Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att kontinuerligt kvantifiera cellvidhäftnings och de-vidhäftnings processer med hög tidsupplösning på ett icke-invasivt sätt genom cellsubstrat impedans och levande cell imaging analyser. Dessa tillvägagångssätt avslöjar dynamik celladhesion / de-adhesionsprocesser utlöses av matrismodifiering och deras tidsmässigt samband med vidhäftningsberoende signalhändelser.
Abstract
Cell-matrix vidhäftning spelar en nyckelroll i att kontrollera cell morfologi och signalering. Stimuli som stör cellmatris vidhäftning (t.ex. myeloperoxidas och andra matris modifierande oxidanter / enzymer frigörs vid inflammation) är inblandade i att utlösa patologiska förändringar i cellulär funktion, fenotyp och livskraft i ett antal sjukdomar. Här beskriver vi hur cellsubstrat impedans och levande cell imaging metoder kan lätt användas för att exakt kvantifiera realtid förändringar i celladhesion och de-vidhäftning inducerad av matris modifiering (med hjälp av endotelceller och myeloperoxidas som en patofysiologisk matris modifiera stimulus) med hög tidsupplösning och på ett icke-invasivt sätt. Den xCELLigence cellsubstrat impedans systemet kvantifierar kontinuerligt området för cellmatrix adhesion genom mätning av den elektriska impedansen vid cellsubstratgränssnitt i celler odlade på guldmikroelektrod arrayer. Bildanalys av tidsförlopp differenTiAl interferenskontrast filmer kvantifierar förändringar i den projicerade ytan av enskilda celler med tiden, som representerar förändringar i området för cellmatrix kontakt. Båda teknikerna exakt kvantifiera snabba förändringar cellulär adhesion och de-vidhäftningsprocesser. Cell-substrat impedans på mikroelektrod biosensor arrayer ger en plattform för robust, hög kapacitet mätningar. Levande cell imaging analyser ge ytterligare detaljer när det gäller typen och dynamiken på de morfologiska förändringarna kvantifieras genom cellsubstrat impedansmätningar. Dessa kompletterande metoder ger nya värdefulla insikter i hur myeloperoxidas-oxidativ modifiering av subcellulära extracellulära matrixkomponenter utlöser snabba förändringar i celladhesion, morfologi och signalering i endotelceller. Dessa metoder är också tillämpliga för att studera cellulära vidhäftningsdynamik som svar på andra matris modifiera stimuli och i relaterade vidhäftande celler (t.ex. epitelceller).
Introduction
Stabila självhäftande kontakter mellan celler och deras omgivande extracellulär matrix krävs för underhåll av vävnad homeostas. Till exempel, endotelceller vidhäftning till subendoteliala matrisen i blodkärl spelar en avgörande roll för att upprätthålla integriteten i endotelskiktet och dess homeostatiska funktion som en reglerande, semipermeabelt vaskulär barriär 1. Den aktin cytoskelettet är mekaniskt kopplad till limmatris molekyler vid platserna för cellmatris vidhäftning och vidhäftnings kontakter på cellmatrisgränssnitt spelar en viktig roll för att bestämma positionen av cellmembranet genom att motstå centralt riktade aktomyosin dragkrafter. Extracellulära stimuli som förändrar cellmatris vidhäftning nödvändigtvis förändrar styrke vid cellmatrisgränssnitt, en händelse som är snabbt "anade" av mekano känsliga signalproteiner, vilket resulterar i transduktion av "utanför-in signalering". Denna överhörning satsninglan celler och deras omgivande extracellulär matrix spelar en nyckelroll i att kontrollera cellform, motilitet, funktion, spridning och överlevnad 2.
Diverse patofysiologiska processer (embryonalutveckling, inflammation, sårläkning och cancermetastas) kännetecknas av dynamisk ombyggnad av klistermatrissubstrat genom matris förnedrande oxidanter och / eller enzymer 3,4. Exempelvis adhesiva subendoteliala matrixproteiner i blodkärlen (t.ex. fibronektin) är inblandade som viktiga mål för modifiering eller nedbrytning i humana inflammatoriska sjukdomar på grund av den lokaliserad produktion av reaktiva oxidanter (t.ex., hypoklorsyra, HOCl) av leukocyt-härledda enzymet myeloperoxidas (MPO), som ackumuleras inom subendotelet under inflammatorisk kärlsjukdom (Figur 1) 5-9. Förändringar i cell-matrix adhesion induceras av MPO-härledda oxidanter och andra matris modifiera stimuli är likely att spela viktiga roller i att ändra vaskulär homeostas under en mängd olika patologiska processer; t.ex., genom att förändra endotel cellsignalering, morfologi och livskraft, vilket i sin tur stör endotelfunktion och barriärintegritet. Men de morfologiska och cellsignalering svar vidhäftande celler till extracellulära matrix modifieringar bara börjat att förstå.
