Summary
여기서, 우리는 지속적으로 셀 기판 임피던스와 생균 영상 분석에 의해 비 침습성 방식으로 높은 시간 해상도를 가진 세포 부착 및 디 - 접착 공정을 정량화하는 프로토콜을 제시한다. 이러한 접근은 매트릭스 수정 및 접착 의존성 시그널링 이벤트들이 시간적인 관계에 의해 트리거 세포 접착 / 디 접착 공정의 역학을 보여준다.
Abstract
셀 매트릭스 접착 세포 형태를 제어 및 시그널링에 중요한 역할을한다. 세포 접착 매트릭스 (예, 마이 엘 로퍼 옥시 다제 및 다른 매트릭스 - 수정 산화제 / 염증 동안 방출 효소)를 방해 자극 질환의 수가 세포 기능, 표현형과 생존의 병리학 적 변화를 유발에 관여된다. 여기서는 (병리 생리 매트릭스 수정 자극으로 내피 세포 및 마이 엘 로퍼 옥시 다제를 사용하여) 셀 기판 임피던스와 생균 촬상 접근 용이 정확하게 세포 부착 및 매트릭스 변형에 의해 유도 된 디 밀착성 실시간 변화를 정량화하기 위해 이용 될 수있는 방법을 설명하는 높은 시간 해상도와 비 침습적 방법. xCELLigence 셀 기판 임피던스 시스템은 연속적으로 금 미세 전극 배열상에서 성장한 세포에서 세포 - 기판 계면에서 임피던스를 측정함으로써 세포 매트릭스의 접착 면적을 정량화한다. 의 이미지 분석 시간 경과 differen간섭은 최초 콘트라스트 영화 셀 매트릭스의 접촉 면적의 변화를 나타내는, 시간이 지남에 따라 각 셀의 투영 면적의 변화를 정량화한다. 두 기술은 정확하게 세포 접착 및 탈 부착 프로세스에 급격한 변화를 정량화. 미세 바이오 센서 어레이에 관한 셀 기판 임피던스는 견고한 높은 처리량 측정 용 플랫폼을 제공한다. 라이브 세포 이미징은 세포 기질 임피던스 측정에 의해 정량 형태 학적 변화의 특성과 역학에 대한 추가 세부 사항을 제공 분석한다. 이러한 접근법은 상보 세포 내 세포 외 기질 성분의 myeloperoxidase가 촉매 작용 산화가 빠르게 변형 세포 부착, 형태 변화 및 내피 세포에서 트리거 시그널링 방법에 유용한 새로운 통찰력을 제공한다. 이러한 접근은 다른 매트릭스 수정 자극 및 관련 자기편 세포 (예를 들면, 상피 세포)에 대한 응답으로 세포 접착 역학 연구를위한 적용 할 수 있습니다.
Introduction
세포와 그 주변의 세포 외 기질 간의 안정적인 접착 접촉은 조직의 항상성의 유지 보수를 위해 필요합니다. 예를 들어, 혈관 내 피하 매트릭스 내피 세포 유착은 내피 층의 무결성 및 규제 반투과성 한 혈관 장벽으로서의 기능 항상성을 유지하는데 중요한 역할을한다. 액틴 세포 골격 기계적 중앙 관한 액토 마이 오신의 인장력에 저항하여 세포막의 위치를 결정하는데 중요한 역할을하는 세포 - 매트릭스 계면에서 세포 - 매트릭스 부착 및 접착제 접점 부위에서 매트릭스 분자 접착에 결합된다. 반드시 세포 - 매트릭스 계면에서의 힘의 균형이 급속히 인 사건 변경 셀 매트릭스 밀착성을 변경 세포 외 자극은 "외기 시그널링"의 전달의 결과로, 메카 성 신호 전달 단백질에 의해 "감지". 이 크로스 토크 내기싸우는 세포 및 주변 세포 외 기질은 세포의 모양, 운동성, 함수, 증식 및 생존을 조절이 중요한 역할을한다.
