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Bioengineering

मैट्रिक्स संशोधन द्वारा प्रेरित सेलुलर आसंजन और डी-आसंजन में वास्तविक समय परिवर्तन को मापने के लिए सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा और लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग

Published: February 19, 2015 doi: 10.3791/52423

Summary

यहाँ, हम लगातार सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा और लाइव सेल इमेजिंग विश्लेषण करती द्वारा एक गैर-आक्रामक ढंग से उच्च अस्थायी समाधान के साथ सेल आसंजन और डे-आसंजन प्रक्रियाओं यों के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इन तरीकों मैट्रिक्स संशोधन और आसंजन पर निर्भर संकेतन घटनाओं के लिए उनके अस्थायी रिश्ते से चालू होने वाले कोशिका आसंजन / डी आसंजन प्रक्रियाओं की गतिशीलता प्रकट करते हैं।

Abstract

सेल-मैट्रिक्स आसंजन सेल आकृति विज्ञान को नियंत्रित करने और संकेत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सेल-मैट्रिक्स आसंजन (जैसे, myeloperoxidase और अन्य मैट्रिक्स संशोधित oxidants / सूजन के दौरान जारी एंजाइमों) को बाधित उत्तेजनाओं कि रोगों की संख्या में सेलुलर समारोह, फेनोटाइप और व्यवहार्यता में रोग परिवर्तन ट्रिगर में फंसा रहे हैं। यहाँ, हम (एक pathophysiological मैट्रिक्स संशोधित प्रोत्साहन के रूप में endothelial कोशिकाओं और myeloperoxidase का उपयोग) सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा और लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण आसानी से सही रूप में कोशिका आसंजन और मैट्रिक्स संशोधन द्वारा प्रेरित डे-आसंजन में वास्तविक समय में परिवर्तन यों के लिए नियोजित किया जा सकता वर्णन कैसे उच्च अस्थायी समाधान के साथ और एक गैर-आक्रामक तरीके से। xCELLigence सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा प्रणाली लगातार सोने microelectrode सरणियों पर विकसित कोशिकाओं में कोशिका-सब्सट्रेट इंटरफेस में बिजली प्रतिबाधा को मापने के द्वारा कोशिका-मैट्रिक्स आसंजन के क्षेत्र quantifies। की छवि विश्लेषण समय व्यतीत एडवेंचर्सTiAl हस्तक्षेप विपरीत फिल्मों सेल-मैट्रिक्स संपर्क के क्षेत्र में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करने, समय के साथ व्यक्ति की कोशिकाओं की अनुमानित क्षेत्र में परिवर्तन quantifies। दोनों तकनीकों सही रूप में सेलुलर आसंजन और डे-आसंजन प्रक्रियाओं के लिए तेजी से बदलाव यों। Microelectrode biosensor सरणियों पर सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा मजबूत, उच्च throughput मापन के लिए एक मंच प्रदान करता है। लाइव सेल इमेजिंग सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा माप द्वारा मात्रा morphological परिवर्तन की प्रकृति और गतिशीलता के बारे में अतिरिक्त विस्तार प्रदान विश्लेषण करती है। इन पूरक दृष्टिकोण subcellular बाह्य मैट्रिक्स घटकों के myeloperoxidase उत्प्रेरित ऑक्सीडेटिव संशोधन तेजी से सेल आसंजन, आकृति विज्ञान में परिवर्तन और endothelial कोशिकाओं में संकेत चलाता है कि कैसे में बहुमूल्य नए अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। इन तरीकों को भी अन्य मैट्रिक्स संशोधित उत्तेजनाओं को और संबंधित पक्षपाती कोशिकाओं (जैसे, उपकला कोशिकाओं) में प्रतिक्रिया में सेलुलर आसंजन गतिशीलता के अध्ययन के लिए लागू कर रहे हैं।

Introduction

कोशिकाओं और उनके आसपास के बाह्य मैट्रिक्स के बीच स्थिर चिपकने वाला संपर्कों ऊतक homeostasis के रखरखाव के लिए आवश्यक हैं। उदाहरण के लिए, रक्त वाहिकाओं में subendothelial मैट्रिक्स को endothelial सेल आसंजन endothelial परत की अखंडता और एक नियामक, अर्द्ध पारगम्य संवहनी बाधा एक के रूप में अपनी समस्थिति समारोह को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। actin cytoskeleton यंत्रवत् केंद्रीय रूप से निर्देशित actomyosin तन्य बलों विरोध द्वारा कोशिका झिल्ली की स्थिति का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सेल-मैट्रिक्स इंटरफेस में सेल-मैट्रिक्स आसंजन और चिपकने वाला संपर्कों के स्थलों पर मैट्रिक्स अणुओं चिपकने वाला युग्मित है। जरूरी सेल-मैट्रिक्स इंटरफेस पर बलों की शेष है, तेजी से है कि एक घटना को बदल सेल-मैट्रिक्स आसंजन बदल कि कोशिकी उत्तेजनाओं "बाहर में संकेत" के पारगमन, जिसके परिणामस्वरूप Mechano के प्रति संवेदनशील संकेत प्रोटीन द्वारा 'लगा'। इस पार बात शर्तसमझना कोशिकाओं और उनके आसपास के बाह्य मैट्रिक्स सेल आकार, गतिशीलता, समारोह, प्रसार और अस्तित्व दो को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

विविध Patho-शारीरिक प्रक्रियाओं (भ्रूण के विकास, सूजन, घाव की मरम्मत और कैंसर मेटास्टेसिस) मैट्रिक्स अपमानजनक oxidants और / या एंजाइमों 3,4 से चिपकने वाला मैट्रिक्स substrates के गतिशील remodeling के द्वारा विशेषता है। उदाहरण के लिए, रक्त वाहिकाओं में subendothelial मैट्रिक्स प्रोटीन चिपकने वाला (जैसे, फ़ाइब्रोनेक्टिन) के कारण प्रतिक्रियाशील oxidants के स्थानीयकृत उत्पादन करने के लिए मानव भड़काऊ रोगों में संशोधन या गिरावट के लिए प्रमुख लक्ष्य के रूप में फंसा रहे हैं (उदाहरण के लिए, हाइपोक्लोरस एसिड, HOCL) ल्युकोसैट व्युत्पन्न एंजाइम द्वारा भड़काऊ रोग (चित्रा 1) 5-9 दौरान subendothelium भीतर जम जाता है, जो myeloperoxidase (MPO),। MPO व्युत्पन्न oxidants और अन्य मैट्रिक्स संशोधित उत्तेजनाओं से प्रेरित सेल-मैट्रिक्स आसंजन में परिवर्तन lik हैंबदले में endothelial समारोह और बाधा अखंडता perturbs जो endothelial सेल संकेतन, आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता, बदलकर, जैसे, इली रोग प्रक्रियाओं की एक किस्म के दौरान संवहनी समस्थिति फेरबदल में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए। हालांकि, बाह्य मैट्रिक्स संशोधनों को पक्षपाती कोशिकाओं की रूपात्मक और सेल संकेतन प्रतिक्रियाएं ही समझा जाना शुरू हो गए हैं।

