199 indeholdende 1% vægt / volumen BSA ved 2,5 x 10 5 celler / ml (celle-substrat impedansmålinger) eller 5 x 10 5 celler / ml (Live cell imaging analyser) og holdes ved 37 ° C før brug.
BEMÆRK: vedhæftningen reaktioner celler er meget følsomme over for temperaturforskelle (f.eks på grund af konvektion effekter), så alt udstyr og løsninger anvendes til at håndtere og behandle celler i løbet af de følgende protokoller skal opbevares ved en konstant temperatur på 37 ° C.
2. Forsøg 1: Kvantificering De Novo endotelcelleadhæsion på Native og MPO-oxideret Fibronectin (Cell-substrat impedans)
BEMÆRK: Eksperiment 1 undersøger hvilken grad MPO-medieret oxidation af fibronectin forringer dets evne til at understøtte de novo
- Coat fibronectin på 96-brønds guld celle-substrat-impedans mikroelektrode arrays. Tilsættes 80 pl / brønd af oprenset bovin fibronectin ved 5 ug / ml i PBS, inkuberes i 2 timer ved 37 ° C og fjerne opløsningen.
- Inkuber fibronectin-overtrukne overflader med MPO at tillade binding af MPO til overfladen bundet fibronectin. Tilsættes 80 gl / brønd af oprenset human neutrofil MPO ved 20 nM i Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) og inkuberes i 0,5 timer ved 37 ° C.
- Wash overflader to gange med HBSS til fjernelse af eventuelt ubundet MPO.
- Tilføj H 2 O 2 (0-10 uM slutkoncentration) til brønde i mikroelektrode-array plade indeholdende 80 pl / brønd HBSS at indlede MPO-katalyseret, HOCI-afhængig fibronectin oxidation og inkuberes i yderligere 0,5 timer ved 37 ° C.
- For at undersøge effekten af de relevante inhibitorer eller modulatorer af MPO-katalyserede reaktioner (f.eks alternativ MPO enzymsubstrater, enzyminhibitorer eller antioxidanter; se 9 for detaljer), tilføje disse til HBSS umiddelbart forud for H 2 O 2 tilsætning.
- Efter 0,5 timer, behandle overflader med methionin at slukke resterende overfladeaktive bundet oxiderende arter dvs reaktive protein-bundne chloraminer, som kan udøve confounding cellulære aktiviteter. Tilsæt 10 mM methionin i 80 pi HBSS per brønd og inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C.
- Block overflader med BSA. Tilsættes 80 pl / brønd af BSA ved 0,2% vægt / volumen i PBS, inkuberes i 2 timer ved 37 ° C og fjerne opløsningen.
BEMÆRK: Residual uovertrukne overfladeområder vil støtte celleadhæsion og blokere disse med et ikke-klæbende protein (dvs. BSA) sikrer, at cellulær adhæsion responser strengt afhænge oprensede celle-klæbende matrix anvendes, i dette tilfælde fibronectin. - Wash overflader to gange med HBSS.
BEMÆRK: Ingen af de foregående overfladebehandlinger mærkbart påvirker celle-substrat readings. - Seed suspenderede endotelceller (tilføj 200 pi / brønd ved ca. 2,5 x 10 5 celler / ml, fremstillet i serumfrit Medium 199 indeholdende 1% BSA, se 1.3) på native eller MPO-oxiderede fibronectin overtrukne overflader.
- Umiddelbart efter podning celler (dvs. forud for enhver cellebinding og spredning), montere mikroelektrode matrix plade på inkubatoren port (anbragt i en 37 ° C inkubator i nærvær af 5% CO 2).
- Brug af instrumentet software straks en "blank" læsning at normalisere efterfølgende celle-substrat impedans (»cell indeks") værdier til de oprindelige baggrundsværdier opnået i fravær af celle-vedhæftning.
- Indled erhvervelse af kontinuerlige celle indeksdata (minimum af én celle indeks læsning / min).
- Cellerne inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 2 timer, en periode, hvor maksimal cellebinding og spredning opnås; dette afspejles veden plateauing af celle indeksværdier (se figur 3A).