För att förstå hur matris modifieringar köra förändringar i cellvidhäftningsdynamik och adhesionsberoende cellsignalvägar är tekniker krävs att exakt kvantifiera förändringar i cellmatrix vidhäftning i realtid, med hög temporal upplösning. Här beskriver vi kompletterande cellsubstrat impedans och levande cellavbildningstekniker som uppfyller dessa kriterier och ge en plattform för att kvantifiera celladhesion och de-adhesionsprocesser på ett icke-invasivt sätt.
Vi visar hur dessa cell-substrat impedans och levande cell imaging lämpvärk kan lätt användas för att (i) övervaka dynamiken i cellvidhäftning och spridning (dvs., de novo celladhesion) på nativa och modifierade matrissubstrat och (ii) att mäta dynamiken i cell-matris avlossning (det vill säga, de-vidhäftning ) genom adherenta celler exponerade för matris-modifierande stimuli. Den xCELLigence cellsubstrat impedans biosensorsystem ger en kontinuerlig mätning av området med cellmatris kontakt genom att kvantifiera elektrisk impedans vid ytan av 96 brunnar guldmikroelektrod arrayer och uttrycker dessa elektriska impedansmätningar som "cell index", ett dimensionslöst värde som är i stort sett proportionell mot arean av cellsubstratkontakt 10 (figur 2), samtidigt som det är känsligt för förändringar i det genomsnittliga avståndet mellan den (isolerande) cellmembran och elektrodytan 11. En ytterligare ökning av cellindexvärden uppnås också vid bildning av tät cell-cellkontakter that begränsa paracellulär ström flyter, 11 förhållanden som inte råda inom de experiment som beskrivs i denna studie. Mätning av den projicerade ytan av enskilda celler över tiden genom bildanalys av tidsförlopp differential interferens kontrast (DIC) filmer ger en kompletterande mått på förändringar i området cellsubstratkontakt och ger ytterligare information om den exakta arten och dynamik morfologiska förändringar kvantifierade av cellsubstrat impedans tillvägagångssätt.
Specifikt beskriver vi tillämpningen av dessa metoder för att övervaka hur MPO-medierad oxidation av självhäftande subendoteliala matrixproteiner (t.ex. fibronektin) (i) minskar vidhäftningen av suspenderade endotelceller de novo på renat fibronektin och (ii) utlöser cellmatris de -adhesion i endotelceller med etablerad vidhäftning på fibronektin. Genom att utföra parallella cellsignalering analyser över tiden med hjälp av relevant biochemical analyser (t.ex., Western blotting), den tidsmässiga och orsakssambanden mellan adhesion / de-vidhäftningsprocesser och tillhörande förändringar i adhesionsberoende cellsignaleringshändelser kan fastställas.
Dessa metoder har nyligen använts för att visa att extracellulärmatrix oxidation katalyseras av subendoteliala fyndigheter av MPO utlöser en snabb förlust i cell-matrix vidhäftning av endotelceller som drivs av redan existerande aktomyosin sammandragande krafter 9. Viktigt genom att tidsförhållandet mellan förändringar i både celladhesion och adhesion beroende cellsignalering som skall fastställas, dessa tillvägagångssätt identifierat att MPO-inducerad matrismodifiering och cellulär de-adhesion utlöser förändringar i viktiga vidhäftningsberoende cellsignalvägar inklusive Src kinas -beroende paxillin fosforylering och myosin lätt kedja II fosforylering (Figur 1) 9. Detta läge av redox-beroende signalering, invOlving aktiveringen av intracellulära signaleringshändelser genom extracellulära oxidativa reaktioner som stör cellmatrisvidhäftning, representerar ett nytt läge av cellsignalering som benämns "utanför-in redox signalering" (fig 1) 9.
I allmänhet bör dessa kompletterande cellsubstrat impedans biosensor och levande cell imaging metoder vara värdefulla i att avslöja hur olika matris modifierande stimuli eller agenter driva förändringar i cellvidhäftningsdynamik, morfologi och signalering inom olika vidhäftande celltyper som omfattas av en mängd olika experimentella inställningar.