मैट्रिक्स संशोधनों कोशिका आसंजन गतिशीलता और आसंजन पर निर्भर सेल संकेत दे रास्ते में परिवर्तन कैसे ड्राइव को समझने के लिए, तकनीक सही रूप में उच्च अस्थायी समाधान के साथ वास्तविक समय में सेल-मैट्रिक्स आसंजन में परिवर्तन यों कि आवश्यक हैं। यहाँ, हम पूरक सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा और इन मानदंडों को पूरा करने और एक गैर-आक्रामक ढंग से कोशिका आसंजन और डे-आसंजन प्रक्रियाओं यों के लिए एक मंच प्रदान करना है कि जीना सेल इमेजिंग तकनीक का वर्णन है।

हम बताते हैं कि कैसे इन सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा और लाइव सेल इमेजिंग approदर्द आसानी से सेल लगाव की गतिशीलता पर नजर रखने और देशी और संशोधित मैट्रिक्स substrates पर (यानी, डी नोवो कोशिका आसंजन) के प्रसार और (ii) (यानी, डे-आसंजन सेल-मैट्रिक्स टुकड़ी की गतिशीलता को मापने के लिए (मैं) करने के लिए नियोजित किया जा सकता है ) मैट्रिक्स संशोधित उत्तेजनाओं से अवगत कराया पक्षपाती कोशिकाओं द्वारा। xCELLigence सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा biosensor प्रणाली 96 अच्छी तरह से सोने microelectrode सरणियों की सतह पर विद्युत प्रतिबाधा बढ़ाता द्वारा कोशिका-मैट्रिक्स संपर्क के क्षेत्र की एक सतत माप प्रदान करता है और 'सेल सूचकांक', एक आयामरहित मूल्य के रूप में इन बिजली प्रतिबाधा माप व्यक्त करता है कि यह भी (इन्सुलेट) कोशिका झिल्ली और इलेक्ट्रोड सतह से 11 के बीच औसत दूरी में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील होने के नाते, जबकि सेल सब्सट्रेट संपर्क 10 (चित्रा 2) के क्षेत्र के लिए काफी हद तक आनुपातिक है। सेल सूचकांक मूल्यों में एक और वृद्धि भी तंग सेल सेल संपर्कों था के गठन पर हासिल की हैटी, इस अध्ययन में वर्णित प्रयोगों के भीतर प्रबल नहीं है कि 11 शर्तों paracellular वर्तमान प्रवाह सीमित। समय चूक अंतर हस्तक्षेप विपरीत की छवि विश्लेषण से समय के साथ व्यक्ति की कोशिकाओं की अनुमानित क्षेत्र के मापन (डीआईसी) फिल्मों सेल सब्सट्रेट संपर्क के क्षेत्र में परिवर्तन का एक पूरक उपाय प्रदान करता है और सटीक प्रकृति और गतिशीलता के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा दृष्टिकोण द्वारा मात्रा morphological परिवर्तन।

विशेष रूप से, हम (जैसे, फ़ाइब्रोनेक्टिन) (मैं) चिपकने वाला subendothelial मैट्रिक्स प्रोटीन के ऑक्सीकरण MPO की मध्यस्थता निगरानी कैसे शुद्ध फ़ाइब्रोनेक्टिन और (ii) चलाता है सेल-मैट्रिक्स डे पर निलंबित endothelial कोशिकाओं के डी नोवो आसंजन कम कर देता है के लिए इन तरीकों के आवेदन का वर्णन फ़ाइब्रोनेक्टिन पर स्थापित आसंजन के साथ endothelial कोशिकाओं में -adhesion। समानांतर सेल संकेतन प्रदर्शन कर प्रासंगिक बायोकेम का उपयोग करते हुए समय के साथ विश्लेषण करती तकराजनैतिक assays के (जैसे, पश्चिमी सोख्ता), आसंजन पर निर्भर सेल संकेत घटनाओं में आसंजन / डी आसंजन प्रक्रियाओं और एसोसिएटेड परिवर्तन के बीच लौकिक और कारण रिश्तों को निर्धारित किया जा सकता है।

इन तरीकों हाल ही में MPO की subendothelial जमाओं द्वारा उत्प्रेरित बाह्य मैट्रिक्स ऑक्सीकरण पूर्व मौजूदा actomyosin सिकुड़ा बलों 9 से प्रेरित है कि endothelial कोशिकाओं की कोशिका-मैट्रिक्स आसंजन में एक तेजी से नुकसान से चलाता है कि प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। महत्वपूर्ण बात है, दोनों कोशिका आसंजन में परिवर्तन और निर्धारित किया है संकेत आसंजन पर निर्भर सेल के बीच अस्थायी रिश्ते को सक्षम करने से, इन तरीकों MPO प्रेरित मैट्रिक्स संशोधन और सेलुलर डे-आसंजन एसआरसी काइनेज सहित महत्वपूर्ण आसंजन पर निर्भर सेल संकेत दे रास्ते में परिवर्तन से चलाता है कि पहचान निर्भर paxillin फास्फारिलीकरण और मायोसिन प्रकाश श्रृंखला द्वितीय फास्फारिलीकरण (चित्रा 1) 9। रेडॉक्स निर्भर संकेतन, निवेश संबंधी निर्णय की यह विधासेल-मैट्रिक्स आसंजन को बाधित कि कोशिकी ऑक्सीडेटिव प्रतिक्रियाओं द्वारा intracellular संकेतन घटनाओं की सक्रियता olving, सेल के एक उपन्यास मोड "के बाहर-इन रेडॉक्स संकेतन" (चित्रा 1) करार दिया संकेत का प्रतिनिधित्व करता है 9।