다양한 병태 생리적 과정 (배아 발달, 염증, 상처 복구 및 암전)은 매트릭스 - 산화제 분해 및 / 또는 효소에 의해 3,4- 접착제 매트릭스 기판의 동적 리모델링을 특징으로한다. 예를 들어, 혈관 내 피하 기질 단백질을 접착 (예를 들어, 피브로넥틴은) 때문에 반응 산화제의 국산화에 인간의 염증성 질환에서 수정 또는 변형 주요 대상으로 연루되어있다 (예를 들면, 차아 염소산,의 HOCl) 백혈구 유래 효소에 의해 염증성 혈관 질환 (그림 1) 5-9시 내피 밑층 내에 축적 폐장 내 myeloperoxidase (MPO). MPO 파생 산화제 및 기타 매트릭스 수정 자극에 의해 유도 된 세포 - 매트릭스 접착의 변화는 사장님이다다시 내피 기능과 장벽의 무결성을 교란 내피 세포 신호, 형태와 가능성을 변경하여, 예를 들어, 엘리는 병적 다양한 공정 중에 혈관 항상성 변화에 중요한 역할을합니다. 그러나, 세포 외 기질 수정에 부착 세포의 형태 학적 및 세포 신호 반응은 이해하기 시작했다.
매트릭스 수정 세포 접착 역학 및 접착 의존성 세포 신호 전달 경로의 변화를 운전하는 방법을 이해하기 위해, 기술은 정확하게 높은 시간 해상도로 실시간으로 세포 - 매트릭스 접착의 변화를 정량화하는 것이 필요합니다. 여기서는 상보 셀 기판 임피던스 이러한 기준을 충족하고, 비 침습적 방법으로 세포 부착 및 디 - 접착 공정을 정량화하는 플랫폼을 제공 생균 이미징 기술을 설명한다.
우리는 표시 방법이 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징 APPRO통증 용이 세포 부착의 역학을 모니터링하고 네이티브 및 변성 매트릭스 기판 상에 (즉, 새로이 세포 부착) 확산 및 (ii) (즉, 디 - 부착 세포 - 매트릭스 박리 동성을 측정하기 위해 (ⅰ)에 이용 될 수있다 ) 매트릭스 수정 자극에 노출 부착 세포에 의해. xCELLigence 셀 기판 임피던스 바이오 센서 시스템은 96 웰 금 미세 전극 어레이의 표면에 임피던스를 정량함으로써 셀 매트릭스의 접촉 면적의 연속 측정을 제공하고, '셀 인덱스'무 차원 값으로서 이러한 임피던스 측정을 나타낸다고 또한 (절연막) 세포막과 전극면 (11) 사이의 평균 거리의 변화에 민감한 반면, 셀 기판 컨택트 (10) (도 2)의 면적에 거의 비례한다. 셀 인덱스 값에서 추가의 증가는 세포 간 긴밀한 접점 그쪽 형성시 달성t는,이 연구에서 설명하는 실험 내에서 우선하지 않습니다 (11)의 조건을 세포층의 전류 흐름을 제한합니다. 경과 미분 간섭 콘트라스트의 이미지 분석에 의한 시간이 지남에 각 셀의 투영 면적의 측정은 (DIC) 영화 셀 기판의 접촉 면적의 변화의 상보 척도를 제공하고 사람의 정확한 성격과 역학에 관한 추가 정보를 제공한다 세포 기질 임피던스 방식에 의해 정량화 형태 학적 변화.
구체적으로, 우리는 (예를 들면, 피브로넥틴) (ⅰ) 접착 피하 기질 단백질의 산화를 MPO 매개 어떻게 모니터링 정제 피브로넥틴 및 (ⅱ) 트리거 셀 매트릭스 드에 현탁 내피 세포의 드 노보 밀착성을 감소하기 위해 이러한 접근법의 적용을 설명 피브로넥틴에 설립 접착 내피 세포에 -adhesion. 병렬 세포 신호를 수행하는 관련 BIOCHEM를 사용하여 시간이 지남에 따라 분석하여분석적인 (예를 들어, 웨스턴 블랏), 접착 의존성 세포 시그널링 이벤트에 접착 / 디 접착 공정과 관련된 변화와의 시간적 인과 관계가 결정될 수있다.
이러한 접근 방식은 최근의 MPO 피하 침착에 의해 촉매 산화 외 매트릭스는 기존 액토 마이 오신의 수축력 (9)에 의해 구동되는 내피 세포의 세포 - 매트릭스 밀착성 급속한 손실을 유발 함을 입증하기 위해 사용되었다. 중요한 것은, 두 세포 접착의 변화 및 결정되는 신호 접착 의존성 세포 사이의 시간적 관계를 가능하게하여, 이러한 방법은 MPO에 의한 매트릭스 수정 및 휴대 탈 부착 값이 SRC 키나아제를 포함한 중요한 접착 의존성 세포 신호 전달 경로의 변화를 트리거 발견 의존성 paxillin 인산화 및 미오신 경쇄 II의 인산화 (그림 1) 9. 산화 환원에 의존 신호, INV의 모드세포 - 매트릭스 접착을 방해 외 산화 반응에 의해 세포 내 신호 이벤트의 활성화를 olving, 셀의 신규 모드 "아웃 사이드 레 독스 신호"(도 1)이라 나타낸다 시그널링 구.