BEMÆRK: foregående eksperiment (Eksperiment 1) undersøger, hvordan oprindelige MPO-medieret oxidation af fibronectin begrænser muligheden af endotelceller at indføre celleadhæsion på dette substrat. Følgende forsøg (forsøg 2) undersøger, hvordan MPO-medieret fibronectin oxidation fremmer fald i celle-matrix adhæsion (dvs. de-vedhæftning) i endotelceller med etableret vedhæftning på dette substrat. Behandlingerne i disse to eksperimenter er i det væsentlige identiske, bortset fra tidspunktet for MPO-medieret fibronectin oxidation (dvs. før celleadhæsion - Experiment 1; efter celleadhæsion - Experiment 2).
3. Forsøg 2: Kvantificering Endotel Cell De-vedhæftning fra Fibronectin i Reaktion på MPO-medieret Fibronektin Oxidation (Cell-substrat Impedans og levende celler Imaging)
- Coat fibronectin på 96 brønde guld mikroelektrode enrrays for celle-substrat impedansmålinger (add 80 ul / brønd af fibronectin ved 5 ug / ml i PBS og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C) eller 35 mm glas-bund cellekulturskåle for levende cell imaging analyser (tilsættes 2 ml / skål af fibronectin ved 5 ug / ml i PBS og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C).
- Block overflader med BSA. Tilføj BSA ved 0,2% vægt / volumen i PBS ved de angivne i 3,1 volumen og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C.
- Inkuber overflader med MPO at tillade binding af MPO til fibronectin. Tilsæt 20 nM oprenset human MPO i HBSS ved de angivne i 3,1 volumen og inkuberes i 0,5 timer ved 37 ° C.
- Wash overflader to gange med HBSS til fjernelse af eventuelt ubundet MPO.
- Seed suspenderede endotelceller (fremstillet i serumfrit Medium 199 indeholdende 1% w / v BSA, se 1.3) på de native eller MPO-bærende fibronectin overtrukne overflader.
- Tilsæt 200 gl / brønd på 2,5 x 10 5 celler / ml til 96 såvel celle-substrat-impedans mikroelektrode arrays. <li> Tilføj 2 ml / skål på 5 x 10 5 celler / ml til 35 mm glas bund cellekultur retter.
- Mount 96 brønde mikroelektrode array-plader over på celle-substrat impedans inkubator port (til huse i en 37 ° C inkubator i nærværelse af 5% CO2) og tage »tomme« aflæsninger at iværksætte løbende erhvervelse af celle indeksdata (jf afsnit 2.10 ).
- Transfer 35 mm glas bund cellekulturskåle til en 37 ° C inkubator i nærvær af 5% CO 2.
BEMÆRK: HBSS anvendes, når man studerer MPO-katalyserede oxidative reaktioner i stedet for fuldstændig dyrkningsmedier som sidstnævnte indeholder oxiderbare arter, der interfererer med oxidationsreaktioner.
BEMÆRK: Efter 0,5 timer ligevægt i HBSS, celle indeksværdier stabilisere sig på lidt lavere værdier; når præ-inkubering celler med enzymsubstrater, enzym og celle signalering inhibitorer eller antioxidanter, først sikre, at these ikke væsentligt påvirker værdierne opnået efter ligevægt.
- For celle impedans undersøgelser med anvendelse 96 og mikroelektrode array-plader:
- Fjern mikroelektroden vifte plade fra inkubatoren og pause celle indeks målinger.
- Tilføj H 2 O 2 (slutkoncentration på 0-10 uM) til HBSS og bland forsigtigt ved gentagen pipettering.
- Straks, genmontere mikroelektroden vifte tilbage på 37 ° C inkubator port og re-påbegynde erhvervelsen af celle indeks aflæsninger.
- For levende celle billeddiagnostiske undersøgelser med anvendelse 35 mm glas bund cellekultur fad:
- Fjern dyrkningsskålen fra inkubatoren og montere på et 37 ° C opvarmet fase af en omvendt konfokalt mikroskop udstyret med en 63X vand objektiv med egnede DIC optik til optagelse af levende celler film.
- Fokus på celler ogoptimere DIC optik (Köhler belysning, partiskhed retardering og kamera offset / forstærkning; Yderligere oplysninger findes 13).
- Indled DIC film og registrere baseline læsninger af ubehandlede celler i 1 min.
- Tilføj H 2 O 2 (slutkoncentration på 0-10 um) og bland forsigtigt ved gentagen pipettering. Re-fokus mikroskop (om nødvendigt) og fortsætte optagelsen DIC film af de behandlede celler for det nødvendige tidsrum.