सामान्य में, इन पूरक सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा biosensor और लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण मैट्रिक्स संशोधित उत्तेजनाओं या एजेंटों कोशिका आसंजन गतिशीलता, आकृति विज्ञान में परिवर्तन कैसे ड्राइव अलग खुलासा और की एक विस्तृत विविधता के अधीन विभिन्न पक्षपाती सेल प्रकार के भीतर संकेत में मूल्यवान होना चाहिए प्रयोगात्मक सेटिंग।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल डी नोवो endothelial सेल आसंजन (प्रयोग 1) और endothelial सेल डे-आसंजन (प्रयोग 2) प्रक्रिया पर MPO की मध्यस्थता मैट्रिक्स ऑक्सीकरण के प्रभाव यों के लिए कैसे करें। MPO फ़ाइब्रोनेक्टिन और अन्य चिपकने वाला subendothelial बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन और हमारे लिए उत्सुकतापूर्वक बांधतातों (एच 22) क्लोराइड आयनों (CL -) कन्वर्ट करने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड इन मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ स्थानीय रूप से प्रतिक्रिया करता है और अपने सेल चिपकने वाला गुण (चित्रा 1) 8,9 बाधित जो उच्च प्रतिक्रियाशील क्लोरीनीकरण ऑक्सीडेंट हाइपोक्लोरस अम्ल (HOCL), को, 12।

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Protocol

1. जनरल Endothelial सेल संस्कृति

  1. संस्कृति गोजातीय महाधमनी endothelial कोशिकाओं जिलेटिन लेपित टिशू कल्चर बोतल पर (अंश 4-9) (कोट टिशू कल्चर सतह से 15 मिनट के लिए आरटी पर पीबीएस में / वी जिलेटिन डब्ल्यू 0.1% के साथ) ईजीएम-दो गोली के साथ ईजीएम -2 मीडिया में ( 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, विकास कारकों और hydrocortisone के लिए छोड़कर, निर्माता द्वारा प्रदान की जाने वाली सभी पूरक) युक्त किट।
  2. / पीबीएस में EDTA के वी 37 डिग्री सेल्सियस डब्ल्यू 0.05% वी / डब्ल्यू / trypsin 0.02% के साथ इलाज के द्वारा, फसल कोशिकाओं: कोशिकाओं के पास मिला हुआ हैं जब (4 विभाजन सीए तीन दिनों के बाद बोने एक एक के बाद)। कोशिकाओं के बहुमत के अलग हो जाने के बाद, trypsin और फिर अपकेंद्रित्र (100 XG, 5 मिनट) बुझाने के लिए पूरा ईजीएम -2 मीडिया जोड़ें।
  3. और इस सब्सट्रेट पर स्थापित आसंजन (प्रयोग 2: धारा 3) के साथ endothelial कोशिकाओं के बाद डी-आसंजन: फ़ाइब्रोनेक्टिन को endothelial कोशिकाओं के डी नोवो आसंजन पर अध्ययन (धारा 2 प्रयोग 1) के लिए कोशिकाओं को तैयार करें।
    1. धो काटाएक बार सीरम मुक्त मध्यम 199 / वी गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और फिर से अपकेंद्रित्र (100 XG, 5 मिनट) डब्ल्यू 1% से युक्त के साथ कोशिकाओं।
    2. डब्ल्यू सीरम मुक्त मध्यम 199 युक्त 1% में कोशिकाओं पुनः निलंबित / बीएसए वी पर 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल (सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा माप) या 5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल (लाइव सेल इमेजिंग का विश्लेषण करती है) और 37 पर बनाए रखने के का उपयोग करने से पहले डिग्री सेल्सियस।
      नोट: कोशिकाओं के आसंजन प्रतिक्रियाएं अब निम्नलिखित प्रोटोकॉल के दौरान कोशिकाओं को संभालने और इलाज के लिए इस्तेमाल सभी उपकरणों और समाधान 37 डिग्री सेल्सियस के एक निरंतर तापमान पर रखा जाना चाहिए (कारण संवहन प्रभाव के लिए, उदाहरण के लिए) तापमान मतभेदों को अत्यधिक संवेदनशील हैं।

2. प्रयोग 1: मूल निवासी और MPO-ऑक्सीकरण fibronectin (सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा) पर बढ़ाता डी नोवो Endothelial सेल आसंजन

नोट: प्रयोग एक डिग्री परख होती है जो MPO की मध्यस्थता करने के लिए फ़ाइब्रोनेक्टिन के ऑक्सीकरण डी नोवो समर्थन करने की क्षमता impairs