일반적으로, 이러한 상보 셀 기판 임피던스 바이오 센서 및 생균 촬상 방식은 매트릭스 - 수정 자극 또는 대리인이 세포 접착 역학, 형태의 변화를 구동 방법 상이한 드러내는 다양한 적용 상이한 부착 세포 유형 내에서 시그널링 귀중한되어야 실험 설정.
다음 프로토콜은 드 노보 내피 세포 부착 (실험 1) 및 내피 세포의 탈 부착 (실험 2) 프로세스에 MPO 매개 매트릭스 산화의 영향을 정량화하는 방법을 설명합니다. MPO는 피브로넥틴 및 기타 접착제 피하 세포 외 기질 단백질과 우리에게 탐욕스럽게 결합ES (H 2 O 2) 염화물 이온 (CL을 -) 변환 과산화수소 이들 기질 단백질로 국소 반응 및 세포 접착 특성 (도 1) 8,9 방해 반응성 염소 산화제 차아 산 (의 HOCl)에, (12).
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Protocol
1. 일반 내피 세포 배양
- 문화 소 대동맥 내피 세포 젤라틴 코팅 조직 배양 플라스크에 (통로 4-9) (코트 조직 문화 표면을 실온에서 15 분 동안 PBS에서 / V 젤라틴 w 0.1 %)와 EGM-2 총알 EGM-2 미디어 ( 5 % 소 태아 혈청, 성장 인자 및 하이드로 코르티손을 제외하고 제조업체에서 제공하는 모든 보조제)를 포함하는 키트.
- / PBS에서 EDTA V 37 ° C에서 w 0.05 % w / v 인 트립신 / 0.02 %로 처리하여 수확 세포 : 세포가 거의 합류 아르 (4 분할 약 삼일 포스트 파종 한 후). 대부분의 세포가 분리 한 후, 트립신 다음 원심 분리기 (100 XG, 5 분)을 해소하기 위해 전체 EGM-2 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- 이 기판에 설립 부착 (실험 2 : 3 절)와 내피 세포의 후속 탈 부착 : 피브로넥틴에 내피 세포의 드 노보 부착에 관한 연구 (제 2 실험 1)에 대한 세포를 준비합니다.
- 세척 수확일단 무 혈청 배지 199 / V 소 혈청 알부민 (BSA)과 다시 원심 분리기 (100 XG, 5 분) 1 W %를 함유하는 세포와.
- w 혈청 배지 (199) 함유 1 %에서 셀을 다시 중지 / BSA V에서 2.5 × 105 세포 / ㎖ (세포 기질 임피던스 측정) 또는 5 × 105 세포 / ㎖ (생균 영상 분석) 및 37 ℃에서 유지 사용하기 전에 ° C.
주 : 세포 부착 반응 그래서 다음 프로토콜 동안 세포를 처리하고 치료하는 데 사용되는 모든 장치 및 솔루션은 37 ° C의 일정 온도로 유지되어야한다 (의한 대류 효과, 예) 온도 차이에 매우 민감하다.
2. 실험 1 : 기본 및 MPO 산화 피브로넥틴 (셀 기판 임피던스)에 정량화 드 노보 내피 세포 부착
참고 실험 1 정도를 검사하는 MPO 매개하는 피브로넥틴 산화 드 노보을 지원하는 능력을 손상
- 96 웰 금 전지 기판 임피던스 미세 전극 어레이 상에 코트 피브로넥틴. PBS에 5 ㎍ / ㎖의 80 μL / 웰의 정제 소 피브로넥틴을 추가, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양 및 솔루션을 제거합니다.
- 표면 결합 피브로넥틴 MPO의 결합을 허용하는 MPO와 피브로넥틴 코팅 된 표면을 품어. 80 μL / 정제 된 인간 호중구 MPO의 행크의 균형 소금 용액 (HBSS)의 20 nm에서하고 37 ℃에서 0.5 시간 동안 품어 추가합니다.
- 워시는 언 바운드 MPO를 제거하는 HBSS로 두 번 표면.