4. Dataanalyse og præsentation
- Cell-substrat impedans data
- Eksport rådata (celle indeks versus tid) i et regneark.
- For celle de-vedhæftning undersøgelser (Eksperiment 2: Afsnit 3), normalisere data ved at sætte værdierne registreres umiddelbart forud for indledningen af MPO-medieret fibronectin oxidation til en værdi af 1 (dvs. umiddelbart før tilsætning af H 2 O 2 i 3.11 .1.1).
BEMÆRK: Dette sikrer, at den relativeændringer i celle indeksværdier fremkaldt af MPO-medieret fibronectin oxidation ikke maskeret af små indledende forskelle i absolutte celle indeksværdier mellem brønde.- Nuværende data som plots af normaliseret celle indeks (y-akse) versus tid (x-akse).
- Live-cell imaging data (celle de-vedhæftning studier i eksperiment 2: Afsnit 3)
- Åbn DIC levende celle imaging film optaget umiddelbart før og efter indledningen af MPO-medieret fibronectin oxidation i en standard billedanalyse program (f.eks ImageJ software).
- I mindst to separate DIC film tilfældigt vælge flere celler og måle deres projiceret areal på hinanden følgende rammer (fx ved 1 min interval) ved manuelt at spore deres membran kant og kvantificerer antallet af lukkede pixels.
- Eksport rådata (projiceret celleareal versus tid) til et Excel-regneark og normalisere celle arealoplysninger ved at sætte værdierne registreres umiddelbart førindledningen af MPO-medieret fibronectin oxidation til en værdi af 1 (dvs. umiddelbart før tilsætning af H 2 O 2 i 3.11.2.3).
- Nuværende data som et plot af normaliseret celle område (y-akse) versus tid (x-akse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Real-time kvantificering af endotelcelle de-vedhæftning fra fibronectin som reaktion på MPO-medieret fibronectin oxidation (forsøg 2). Udsåning af endotel cellesuspensioner på native (MPO gratis) fibronectin eller MPO-bærende fibronectin resulterer i maksimal cellebinding og spredning inden 2 timer som bedømt ved en plateauing celle indeksværdier i cellen substrat impedansmålinger (figur 3A). Denne indledende fase af cellebinding og spredning bliver markant reduceret, når MPO-medieret fibronectin oxidation er indledt før celle såning i eksperimenter udført ifølge protokollen beskrevet i forsøg 1 (data ikke vist; For nærmere oplysninger se 9). Når maksimal celleadhæsion er etableret på nativt eller MPO-bærende fibronectin, målrettet fibronectin oxidation medieret af MPO-katalyseret HOCI (initieres ved tilsætning af MPO co-substrat H 2 O 2) bevirker et hurtigt fald i suransigt område cellematrixkonstruktion kontakt målt ved celle-substrat impedans (figur 3A, B) og levende cell imaging (figur 3C, for en repræsentativ DIC film, se Movie 1, celle indeks eller celle området tab efter H 2 O 2 tilsætning er minimale i fravær af MPO 9). Mens celle indeks og celleareal ændringer under MPO-induceret de-vedhæftning var meget ens, de forholdsvis langsommere fald i celle indeksværdier kan afspejle de isolerende virkninger af cellemembran materialer i "cellefrie regioner på cellen periferien under de- adhæsion, som ikke er kvantificeret i det projicerede celle området målinger. Den hurtige cellulære de-adhæsion tilsyneladende i endotelceller er bundet til MPO-bærende fibronectin som svar på H 2 O 2 behandling er fraværende i celler behandlet med H 2 O 2 alene (dvs. celler, som ikke indeholder MPO) (figur 3A) og blokeres by MPO enzymhæmmere eller HOCI skraldemanden (data ikke vist, se 9 for detaljer), identificere, at denne proces er afhængig af MPO-katalyseret produktion af HOCI (jf figur 1). Hæmning af myosin II motorisk funktion med Blebbistatin hæmmer hastigheden af endothelcelle de-adhæsion målt ved celle-substrat impedans (figur 3B) og levende cell imaging (figur 3C, Movie 2), identificere, at cellulær de-vedhæftning og sammentrækning som svar til MPO-katalyseret subcellulære matrix oxidation drives af actomyosin trækkræfter 9.