  1. 96 अच्छी तरह से सोने की सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा microelectrode सरणियों पर कोट फ़ाइब्रोनेक्टिन। पीबीएस में 5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल पर 80 μl / अच्छी तरह से शुद्ध गोजातीय फ़ाइब्रोनेक्टिन जोड़ें, 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं और समाधान निकालें।
  2. सतह बाध्य फ़ाइब्रोनेक्टिन को MPO के बंधन अनुमति देने के लिए MPO साथ fibronectin लेपित सतहों सेते हैं। 80 μl / अच्छी तरह से शुद्ध मानव न्युट्रोफिल MPO की हांक संतुलित नमक समाधान (HbSS) में 20 एनएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 घंटे के लिए सेते जोड़ें।
  3. धो किसी भी अपार MPO दूर करने के लिए HBSS के साथ दो बार सतहों।
  4. आरंभ करने के लिए 80 μl / अच्छी तरह से HBSS युक्त microelectrode सरणी थाली के कुओं के लिए एच 22 (0-10 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) जोड़ें HOCL निर्भर फ़ाइब्रोनेक्टिन ऑक्सीकरण, MPO उत्प्रेरित और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 0.5 घंटे के लिए सेते हैं।
  5. प्रासंगिक inhibitors या MPO उत्प्रेरित प्रतिक्रियाओं के modulators (जैसे, वैकल्पिक MPO एंजाइम के प्रभाव की जांच करने के लिएsubstrates के, एंजाइम inhibitors या एंटीऑक्सीडेंट; ) विवरण के लिए 9 देखते हैं, एच 22 अलावा करने के लिए तुरंत पहले HBSS के लिए इन जोड़ें।
  6. 0.5 घंटा के बाद, अवशिष्ट सतह-बाउंड ऑक्सीकरण प्रजाति बुझाने के लिए मेथिओनिन साथ सतहों का इलाज; confounding सेलुलर गतिविधियों डालती है जो हो सकता है, यानी प्रतिक्रियाशील प्रोटीन बाध्य chloramines,। अच्छी तरह से प्रति 80 μl HBSS में 10 मिमी मेथिओनिन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  7. ब्लॉक बीएसए के साथ सतहों। जोड़ें 80 μl / अच्छी तरह से बीएसए के कम से पीबीएस में वी, 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं और समाधान निकालने w / 0.2%।
    नोट: अवशिष्ट uncoated सतह क्षेत्रों कोशिका आसंजन का समर्थन है और एक गैर चिपकने वाला प्रोटीन (यानी, बीएसए) के साथ इन अवरुद्ध होगा सेलुलर आसंजन प्रतिक्रियाओं का कड़ाई से इस मामले फ़ाइब्रोनेक्टिन में कार्यरत शुद्ध सेल चिपकने वाला मैट्रिक्स पर निर्भर करती है कि यह सुनिश्चित करता है।
  8. धो HBSS के साथ दो बार सतहों।
    नोट: पूर्ववर्ती सतह के उपचार में से कोई भी appreciably सेल सब्सट्रेट readin को प्रभावित करता हैजी एस।
  9. बीज को निलंबित कर दिया endothelial कोशिकाओं (जोड़ने के 200 μl / अच्छी तरह से सीए में 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल, सीरम मुक्त मध्यम 199 युक्त 1% BSA में तैयार; 1.3 देखें) देशी या MPO-ऑक्सीकरण फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित सतहों पर।
  10. इसके तत्काल बाद कोशिकाओं (यानी, पहले किसी भी सेल लगाव और प्रसार) बोने के बाद, (5% सीओ 2 की उपस्थिति में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखे) इनक्यूबेटर बंदरगाह पर microelectrode सरणी थाली माउंट।
    1. साधन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर तुरंत एक 'खाली' सेल-आसंजन के अभाव में प्राप्त प्रारंभिक पृष्ठभूमि मूल्यों के लिए ('सेल सूचकांक') मूल्यों बाद सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा मानक के अनुसार पढ़ ले।
    2. निरंतर सेल सूचकांक डेटा (एक सेल सूचकांक पढ़ने / मिनट के न्यूनतम) के अधिग्रहण के आरंभ करें।
  11. 2 घंटे के लिए एक समय अवधि 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं, जो अधिक से अधिक सेल लगाव और हासिल की है प्रसार के दौरान; इस से परिलक्षित होता हैसेल सूचकांक मूल्यों का एक plateauing (चित्रा 3A देखें)।
    नोट: पूर्ववर्ती प्रयोग (प्रयोग 1) फ़ाइब्रोनेक्टिन की प्रारंभिक MPO की मध्यस्थता ऑक्सीकरण इस सब्सट्रेट पर सेल आसंजन की स्थापना के लिए endothelial कोशिकाओं की क्षमता की सीमा कैसे परख होती है। निम्नलिखित प्रयोग (प्रयोग 2) MPO की मध्यस्थता फ़ाइब्रोनेक्टिन ऑक्सीकरण इस सब्सट्रेट पर स्थापित आसंजन के साथ endothelial कोशिकाओं में कोशिका-मैट्रिक्स आसंजन (यानी, डे-आसंजन) में कम हो जाती है को बढ़ावा देता है कि कैसे परख होती है। इन दो प्रयोगों में उपचार MPO की मध्यस्थता फ़ाइब्रोनेक्टिन ऑक्सीकरण के समय के लिए छोड़कर, अनिवार्य रूप से समान हैं (कोशिका आसंजन से पहले यानी, - प्रयोग 1; कोशिका आसंजन के बाद - प्रयोग 2)।

3. प्रयोग 2: MPO की मध्यस्थता fibronectin ऑक्सीकरण (सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा और लाइव सेल इमेजिंग) के जवाब में फ़ाइब्रोनेक्टिन से endothelial सेल डी-आसंजन बढ़ाता