- 개시하기 위해 80 μL / 웰의 HBSS를 함유하는 미세 전극 배열 판의 웰에 H 2 O 2 (0-10 μM 최종 농도)를 첨가의 HOCl 의존 피브로넥틴 산화, MPO를 촉매 작용하고, 37 ℃에서 또 다른 0.5 시간 동안 배양한다.
- 관련 억제제 또는 MPO - 촉매 반응 조절제 (예를 들어, 대안 MPO 효소의 효과를 검토기질, 효소 저해제 또는 항산화 제; ) 자세한 내용은 9 참조, H 2 O 2 첨가하기 직전 HBSS에 추가 할.
- 0.5 시간 후, 잔류 표면 결합 된 산화 종을 해소하기 위해 메티오닌과 표면 처리, 혼란 세포 활성을 발휘 할 수 있습니다 즉, 반응성 단백 결합 된 클로라민을. 물론 당 80 μl의 HBSS에 10 mM의 메티오닌을 추가하고 37 ° C에서 10 분 동안 품어.
- 블록 BSA와 표면. 추가 80 μL / 잘 BSA의에서 PBS에서 V, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고, 용액을 제거 / w 0.2 %.
주 : 잔존 코팅면 영역은 세포 접착을 지원하고 비 접착 단백질 (예, BSA) 이러한 차단한다 세포 부착 반응 엄격이 경우 피브로넥틴에 채용 정제 된 세포 - 부착 성 매트릭스에 의존하는 것을 보장한다. - 워시 HBSS로 두 번 표면.
참고 : 위의 표면 처리 중에 상당히 셀 기판 읽는데 영향을 미치지 않습니다GS. - 종자 현탁 내피 세포 (ADD 200 μL / 웰을 약 2.5 × 105 세포 / ml의 무 혈청 배지 (199) 함유 1 % BSA으로 제조 1.3 참조) 네이티브 또는 MPO 산화 피브로넥틴 코팅 표면 상.
- 즉시 세포 (즉, 사전에 어떤 세포 부착 및 퍼짐) 시딩 한 후, (5 % CO 2 존재하에 37 ° C의 배양기에서 수납) 인큐베이터 포트 상에 미세 전극 배열 판을 탑재.
- 계기 소프트웨어를 사용하는 것은 바로 '블랭크'세포 유착의 부재하에 수득 된 배경에 초기 값 ( '셀 인덱스') 값을 후속 셀 기판 임피던스 정상화를 가지고 읽기.
- 연속 셀 인덱스 데이터 (하나의 셀 인덱스 읽기 / 분의 최소)의 인수를 시작합니다.
- 2 시간 동안의 시간 기간을 37 ° C, 5 % CO 2에서 인큐베이션 한 세포를 최대 세포 부착 및 퍼짐 동안 달성된다; 이 반사되고셀 인덱스 값 plateauing는 (도 3a 참조).
참고 : 위의 실험 (실험 1) 피브로넥틴 초기 MPO - 매개 산화가이 기판 상에 세포 접착을 설정하는 내피 세포의 기능을 제한하는 방법을 살펴 본다. 다음 실험 (실험 2) MPO 매개 피브로넥틴의 산화가이 기판에 설립 접착과 내피 세포에서 세포 - 매트릭스 접착 (즉, 탈 부착)의 감소를 촉진하는 방법을 살펴 본다. 이들 두 실험의 처리는 MPO 매개 피브로넥틴 산화의 타이밍을 제외하고 본질적으로 동일하다 (세포 접착 전에 즉, - 실험 1] 세포 부착 후 - 실험 예 2).
3. 실험 2 : MPO 매개 피브로넥틴 산화 (셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징)에 대한 응답으로 피브로넥틴 내피 세포 드 접착을 정량화
- 96 웰 골드 미세 전극 위에 코트 피브로넥틴라이브 세포 이미징 분석을위한 세포 기판 임피던스 측정을위한 rrays (C를 PBS에 5 ㎍ / ㎖의 80 μL / 잘 피브로넥틴의 추가, 37 ℃에서 2 시간 동안 품어) 또는 35mm 유리 바닥 세포 배양 접시 (2 ml에 추가 / PBS에 5 μg의 / ㎖에서 피브로넥틴의 요리와 37 ℃에서 2 시간 동안 품어).
- 블록 BSA와 표면. 3.1에 표시된 볼륨에서 PBS에서 V / w 0.2 %에서 BSA를 추가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 배양한다.