Figur 1. MPO-medieret subcellulære matrix oxidation udløser cellematrixkonstruktion de-vedhæftning og cellesignalering. MPO udløser hurtige de-vedhæftning reaktioner og ændringer i adhæsionsafhængige signalering ved at mediere målrettet oxidation af klæbende subendotele matrixproteiner, der involverer følgende begivenheder 9: (A) MPO binder ivrigt til den subendoteliale matrix og bruger H 2 O 2 til at generere meget reaktive oxidant HOCI som reagerer lokalt med matrixproteiner (f.eks fibronectin) og forstyrrer deres celleadhæsive egenskaber. (B) Denne skade forstyrrer klæbende kontakter på celle-matrix-grænsefladen, hvilket fører til (C) membran tilbagetrækning drevet af enstemmigt spændinger i actincytoskelettet og forandring af adhæsionsafhængige celle signalveje (gengivet med tilladelse fra Rees et al. 9 ). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figure 2. Work-flow og princippet om celle-substrat impedans analyser at kvantificere endotelcelle de-adhæsion fra fibronectin som reaktion på MPO-medieret fibronectin oxidation (eksperiment 2). Cell indeksværdier målt ved celle-substrat microarray impedans biosensor systemet afspejle evne cellemembranen at begrænse feltinduceret ionstrømme ved elektroden overflade og er proportional med arealet af celle-substrat-kontakt 10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Real-time kvantificering af endotelcelle de-adhæsion fra fibronectin som reaktion på MPO-medieret fibronectin oxidation (eksperiment 2). Endotelcelle suspensioner (i serumfrit Medium 199 indeholdende 1%BSA) blev podet på nativt eller MPO-bærende fibronectin (fibronectin overtrukket på 5 g / ml, derefter inkuberet i fravær eller nærvær af 20 nM MPO) i 96 brønds mikroelektrode-arrays (celle-substrat impedansmålinger) eller 35 mm glas-bottom cellekultur retter (levende cell imaging analyser). Celler blev derefter inkuberet ved 37 ° C i 2 timer for at tillade maksimal cellebinding og spredning inden ækvilibrere celler med HBSS og indlede MPO-medieret fibronectin oxidation ved tilsætning af H 2 O 2 (10 uM) (tid af H 2 O 2 tilsætning sat til t = 0 min). (A) Fuldtid-forløb celle-substrat impedansmålinger før og efter behandling med H 2 O 2 i nærvær (+ MPO) og fravær (-MPO), i MPO. (B) Cell-substrat impedansmålinger og (C) celleareal målinger af live cell imaging analyser, efter behandling af MPO-holdige celler med H 2 O 2 i nærvær (+ Blebbistatin) og fravær (-blebbistatin) i myosin II-hæmmer Blebbistatin (40 uM). Cell indeks og celle i området værdier er normaliseret til værdier umiddelbart forud for det tidspunkt, H 2 O 2 tilføjelse, som blev givet en værdi på 1. Cell indeksdata repræsenterer middelværdien SEM, n = 6 gentagne målinger fra et repræsentativt eksperiment. Cell area værdier repræsenterer middelværdi ± SEM, n = 10 celler (2 replikate film, 5 tilfældigt udvalgte celler pr film: se film 1 og 2). (Figur 3B, 3C, Movie 1 og Movie 2 er gengivet med tilladelse fra Rees et al. 9). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Movie 1 . Time lapse DIC microscopy film af endotelceller klæbet på MPO-bærende fibronectin løbet 0 - 15 min efter udsættelse for H 2 O 2 (10 uM); 1 sek = 3 min.
Film 2 . Time lapse DIC mikroskopi film af endotelceller klæbet på MPO-bærende fibronectin i 0 - 15 minutter efter eksponering for H 2 O 2 (10 uM) i nærvær af Blebbistatin (40 uM); 1 sek = 3 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellematrixkonstruktion vedhæftning og de-adhæsionsprocesser kan kvantificeres præcist i realtid med høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af celle-substrat impedans og live cell imaging analyser. Disse realtid tilgange giver en stor fordel i forhold til end-point analyser af celleadhæsion, som giver dårlig tidsmæssig opløsning. Ved præcist at kvantificere hurtige de-vedhæftning reaktioner med høj tidsmæssig opløsning, kan disse analyser giver kritiske indsigt i, hvordan morfologiske reaktioner på matrix ændringer er reguleret og hvordan de påvirker adhæsionsafhængige celle signalering processer, målt parallelt ved hjælp af relevante biokemiske analyser (fx Western blotting).