  1. 96 अच्छी तरह से सोने microelectrode एक पर कोट फ़ाइब्रोनेक्टिनलाइव सेल इमेजिंग विश्लेषण के लिए सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा मापन के लिए rrays (सी पीबीएस में 5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल पर 80 μl / अच्छी तरह से फ़ाइब्रोनेक्टिन का जोड़ सकते हैं और 37 डिग्री पर 2 घंटे के लिए सेते हैं) या 35 मिमी कांच तली सेल संस्कृति व्यंजन (2 मिलीलीटर जोड़ने / पीबीएस में 5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / पर फ़ाइब्रोनेक्टिन के पकवान और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं)।
  2. ब्लॉक बीएसए के साथ सतहों। 3.1 में संकेत मात्रा में पीबीएस में वी / डब्ल्यू 0.2% पर बीएसए जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  3. फ़ाइब्रोनेक्टिन को MPO के बंधन अनुमति देने के लिए MPO साथ सतहों सेते हैं। 3.1 में संकेत मात्रा में HBSS में 20 एनएम शुद्ध मानव MPO जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 घंटे के लिए सेते हैं।
  4. धो किसी भी अपार MPO दूर करने के लिए HBSS के साथ दो बार सतहों।
  5. देशी या MPO असर फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित सतहों पर; (देखें 1.3 सीरम मुक्त / बीएसए वी डब्ल्यू 1% से युक्त 199 मीडियम में तैयार) बीज निलंबित endothelial कोशिकाओं।
    1. जोड़ें 200 μl / अच्छी तरह से कम 96 अच्छी तरह से सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा microelectrode सरणियों के लिए 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल।
    2. <ली> सेल संस्कृति व्यंजन तली 35 मिमी कांच के लिए 5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल में 2 मिलीग्राम / पकवान जोड़ें।
  6. इसके तत्काल बाद (यानी, पहले किसी भी सेल लगाव को और प्रसार) कोशिकाओं बोने के बाद:
    1. माउंट साथ 96 microelectrode सरणी (5% सीओ 2 की उपस्थिति में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखे) सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा इनक्यूबेटर बंदरगाह पर प्लेटें और सेल सूचकांक डेटा की निरंतर प्राप्ति (सीएफ धारा 2.10 आरंभ करने के लिए 'खाली' रीडिंग ले )।
    2. स्थानांतरण 35 मिमी ग्लास 5% सीओ 2 की उपस्थिति में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर करने के लिए सेल संस्कृति व्यंजन तली।
  7. अधिक से अधिक सेल लगाव और प्रसार (सीएफ धारा 2.11) की अनुमति देने के 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  8. संक्षेप में 96 अच्छी तरह से microelectrode सरणी प्लेट (इस बिंदु पर ठहराव सेल सूचकांक रीडिंग) को हटाने या 35 मिमी गिलास 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से सेल संस्कृति डिश तली, सेल सतह पर तैरनेवाला हटाने और पी के रूप में गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) HBSS (संस्करणों को जोड़नेएर कदम 3.1)।
    नोट: उत्तरार्द्ध ऑक्सीकरण प्रतिक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप कि oxidizable प्रजातियों में शामिल है के रूप में करने के बजाय पूरी संस्कृति मीडिया के ऑक्सीडेटिव प्रतिक्रियाओं MPO उत्प्रेरित का अध्ययन करते HBSS के कार्यरत है।
  9. अवरोधकों के प्रभाव की जांच करने के लिए / MPO उत्प्रेरित प्रतिक्रियाओं (वैकल्पिक एंजाइम को substrates, एंजाइम inhibitors या एंटीऑक्सीडेंट) या सेल संकेत अवरोधकों की modulators है, अब इन जोड़ने (उदाहरण के लिए, 40 माइक्रोन blebbistatin actomyosin सिकुड़ना को बाधित करने के लिए)।
  10. तुरंत वापस 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर बंदरगाह (इस बिंदु पर फिर से शुरू सेल सूचकांक रीडिंग) में microelectrode सरणी थाली जगह या 35 मिमी गिलास वापस 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेल संस्कृति डिश तली, और कोशिकाओं में संतुलित करने की अनुमति 0.5 घंटा के लिए HBSS।
    नोट: HBSS में 0.5 घंटा संतुलन के बाद, सेल सूचकांक मूल्यों से थोड़ा कम मूल्यों पर स्थिर; एंजाइम को substrates, एंजाइम और सेल संकेत inhibitors या एंटीऑक्सीडेंट के साथ कोशिकाओं पूर्व incubating, जब पहली बार है कि टी सुनिश्चितhese काफी संतुलन के बाद प्राप्त मूल्यों को प्रभावित नहीं करते।
  11. , MPO उत्प्रेरित HOCL निर्भर फ़ाइब्रोनेक्टिन ऑक्सीकरण और de-आसंजन आरंभ करें।
    1. 96 अच्छी तरह से microelectrode सरणी प्लेट का उपयोग सेल प्रतिबाधा पढ़ाई के लिए:
      1. इनक्यूबेटर से microelectrode सरणी थाली निकालें और सेल सूचकांक माप थामने।
      2. HBSS के लिए एच 22 (0-10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता) जोड़ें और धीरे दोहराया pipetting द्वारा मिश्रण।
      3. इसके तत्काल बाद, वापस 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर बंदरगाह पर microelectrode सरणी फिर से माउंट और सेल सूचकांक रीडिंग के अधिग्रहण को फिर से शुरू।
    2. 35 मिमी कांच तली सेल संस्कृति डिश का उपयोग कर जीना सेल इमेजिंग अध्ययन के लिए:
      1. इनक्यूबेटर से संस्कृति डिश निकालें और जीवित कोशिका फिल्मों की रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त डीआईसी प्रकाशिकी के साथ एक 63X पानी उद्देश्य लेंस से लैस एक औंधा confocal खुर्दबीन के एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्म मंच पर माउंट।
      2. कोशिकाओं पर ध्यान दें औरडीआईसी प्रकाशिकी (; जानकारी के लिए, 13 को देखने के कोहलर रोशनी, पूर्वाग्रह मंदता और कैमरे ऑफसेट / लाभ) का अनुकूलन।
      3. डीआईसी फिल्म शुरू करने और एक मिनट के लिए अनुपचारित कोशिकाओं के आधारभूत रीडिंग रिकॉर्ड है।
      4. एच 22 (0-10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता) जोड़ें और धीरे दोहराया pipetting द्वारा मिश्रण। फिर से ध्यान केंद्रित माइक्रोस्कोप (यदि आवश्यक हो) और अपेक्षित समय अवधि के लिए इलाज कोशिकाओं की रिकॉर्डिंग डीआईसी फिल्मों जारी है।

4. डेटा विश्लेषण और प्रस्तुति

  1. सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा डेटा
    1. एक स्प्रेडशीट में निर्यात कच्चे डेटा (सेल सूचकांक बनाम समय)।
    2. सेल डे-आसंजन अध्ययन (प्रयोग 2: धारा 3) के लिए, के एक मूल्य पर MPO की मध्यस्थता फ़ाइब्रोनेक्टिन ऑक्सीकरण की दीक्षा से तुरंत पहले दर्ज मूल्यों की स्थापना से डेटा मानक के अनुसार एक (यानी, तुरंत 3.11 में एच 22 के अलावा पहले .1.1)।
      नोट: यह रिश्तेदार सुनिश्चित करता है किMPO की मध्यस्थता फ़ाइब्रोनेक्टिन ऑक्सीकरण द्वारा हासिल सेल सूचकांक मूल्यों में परिवर्तन के कुओं के बीच पूर्ण सेल सूचकांक मूल्यों में छोटे प्रारंभिक मतभेद द्वारा नकाबपोश नहीं कर रहे हैं।
      1. समय बनाम सामान्यीकृत सेल सूचकांक (वाई अक्ष) (एक्स अक्ष) के भूखंडों के रूप में मौजूद डेटा।
  2. (प्रयोग 2 में सेल डे-आसंजन अध्ययन: धारा 3) लाइव सेल इमेजिंग डेटा
    1. डीआईसी तुरंत पहले और एक मानक छवि विश्लेषण कार्यक्रम (जैसे, ImageJ सॉफ्टवेयर) में MPO की मध्यस्थता फ़ाइब्रोनेक्टिन ऑक्सीकरण की दीक्षा के बाद दर्ज की गई सेल इमेजिंग फिल्मों रहते खोलें।
    2. कम से कम दो अलग डीआईसी फिल्मों में बेतरतीब ढंग से एकाधिक कोशिकाओं का चयन करें और स्वयं अपने झिल्ली किनारे लगाने और संलग्न पिक्सल की संख्या बढ़ाता द्वारा अनुक्रमिक फ्रेम (जैसे, एक मिनट के अंतराल पर) में अपने अनुमान क्षेत्र को मापने।
    3. मूल्यों की स्थापना करके एक एक्सेल स्प्रेडशीट के लिए निर्यात कच्चे डेटा (समय बनाम अनुमान सेल क्षेत्र) और मानक के अनुसार सेल क्षेत्र के आंकड़ों के तुरंत पहले दर्ज1 के एक मूल्य पर MPO की मध्यस्थता फ़ाइब्रोनेक्टिन ऑक्सीकरण की दीक्षा (यानी, तुरंत 3.11.2.3 में एच 22 के अलावा पहले)।
    4. समय बनाम सामान्यीकृत सेल क्षेत्र (वाई अक्ष) (एक्स अक्ष) के एक भूखंड के रूप में मौजूद डेटा।