- 피브로넥틴 MPO의 결합을 허용하는 MPO와 표면을 품어. 3.1에 표시된 볼륨에서 HBSS에 20 nM의 정제 인간 MPO를 추가하고 37 ℃에서 0.5 시간 동안 품어.
- 워시는 언 바운드 MPO를 제거하는 HBSS로 두 번 표면.
- 네이티브 또는 MPO는 베어링 피브로넥틴 코팅 된 표면에 (참조 1.3 혈청 / BSA 브이 승 1 %를 포함 199 중간에서 제조) 씨 중단 내피 세포.
- 추가 200 μL / 웰의 96 웰 세포 - 기질 임피던스 미세 전극 배열에 2.5 × 105 세포 / ml. <리> 세포 배양 접시를 바닥 35mm 유리에 5 × 10 5 세포 / ml에서 2 ㎖ / 접시를 추가합니다.
- 마운트 96 웰 미세 전극 어레이 (5 % CO 2 존재하에 37 ° C의 배양기에서 수납) 셀 기판 임피던스 인큐베이터 포트 상 플레이트와 셀 인덱스 데이터를 연속 수집 (참조, 2.10을 개시 '빈'판독 걸릴 ).
- 전송 35mm 유리 5 % CO 2 존재하에 37 ° C의 배양기에 세포를 배양 접시 바닥.
주 : 후자는 산화 반응을 방해 산화 종을 포함하는 대신으로 완전한 배양 배지의 산화 반응을 촉매 작용 MPO 공부 때 HBSS가 이용된다.
주 : HBSS에서 0.5 시간 평형화 후, 셀 인덱스 값이 약간 낮은 값으로 안정화; 효소 기질, 효소 및 세포 신호 전달 억제제 또는 항산화 세포를 미리 배양 할 때, 먼저 t을 보장HESE 크게 평형화 후에 얻어진 값에 영향을주지 않는다.
- 96 웰 미세 전극 배열 판을 사용하여 셀 임피던스 연구의 경우 :
- 인큐베이터에서 미세 전극 배열 판을 제거하고 세포 지수 측정을 일시 중지합니다.
- HBSS에 H 2 O 2 (0-10 μM의 최종 농도)를 첨가하고, 부드럽게 반복 피펫으로 혼합한다.
- 즉시, 다시 37 ° C 배양기 포트 상에 미세 전극 배열을 다시 마운트하고 세포 지수 수치의 인수를 다시 시작.
- 35mm 유리 바닥 세포 배양 접시를 사용하여 살아있는 세포 이미징 스터디 :
- 인큐베이터에서 배양 접시를 제거하고 살아있는 세포 동영상을 녹화하기에 적합 DIC의 광학 63X 물 대물 렌즈가 장착 된 반전 공 초점 현미경의 37 ° C 가열 무대에 탑재합니다.
- 세포에 초점DIC 광학 (; 자세한 내용은, 13 참조 쾰러 조명, 바이어스 지연 및 카메라 오프셋 / 게인)을 최적화 할 수 있습니다.
- DIC 영화를 시작하고 1 분 동안 처리되지 않은 세포의 기준 수치를 기록한다.
- H 2 O 2 (0-10 μM의 최종 농도)를 첨가하고, 부드럽게 반복 피펫으로 혼합한다. 다시 초점 현미경 (필요한 경우) 및 필요한 시간 동안 처리 된 세포의 기록 DIC 영화를 계속한다.
4. 데이터 분석 및 프리젠 테이션
- 셀 기판 임피던스 데이터
- 스프레드 시트로 내보내기 원시 데이터 (셀 인덱스 대 시간).
- 셀 드 밀착성 시험 (실험 2 : 제 3)의 경우의 값 MPO 매개 피브로넥틴 산화의 개시 직전에 기록 된 값을 설정하여 데이터를 정규화 한 (즉, 즉시 3.11에서 H 2 O 2의 첨가 이전 .1.1).
참고 :이 상대적으로 보장MPO 매개 피브로넥틴 산화에 의해 유도 된 세포 인덱스 값의 변화는 우물 사이의 절대 셀 인덱스 값에 작은 초기 차이로 숨겨지지 않습니다.- 시간에 대한 정규화 된 셀 인덱스 (y 축) (x 축)의 플롯으로서 존재 데이터.