I de seneste undersøgelser blev disse tilgange der anvendes til at afsløre en hidtil ukendt rolle for MPO-medieret oxidation af subendoteliale matrix i at udløse de-adhæsion af endothelceller og viste: (i) at antallet af de-adhæsion var kritisk afhængig af præ- eksisterende actomyosinkontraktilitet (jf figur 3B og 3C) og (ii) at tabet af celle-matrix adhæsion kørte ændringer i vigtige adhæsionsafhængige celle signalveje, herunder Src-afhængig paxillin phosphorylering og myosin let kæde II phosphorylering 9 (se figur 1). Disse data har stor betydning for forståelsen endotelfunktion og barriere integritet under inflammatoriske reaktioner, hvor subendoteliale ekstracellulære matrix er impliceret som en vigtig målsætning for oxidanter produceret af subendotele aflejringer af matrix-bundne MPO eller andre kilder til reaktive oxidanter 3,5-9, 14.
Brugen af et microarray-baseret, celle-substrat impedans biosensor system giver en platform for robuste, high-throughput celleadhæsions målinger. Hver brønd i 96-brønds celle-substrat-impedans mikroelektrode-arrays har potentiale til samtidigt at analysere 32 forskellige eksperimentelle betingelser (dvs. 3 brønde per betingelse). Men når man sammenligner små ændringer i celleadhæsion, bør anvendes mindst 4 eller flere brønde per eksperimentel betingelse. Under celle såning og efterfølgende celle behandlinger, bør man sørge for at holde alle løsninger ved 37 ° C og minimere den tid, det tager at behandle celler uden for 37 ° C inkubator miljø (dette undgår potentielle temperaturforskelle i hele mikroelektrode array, kan påvirke vedhæftning svar ). Især den elektriske strøm ved celle-substrat-grænsefladen er følsom for ionstyrken af cellesupernatanten 10: følgelig celler bør tillades at ækvilibrere efter tilføjelse af nye buffere / medier til opnåelse af en stabil celle indeks svar, før overvåge virkningerne af stimulus af interesse (se 3.10 og figur 3A). Fald i celle indeks kan ikke kun afspejler et fald i det gennemsnitlige areal af celle-matrix kontakt, men kan også afspejle et fald i antallet af vedhæftede celler. At diskrimineremellem disse muligheder, kan ændringer i antallet af vedhæftede celler på mikroelektrode arrays kvantificeres umiddelbart efter celle-substrat impedansmålinger af Crystal violet farvning denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at bekræfte, at MPO-medieret fibronectin oxidation udløser et hurtigt fald i det gennemsnitlige areal af celle-matrix kontakt, men ikke fremmer celle løsrivelse (for detaljer, se 9).
En begrænsning af cellen-substrat impedans teknik er, at det giver et gennemsnitligt mål for vedhæftning ændringer over alle celler til stede på mikroelektrode overflade, og det giver ikke oplysninger om den præcise karakter af friktion eller morfologiske ændringer på de enkelte celler. For at løse denne begrænsning, levende celle DIC mikroskopi og billedanalyse giver en supplerende foranstaltning af friktion ændringer og afslører morfologiske ændringer af de enkelte celler. Således aftager i celle indeks reaktion på MPO-medieret fibronectin oxidation meakost- ved celle-substrat impedans (figur 3A) korrelerer godt med fald i det projicerede areal af celler målt ved levende celler billedanalyse af DIC film (figur 3B). Vigtigere er det, DIC film viser, at enkelte celler, MPO-induceret de-adhæsion involverer hurtig tilbagetrækning af den perifere cellemembranen fra underlaget og tilstødende celler og i sidste ende resulterer i celler antager compact 'afrundet-up' morfologi, men uden resulterende i celle løsrivelse (Movie 1). Som med celle-substrat impedansmålinger, for at sikre reproducerbare cellulære responser, skal der drages omsorg for at opretholde opløsninger ved 37 ° C før brug på celler og en opvarmet mikroskop stadium (eller tilsvarende temperatur betjeningsanordning) skal anvendes i løbet af levende celler imaging optagelser.
De her beskrevne protokoller kan modificeres let ved at erstatte fibronectin med andre oprensede matrixsubstrater (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger at gøre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
References
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
- Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
- Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
- Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
- Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
- Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
- Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
- Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
- Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
- Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).