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Representative Results

देशी पर MPO की मध्यस्थता फ़ाइब्रोनेक्टिन ऑक्सीकरण (प्रयोग 2) endothelial सेल निलंबन की। बोने के जवाब अधिकतम सेल लगाव और प्रसार में (MPO) मुक्त फ़ाइब्रोनेक्टिन या MPO असर फ़ाइब्रोनेक्टिन परिणामों में फ़ाइब्रोनेक्टिन से endothelial सेल डे-आसंजन की वास्तविक समय मात्रा का ठहराव 2 घंटे के भीतर, सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा माप (चित्रा 3A) में सेल सूचकांक मूल्यों का एक plateauing द्वारा न्याय के रूप में। MPO की मध्यस्थता फ़ाइब्रोनेक्टिन ऑक्सीकरण प्रयोग एक में विस्तृत प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन प्रयोगों में सेल बोने के लिए पहले शुरू की है जब सेल लगाव और प्रसार के इस प्रारंभिक चरण में स्पष्ट रूप से कम हो जाता है (नहीं दिखाया डेटा; विवरण 9 को देखने के लिए)। अधिक से अधिक सेल आसंजन देशी या MPO असर फ़ाइब्रोनेक्टिन पर स्थापित हो जाने के बाद, MPO उत्प्रेरित HOCL द्वारा मध्यस्थता फ़ाइब्रोनेक्टिन ऑक्सीकरण लक्षित (MPO के सह सब्सट्रेट एच के अलावा द्वारा शुरू की 2 हे 2) सुर में तेजी से कमी का कारण बनता हैमूवी 1 देखें एक प्रतिनिधि डीआईसी फिल्म के लिए; (चित्रा 3 ए, बी) सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा द्वारा और लाइव सेल इमेजिंग (चित्रा -3 सी द्वारा मापा सेल-मैट्रिक्स संपर्क के चेहरे क्षेत्र एच 22 के बाद इसके अलावा सेल सूचकांक या सेल क्षेत्र घाटा ) MPO 9 के अभाव में कम कर रहे हैं। MPO प्रेरित डे-आसंजन के दौरान सेल सूचकांक और सेल के क्षेत्र में परिवर्तन सेल सूचकांक मूल्यों में अपेक्षाकृत धीमी घटने डे के दौरान सेल परिधि में 'सेल' मुक्त क्षेत्रों में मौजूद कोशिका झिल्ली सामग्री की इन्सुलेट प्रभाव प्रतिबिंबित कर सकते हैं, बहुत समान थे whilst अनुमान सेल क्षेत्र मापन में मात्रा निर्धारित नहीं कर रहे हैं, जो आसंजन,। 2 2 हे उपचार एच के जवाब में MPO असर फ़ाइब्रोनेक्टिन करने के लिए बाध्य endothelial कोशिकाओं में स्पष्ट तेजी सेलुलर डे-आसंजन अकेले एच 22 के साथ इलाज किया कोशिकाओं में अनुपस्थित है (यानी, MPO शामिल नहीं है कि कोशिकाओं) (चित्रा 3 ए) और बी ब्लॉक किया गया हैY MPO एंजाइम inhibitors या HOCL मैला ढोने वालों (नहीं दिखाया डेटा, विवरण के लिए 9 देखें), इस प्रक्रिया HOCL की MPO उत्प्रेरित उत्पादन (सीएफ चित्रा 1) पर निर्भर है कि पहचान। Blebbistatin साथ मायोसिन द्वितीय मोटर समारोह के निषेध के जवाब में कहा कि सेलुलर डे-आसंजन और संकुचन की पहचान, (चित्रा -3 सी, मूवी 2) सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा (3B चित्रा) से और लाइव सेल इमेजिंग द्वारा मापा endothelial सेल डे-आसंजन की दर को रोकता है MPO उत्प्रेरित subcellular मैट्रिक्स ऑक्सीकरण के लिए actomyosin तन्य बलों 9 से प्रेरित है।

चित्र 1
चित्रा 1. MPO की मध्यस्थता subcellular मैट्रिक्स ऑक्सीकरण कोशिका-मैट्रिक्स डे-आसंजन और सेल संकेतन हो सके। MPO लक्षित ओ मध्यस्थता द्वारा आसंजन पर निर्भर संकेतन में तेजी से डी-आसंजन प्रतिक्रियाएं और परिवर्तन का घोड़ानिम्नलिखित घटनाओं नौ को शामिल चिपकने वाला subendothelial मैट्रिक्स प्रोटीन, की xidation: (ए) MPO subendothelial मैट्रिक्स को उत्सुकतापूर्वक बांध और (जैसे, फ़ाइब्रोनेक्टिन) मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ स्थानीय रूप से प्रतिक्रिया करता है और उनके बाधित कि उच्च प्रतिक्रियाशील ऑक्सीडेंट HOCL उत्पन्न करने के लिए एच 22 का उपयोग करता है चिपकने वाला गुण सेल। (ख) इस क्षति निर्विरोध actin cytoskeleton में तनाव और रीस एट अल से अनुमति के साथ Reproduced आसंजन पर निर्भर सेल संकेत दे रास्ते (के परिवर्तन द्वारा संचालित (सी) झिल्ली त्याग करने के लिए अग्रणी, सेल-मैट्रिक्स इंटरफेस में चिपकने वाला संपर्कों बाधित। 9 )। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Figurसेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा के ई 2. काम के प्रवाह और सिद्धांत सेल सब्सट्रेट माइक्रोएरे प्रतिबाधा biosensor प्रणाली द्वारा मापा सेल सूचकांक मूल्यों को प्रतिबिंबित। MPO की मध्यस्थता फ़ाइब्रोनेक्टिन ऑक्सीकरण (प्रयोग 2) के जवाब में फ़ाइब्रोनेक्टिन से endothelial सेल डे-आसंजन यों के लिए विश्लेषण करती है इलेक्ट्रोड सतह पर क्षेत्र प्रेरित आयन धाराओं की सीमा और सेल सब्सट्रेट संपर्क 10 के क्षेत्र के लिए आनुपातिक हैं करने के लिए कोशिका झिल्ली की क्षमता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. वास्तविक समय MPO की मध्यस्थता फ़ाइब्रोनेक्टिन ऑक्सीकरण (प्रयोग 2) के जवाब में फ़ाइब्रोनेक्टिन से endothelial सेल डे-आसंजन की मात्रा का ठहराव। Endothelial सेल निलंबन (सीरम मुक्त मध्यम 199 युक्त 1% मेंबीएसए) 5 पर लेपित देशी या MPO असर फ़ाइब्रोनेक्टिन (फ़ाइब्रोनेक्टिन पर वरीयता प्राप्त थे छ / मिलीलीटर, तो 96 अच्छी तरह से microelectrode सरणियों (सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा माप) या 35 मिमी गिलास नीचे में अनुपस्थिति या 20 एनएम MPO की उपस्थिति) में incubated सेल संस्कृति व्यंजन (लाइव सेल इमेजिंग का विश्लेषण करती है)। कोशिकाओं तो अधिक से अधिक सेल लगाव अनुमति देने के लिए दो घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated और 2 2 हे अलावा पर ​​सेट एच (समय HBSS के साथ कोशिकाओं equilibrating और एच 22 (10 माइक्रोन) जोड़कर MPO की मध्यस्थता फ़ाइब्रोनेक्टिन ऑक्सीकरण की शुरुआत से पहले प्रसार कर रहे थे टी = 0 मिनट)। (ए) के पहले और उपस्थिति में एच 22 (MPO) और अभाव MPO की (-MPO) के साथ उपचार के बाद सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा माप का पूरा समय पाठ्यक्रम। लाइव सेल इमेजिंग द्वारा (बी) सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा मापन और (सी) सेल क्षेत्र मापन उपस्थिति में एच 22 के साथ MPO युक्त कोशिकाओं के उपचार (के बाद, विश्लेषण करती है+ Blebbistatin) और मायोसिन द्वितीय अवरोध करनेवाला blebbistatin (40 माइक्रोन) की अनुपस्थिति (-blebbistatin)। सेल सूचकांक और सेल क्षेत्र मूल्यों तुरंत पहले एक प्रतिनिधि प्रयोग से एन = 6 दोहराने माप, 1. सेल सूचकांक डेटा का एक मूल्य दिया मतलब है SEM का प्रतिनिधित्व कर रहे थे, जो एच 22 के अलावा के समय, करने के लिए मूल्यों को सामान्यीकृत कर रहे हैं। सेल क्षेत्र मूल्यों में 10 कोशिकाओं (देखें: फिल्म एक और दो ​​दो दोहराने फिल्मों, फिल्म के प्रति 5 बेतरतीब ढंग से चुनी कोशिकाओं) का मतलब है SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं, एन =। (चित्रा 3 बी, चित्रा -3 सी, मूवी एक और फिल्म 2 रीस एट अल। 9 से अनुमति के साथ reproduced हैं)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 1 । समय चूक डीआईसी सूक्ष्म0 से अधिक MPO असर फ़ाइब्रोनेक्टिन पर पालन endothelial कोशिकाओं की scopy फिल्म - एच 22 (10 माइक्रोन) के लिए जोखिम के बाद 15 मिनट; 1 सेकंड = 3 मिनट।