- (실험 2에서 셀 드 밀착성 시험 : 제 3) 생균 촬상 데이터
- DIC 직전에와 표준 이미지 분석 프로그램 (예를 들면, ImageJ에 소프트웨어)에서 MPO 매개 피브로넥틴 산화 개시 후 기록 세포 이미징 영화를 살고 엽니 다.
- 적어도 두 개의 개별 DIC 영화에서 여러 셀을 임의로 선택하여 수동으로 막 에지를 추적하고, 밀폐 된 화소 수를 정량함으로써 순차 프레임 (예를 들면, 1 분 간격)에서의 투영 면적을 측정한다.
- 값을 설정하여 Excel 스프레드 시트로 내보내기 원시 데이터 (시간에 대한 예상 셀 영역) 및 정상화 셀 영역의 데이터는 직전 기록값 1에 MPO 매개 피브로넥틴 산화 개시 (즉, 즉시 3.11.2.3의 H 2 O 2를 첨가하기 이전).
- 시간에 대한 정규화 된 셀 영역 (y 축) (x 축)의 플롯으로서 존재 데이터.
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Representative Results
기본 상 MPO 매개 피브로넥틴 산화 (실험 2) 내피 세포 현탁액. 시딩에 대한 응답으로 최대한의 세포 부착 및 확산에 MPO (무료) 피브로넥틴 또는 MPO-베어링 피브로넥틴 결과에 피브로넥틴에서 내피 세포의 탈 부착의 실시간 정량 2 시간 내에, 세포 기질 임피던스 측정 (도 3a) 세포에서 지수 값 plateauing 것으로 판단. MPO 매개 피브로넥틴의 산화 실험 1에 설명 된 프로토콜에 따라 수행 실험에서 세포 파종 이전에 개시 될 때 세포 부착 및 확산이 초기 단계는 현저하게 감소 (데이터가 표시되지; 세부 사항 (9)를 참조하십시오). 최대 세포 부착 네이티브 또는 MPO 함유 피브로넥틴에 확립되면, MPO - 촉매의 HOCl 의해 매개 피브로넥틴 산화 타겟팅 (MPO의 공동 기판 H의 첨가에 의해 개시를 2 O 2) Sur에서 급격한 감소를 초래, 영화 1 참조 대표 DIC의 영화; (도 3A, B) 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징 (그림 3C에 의해 측정 된 세포 - 매트릭스 접촉의 얼굴 영역 H 2 O 2 첨가 한 후 세포 인덱스 또는 셀 영역 손실 ) MPO (9)의 부재하에 최소이다. MPO 유도 드 밀착성 동안 셀 인덱스 및 셀 영역 변화는 셀 인덱스 값에 비교적 느린 감소는 탈 동안 셀 주변부 '무 세포'영역에 존재하는 세포막 재료의 절연 효과를 반영 할 수 있고, 매우 유사 하였다 반면 투영 된 셀 영역 측정 정량화되지 접착. 2 O 2 처리 H에 응답하여 MPO 함유 피브로넥틴에 결합 된 내피 세포에서 명백 급속한 휴대 디 접착 형 H 2 O 2 처리 된 세포에 존재하지 않고 (즉, MPO를 포함하지 않는 세포) (도 3A) 및 b를 차단Y MPO 효소 억제제 또는의 HOCl 거제 (데이터가 표시되지 않음; 자세한 내용은 9 참조),이 과정의 HOCl의 MPO 촉매 생산 (참조 그림 1)에 종속되어 있음을 확인. blebbistatin와 미오신 II 운동 기능의 억제는 응답하여 그 세포 탈 부착 및 수축을 식별 (도 3c, 영화 2) 세포 - 기질 임피던스 (도 3b)에 의해 생균 촬상 의해 측정 내피 세포 탈 부착 율을 억제 MPO - 촉매 아세포 매트릭스 산화 액토 마이 오신의 인장력 (9)에 의해 구동된다.
그림 1. MPO 매개 세포 내 매트릭스 산화는 세포 - 매트릭스 탈 부착 및 세포 신호를 트리거합니다. MPO는 대상 O를 매개로 접착 종속 신호의 급격한 탈 부착 반응과 변화를 트리거다음 이벤트 (9)를 포함하는 접착제 피하 기질 단백질의 xidation은 : (A) MPO는 피하 행렬 열광적으로 결합하고, (예를 들면, 피브로넥틴) 기질 단백질로 국소 반응과 그 방해가 고 반응성 산화제의 HOCl을 생성하는 H 2 O 2를 사용 접착 특성을 세포. (b)이 손상 반대가 액틴 세포 골격의 긴장과리스 등의 허가 재현 접착 의존성 세포 신호 전달 경로 (의 변경에 의해 구동 (C) 막 후퇴로 이어지는, 세포 - 매트릭스 계면 접착 접촉을 방해. (9) ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Figur세포 - 기질 임피던스 E 2. 작업 흐름 및 원리는 세포 - 기질 마이크로 어레이 임피던스 바이오 센서 시스템에 의해 측정 된 셀 인덱스 값 반영. MPO 매개 피브로넥틴 산화 (실험 2)에 응답하여 피브로넥틴 내피 세포 탈 부착을 정량화하는 해석 전극 표면에서 장 유도 이온 전류를 제한하고 셀 기판 접촉 (10)의 면적에 비례하는 세포막의 기능. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 실시간 MPO 매개 피브로넥틴 산화 (실험 2)에 대응 피브로넥틴에서 내피 세포의 탈 부착의 정량화. 내피 세포 현탁액 (무 혈청 배지 199 포함 1 %에BSA는) 5시에 코팅 네이티브 또는 MPO-베어링 피브로넥틴 (피브로넥틴에 접종 하였다 ㎍ / ㎖, 다음 96 웰 미세 전극 배열 (셀 기판 임피던스 측정) 또는 35mm의 유리 바닥의 부재 또는 20 nM의 MPO의 존재)에서 배양 세포 배양 접시 (생균 분석 이미징). 이어서, 세포를 최대 세포 부착을 허용하도록 2 시간 동안 37 ° C에서 배양하고 2 O 2 첨가로 설정 H의 (시간 HBSS로 셀을 평형화하고 H 2 O 2 (10 μM)을 첨가하여 MPO 매개 피브로넥틴 산화를 시작하기 전에 확산시켰다 t = 0 분). (A) 전에 존재 H 2 O 2 (+ MPO) 및 부재 MPO의 (-MPO) 치료 후 세포 기판 임피던스 측정의 전체 시간 코스. 생균 촬상 그래피 (B) 셀 기판 임피던스 측정 및 (C) 셀 면적 측정은 존재 H 2 O 2와 MPO - 함유 세포를 처리 (이후, 분석+ blebbistatin)과 미오신 II 억제제 blebbistatin (40 μM)의 부재 (-blebbistatin). 셀 인덱스 및 셀 영역 값은 직전 대표적인 실험에서 N = 6 복제 측정 1. 셀 인덱스 데이터의 값을 소정의 평균 SEM을 표현 하였다 H 2 O 2 부가의 시간에 값으로 정규화된다. 셀 영역의 값은 10 세포 (: 참조 동영상 1, 2 2 복제 영화, 영화 당 5 무작위로 선택된 셀) 평균 SEM을 나타내고, N =. (그림 3B가, 그림 3C, 영화 1, 영화 2리스 등. 9 허가 재현됩니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1 . 시간 경과 DIC 마이크로0 이상 MPO-베어링 피브로넥틴에 부착 된 내피 세포의 SCOPY 영화 - H 2 O 2 (10 μM)에 노출 된 후 15 분; 1 초 = 3 분.
영화 2 . 0을 통해 MPO-베어링 피브로넥틴에 부착 된 내피 세포의 시간 경과 DIC 현미경 영화 - blebbistatin (40 μM)의 존재 H 2 O 2 (10 μM)에 노출 된 후 15 분; 1 초 = 3 분.
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Discussion
세포 부착 및 매트릭스 탈 접착 공정은 셀 기판 임피던스와 생균 분석 이미징을 사용하여 높은 시간 해상도와 실시간으로 정확하게 정량 할 수있다. 종점이 불량 시간 해상도를 제공 세포 부착, 이러한 분석을 통해 실시간 방식은 중요한 이점을 제공한다. 정확하게 높은 시간 해상도와 빠른 탈 부착 반응을 정량화하여, 이러한 분석은에 중요한 통찰력을 제공 할 수있는 방법 형태 응답 행렬 수정에 규제 방법과 병행하여 관련 생화학 적 분석에서 측정 된 접착 의존성 세포 신호 전달에 그들이 영향 (예를 들면, 웨스턴 블로 팅).