फिल्म 2 । 0 से अधिक MPO असर फ़ाइब्रोनेक्टिन पर पालन endothelial कोशिकाओं का समय व्यतीत हो जाने के डीआईसी माइक्रोस्कोपी फिल्म - blebbistatin (40 माइक्रोन) की उपस्थिति में एच 22 (10 माइक्रोन) के लिए जोखिम के बाद 15 मिनट; 1 सेकंड = 3 मिनट।

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Discussion

सेल-मैट्रिक्स आसंजन और डे-आसंजन प्रक्रियाओं सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा और लाइव सेल इमेजिंग का विश्लेषण करती है का उपयोग कर उच्च अस्थायी समाधान के साथ वास्तविक समय में सही मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। अंत बिंदु गरीब अस्थायी समाधान प्रदान करते हैं जो कोशिका आसंजन, का विश्लेषण करती है पर इन वास्तविक समय दृष्टिकोण एक प्रमुख लाभ प्रदान करते हैं। सही रूप में उच्च अस्थायी समाधान के साथ तेजी से डी-आसंजन प्रतिक्रियाओं बढ़ाता द्वारा, इन विश्लेषण में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं कि कैसे रूपात्मक प्रतिक्रियाओं मैट्रिक्स संशोधनों को विनियमित रहे हैं और कैसे समानांतर का उपयोग कर प्रासंगिक जैव रासायनिक assays में मापा आसंजन पर निर्भर सेल संकेत प्रक्रियाओं पर वे प्रभाव, (जैसे, पश्चिमी सोख्ता)।

हाल के अध्ययन में, इन तरीकों endothelial कोशिकाओं की डे-आसंजन ट्रिगर में subendothelial मैट्रिक्स के MPO की मध्यस्थता ऑक्सीकरण के लिए एक उपन्यास भूमिका प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया गया और दिखाया: (i) के डी-आसंजन की दर पूर्व पर निर्भर था कि मौजूदा actomyosinसिकुड़ना (सीएफ आंकड़े 3B और 3 सी) और (ii) सेल-मैट्रिक्स आसंजन के नुकसान एसआरसी निर्भर paxillin फास्फारिलीकरण और मायोसिन प्रकाश श्रृंखला द्वितीय फास्फारिलीकरण 9 (चित्रा 1 देखें) सहित महत्वपूर्ण आसंजन पर निर्भर सेल संकेत दे रास्ते में परिवर्तन कर दिया है कि। इन आंकड़ों, subendothelial बाह्य मैट्रिक्स मैट्रिक्स बाध्य MPO या प्रतिक्रियाशील oxidants के 3,5-9 के अन्य स्रोतों की subendothelial जमा द्वारा उत्पादित oxidants के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य के रूप में फंसा है, जहां भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के दौरान endothelial समारोह और बाधा अखंडता को समझने के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव है 14।

एक माइक्रोएरे आधारित, सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा biosensor प्रणाली के उपयोग के मजबूत, उच्च throughput सेल आसंजन मापन के लिए एक मंच प्रदान करता है। 96 अच्छी तरह से सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा microelectrode सरणियों की हर अच्छी तरह एक साथ 32 विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों (यानी, तीन कुओं पीई का विश्लेषण करने की क्षमता हैआर हालत)। कोशिका आसंजन में छोटे परिवर्तनों की तुलना हालांकि, जब कम से कम चार या अधिक कुओं प्रयोगात्मक हालत प्रति प्रयोग किया जाना चाहिए। सेल बोने और बाद में सेल उपचार के दौरान देखभाल के 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर वातावरण के बाहर कोशिकाओं (इस आसंजन प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है कि microelectrode सरणी पार संभावित तापमान अंतर से बचा जाता है के इलाज के लिए लिया गया समय 37 डिग्री सेल्सियस पर सभी समाधान रखने के लिए और कम करने के लिए लिया जाना चाहिए )। विशेष रूप से, सेल सब्सट्रेट इंटरफेस में बिजली चालू सेल सतह पर तैरनेवाला 10 की आयनिक शक्ति के प्रति संवेदनशील है: नतीजतन, कोशिकाओं के प्रभाव की निगरानी से पहले एक स्थिर सेल सूचकांक प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए नए बफ़र्स / मीडिया के अलावा के बाद संतुलित करने की अनुमति दी जानी चाहिए ब्याज की उत्तेजना की (3.10 और चित्रा 3A देखें)। केवल सेल-मैट्रिक्स संपर्क का औसत क्षेत्रफल में कमी प्रतिबिंबित नहीं कर सकते सेल सूचकांक में घट जाती है, लेकिन यह भी जुड़ी कोशिकाओं की संख्या में कमी को प्रतिबिंबित कर सकते हैं। भेदभाव बरतनाइन संभावनाओं के बीच, microelectrode सरणियों पर जुड़ी कोशिकाओं की संख्या में परिवर्तन के इस दृष्टिकोण MPO की मध्यस्थता फ़ाइब्रोनेक्टिन ऑक्सीकरण की औसत क्षेत्र में तेजी से कमी से चलाता है कि पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया है क्रिस्टल बैंगनी धुंधला द्वारा सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा माप के बाद तुरंत मात्रा निर्धारित किया जा सकता है सेल-मैट्रिक्स से संपर्क करें, लेकिन (विवरण के लिए, 9 देखें) सेल टुकड़ी का प्रचार नहीं करता।

सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा तकनीक की एक सीमा है कि यह microelectrode सतह पर उपस्थित सभी कोशिकाओं पर आसंजन परिवर्तन के एक औसत उपाय प्रदान करता है और यह व्यक्ति की कोशिकाओं के स्तर पर आसंजन या morphological परिवर्तन की सटीक प्रकृति के बारे में जानकारी देने के लिए नहीं करता है। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, जीना सेल डीआईसी माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण आसंजन परिवर्तन का एक पूरक उपाय प्रदान करता है और व्यक्ति की कोशिकाओं के morphological परिवर्तन का पता चलता है। इस प्रकार, MPO की मध्यस्थता फ़ाइब्रोनेक्टिन ऑक्सीकरण विदेश मंत्रालय के जवाब में सेल सूचकांक में कम हो जाती हैसेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा (चित्रा 3A) डीआईसी फिल्मों का जीना सेल छवि विश्लेषण (3B चित्रा) द्वारा मापा कोशिकाओं की अनुमानित क्षेत्र में घटने के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधी द्वारा आश्वस्त। महत्वपूर्ण बात है, डीआईसी फिल्मों व्यक्ति की कोशिकाओं में, डे-आसंजन MPO प्रेरित बुनियाद और आसन्न कोशिकाओं से परिधीय कोशिका झिल्ली का तेजी से त्याग करना शामिल है, पता चलता है कि और अंत में, लेकिन जिसके परिणामस्वरूप बिना एक कॉम्पैक्ट 'गोल-अप' आकृति विज्ञान मानते हुए कोशिकाओं में यह परिणाम सेल टुकड़ी में (1 मूवी)। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेलुलर प्रतिक्रियाओं सुनिश्चित करने के लिए सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा माप, साथ के रूप में, देखभाल पर समाधान बनाए रखने के लिए लिया जाना चाहिए 37 डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं और एक गरम खुर्दबीन मंच (या समतुल्य तापमान नियंत्रण डिवाइस) लाइव सेल इमेजिंग के दौरान नियोजित किया जाना चाहिए पर उपयोग करने से पहले रिकॉर्डिंग।

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल (अन्य शुद्ध मैट्रिक्स substrates के साथ फ़ाइब्रोनेक्टिन प्रतिस्थापन द्वारा आसानी से संशोधित किया जा सकता है 9 देखें) सुसंस्कृत पक्षपाती कोशिकाओं से एक अधिक जटिल मैट्रिक्स पर्यावरण उत्पादित अतिरिक्त समय का अध्ययन। प्रोटोकॉल भी अन्य शारीरिक मैट्रिक्स संशोधित oxidants (जैसे, peroxynitrite, नाइट्रोजन डाइऑक्साइड कट्टरपंथी 5-8), मैट्रिक्स-अपमानजनक प्रोटिएजों 15 या विरोधी सहित सेल-मैट्रिक्स आसंजन को बाधित करने वाले अन्य घुलनशील उत्तेजनाओं के साथ MPO की मध्यस्थता मैट्रिक्स ऑक्सीकरण प्रतिस्थापन द्वारा बदला जा सकता है कोशिका की सतह पर या मैट्रिक्स (उदाहरण के लिए, विरोधी Integrin एंटीबॉडी या RGD पेप्टाइड्स) में मौजूद चिपकने वाला ligands के। लाइव सेल इमेजिंग विश्लेषण भी सेल-मैट्रिक्स संपर्कों 16 की विद्युत desorption के जवाब में सेल-मैट्रिक्स डे-आसंजन यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, वर्णित प्रोटोकॉल भी endothelial कोशिकाओं (जैसे, उपकला कोशिकाओं) के अलावा अन्य पक्षपाती कोशिकाओं में सेलुलर आसंजन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए आसानी से लागू कर रहे हैं।

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Disclosures

लेखकों बनाने के खुलासे में कोई नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array ACEA Biosciences / Roche E-Plate 96 single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system
blebbistatin Sigma B0560 selective inhibitor of non-muscle myosin-II
Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved  Lonza BW-6001
Bovine serum albumin Sigma 05470
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162 endothelial cell growth media kit
Fibronectin, lyophilized powder Sigma F-4759 from bovine plasma
Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish World Precision Instruments FD35-100 Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging
Gelatin from bovine skin Sigma G9391 cell culture substratum
Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14025076
Hydrogen peroxide Merck 107298
Medium-199 Life Technologies 11150-059 serum-free cell media
Methionine Sigma M9500 quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase
Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes Millipore 475911
RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system ACEA Biosciences / Roche Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit
Trypsin-EDTA (0.5%) Gibco 15400-054 

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References

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बायोइन्जिनियरिंग अंक 96 कोशिका आसंजन biosensor जीना सेल इमेजिंग बाह्य मैट्रिक्स फ़ाइब्रोनेक्टिन mechanobiology सेल संकेतन रेडॉक्स संकेतन oxidative तनाव myeloperoxidase अन्तःचूचुक
मैट्रिक्स संशोधन द्वारा प्रेरित सेलुलर आसंजन और डी-आसंजन में वास्तविक समय परिवर्तन को मापने के लिए सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा और लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग
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Rees, M. D., Thomas, S. R. UsingMore

Rees, M. D., Thomas, S. R. Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification. J. Vis. Exp. (96), e52423, doi:10.3791/52423 (2015).

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