최근 연구에서, 이러한 방식은 내피 세포의 탈 부착을 트리거하는 피하 행렬의 MPO - 매개 산화 신규 역할을 계시하는데 사용하고 있었다 : (ⅰ) 탈 부착 율은 사전에 결정적으로 의존하는 것을 기존의 액토 마이 오신수축 (참조,도 3B 및 3C) 및 (ii) 세포 - 매트릭스 접착의 손실이 Src에 의존 paxillin 인산화 및 미오신 경쇄 II 인산화 9 (그림 1 참조)과 같은 중요 접착 의존성 세포 신호 전달 경로의 변화를 몰고. 이러한 데이터는 피하 세포 외 매트릭스 매트릭스 바인딩 MPO 또는 반응 산화제 3,5-9의 다른 소스의 피하 예금에 의해 생성 된 산화제의 주요 대상으로 연루되어 염증 반응, 동안 내피 세포 기능과 장벽의 무결성을 이해하는데 중요한 의미를 가지고 (14).
마이크로 어레이 기반의 셀 기판 임피던스 바이오 센서 시스템의 사용은 강력하고 높은 처리량 세포 접착 측정 용 플랫폼을 제공한다. 96 웰 세포 기판 임피던스 미세 전극 배열의 각 웰 동시에 32 개의 다른 실험 조건 (즉, 3 우물 체육을 분석 할 수있는 잠재력을 가지고있다R 조건). 세포 부착의 작은 변화를 비교하는 경우에는, 적어도 4 이상의 웰 실험 조건 당 사용되어야한다. 세포의 파종 및 후속 세포 치료 동안 치료는 37 ° C의 배양기 환경 밖의 세포 (이 접착 성 반응에 영향을 미칠 수있는 미세 전극 어레이에 걸쳐 잠재적 인 온도차를 피할 치료하는 데 걸리는 시간을 37 ° C에서 모든 해결책을 유지하고 최소화하기 위해주의해야한다 ). 특히, 세포 - 기판 계면에서의 전류는 세포 상청 (10)의 이온 강도에 민감하다 : 따라서, 세포 효과를 모니터링하기 전에 정상 세포 지수 응답을 얻기 위해 새로운 버퍼 / 미디어 첨가 후 평형되도록해야 관심 자극 (3.10 및도 3A 참조). 단지 세포 - 매트릭스의 평균 접촉 면적의 감소를 반영하지 않을 셀 지수의 감소뿐만 아니라, 부착 된 세포의 수의 감소를 반영 할 수있다. 차별이러한 가능성 사이 미세 전극 어레이에 부착 된 세포의 수의 변화는이 접근법 MPO 매개 피브로넥틴 산화의 평균 면적의 급격한 저하를 트리거하는지 확인하기 위해 사용 된 크리스탈 바이올렛 염색으로 셀 기판 임피던스 측정 직후 정량화 할 수있다 세포 - 매트릭스 접촉하지만, (자세한 내용은 9 참조) 세포 분리를 촉진하지 않습니다.
세포 - 기질 임피던스 기술의 한계는 미세 전극 표면에 존재하는 모든 세포 위에 부착 변화 평균 측정 값을 제공하고 개별 세포의 수준에서 접착 또는 형태 학적 변화의 정확한 성질에 대한 정보를 제공하지 않는다는 것이다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 생균 DIC 현미경과 화상 해석 접착 변경 상보 척도를 제공하고, 각각의 세포의 형태 학적 변화를 보여준다. 따라서, MPO 매개 피브로넥틴 산화 MEA에 응답하여 셀 인덱스 감소세포 - 기질 임피던스 (도 3A) DIC 영화 생균 이미지 분석 (도 3b)에 의해 측정 된 세포의 투영 면적의 감소와 상관 관계가 받음에 의해. 중요한 것은, DIC 영화의 개별 셀에, 탈 부착을 MPO 유도 기질과 인접하는 셀로부터 상기 주변 세포막의 급속한 후퇴를 수반 밝히지 궁극적하지만 얻어진없이 컴팩트 '반올림해서'형태를 가정 세포 초래 세포 분리에서 (동영상 1). 재생 가능한 세포 반응을 보장하기 위해 세포 기재 임피던스 측정과 마찬가지로, 케어에서 해법을 유지주의해야 37 ° C 세포 및 가열 현미경 스테이지 (또는 동등한 온도 제어 장치) 생균 이미징 동안 사용되어야에 사용하기 전에 녹음.
여기에 설명 된 프로토콜은 (다른 정제 매트릭스 기판을 피브로넥틴 치환함으로써 용이하게 변형 될 수있다
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Disclosures
저자는 수 있도록 공개 전혀 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
References
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
- Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
- Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
- Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
- Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
- Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
- Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
- Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
- Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
- Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).