Följande protokoll beskriver hur man kvantifiera effekterna av MPO-medierad matris oxidation på de novo endotelcellsadhesion (experiment 1) och endotelceller de-adhesion (Experiment 2) processer. MPO binder glupskt till fibronektin och andra adhesiva subendoteliala extracellulära matrixproteiner och osses väteperoxid (H 2 O 2) att omvandla kloridjoner (Cl -) till den mycket reaktiva klorerings oxidant hypoklorsyra (HOCl), som reagerar lokalt med dessa matrisproteiner och stör deras cellvidhäftningsegenskaper (Figur 1) 8,9, 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Allmänt Endothelial Cell Culture
- Kultur bovina endotelceller från aorta (passager 4-9) på gelatinbelagda vävnadsodlingskolvar (kappa vävnadsodlingsytan med 0,1% vikt / volym gelatin i PBS vid RT i 15 min) i EGM-2-media (med EGM-2 kula kit innehållande 5% fetalt bovint serum, tillväxtfaktorer och alla tillägg som tillhandahålls av tillverkaren, med undantag av hydrokortison).
- När cellerna är nära sammanflytande (ca 3 dagar efter ympning efter en 1: split 4), skörd celler genom behandling med 0,05% vikt / vol trypsin / 0,02% vikt / volym EDTA i PBS vid 37 ° C. Efter huvuddelen av cellerna har lossnat, till kompletta EGM-2 medium för att släcka trypsinet och därefter centrifugera (100 xg, 5 min).
- Förbered celler för studier av vidhäftningen av endotelceller de novo till fibronektin (Experiment 1: Avsnitt 2) och den efterföljande de-vidhäftning av endotelceller med etablerade vidhäftning på detta substrat (Experiment 2: Avsnitt 3).
- Tvätta skördascellerna en gång med serumfritt Medium 199 innehållande 1% vikt / vol bovint serumalbumin (BSA) och re-centrifug (100 xg, 5 min).
- Återsuspendera celler i serumfritt Medium 199 innehållande 1% vikt / volym BSA vid 2,5 x 10 5 celler / ml (cell-substrat impedansmätningar) eller 5 x 10 5 celler / ml (levande cell imaging analyser) och hålls kvar vid 37 ° C innan användning.
OBS: De vidhäftnings svar hos celler är mycket känsliga för temperaturskillnader (t.ex., på grund av konvektion effekter) så att all utrustning och lösningar som används för att hantera och behandla celler under följande protokoll bör hållas vid en konstant temperatur av 37 ° C.
2. Experiment 1: Kvantifiera De Novo endotelcelladhesion på Native och MPO-oxiderat fibronektin (Cell-substrat Impedans)
OBS: Experiment 1 undersöker i vilken grad MPO-medierad oxidation av fibronektin försämrar dess förmåga att stödja de novo
- Coat fibronektin på 96 brunnar guld cellsubstrat impedans mikroelektrod arrayer. Lägg 80 | il / brunn av renat bovint fibronektin vid 5 | ig / ml i PBS, inkubera i 2 h vid 37 ° C och avlägsna lösningen.
- Inkubera fibronektinbelagda ytor med MPO för att tillåta bindningen av MPO till ytan bundet fibronektin. Lägg 80 | il / brunn av renat humant neutrofilt MPO vid 20 nM i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) och inkubera i 0,5 h vid 37 ° C.
- Tvätta ytor två gånger med HBSS för att avlägsna allt obundet MPO.
- Lägg H 2 O 2 (0-10 | iM slutlig koncentration) till brunnarna i mikroelektrod array platta innehållande 80 pl / brunn HBSS att initiera MPO-katalyserad, HOCl-beroende fibronektin oxidation och inkubera under ytterligare 0,5 h vid 37 ° C.
- För att undersöka effekten av relevanta hämmare eller modulatorer av MPO-katalyserade reaktioner (t.ex. alternativa MPO enzymsubstrat, enzymhämmare eller antioxidanter; se 9 för detaljer), lägga till dessa till HBSS omedelbart före H2O 2 tillägg.
- Efter 0,5 h, behandla ytor med metionin att släcka rest ytbundet oxiderande arter, dvs reaktiva proteinbundna kloraminer, vilket kan utöva störande cellulära aktiviteter. Lägg 10 mM metionin i 80 | il HBSS per brunn och inkubera under 10 minuter vid 37 ° C.
- Blockera ytor med BSA. Lägg 80 | il / brunn av BSA vid 0,2% vikt / vol i PBS, inkubera i 2 h vid 37 ° C och avlägsna lösningen.
OBS: Rest obelagda ytområden kommer att stödja celladhesion och blockera dessa med ett icke-vidhäftande proteinet (dvs BSA) säkerställer att cellulär adhesion svar strikt beroende av den renade cell adhesivmatrisen utnyttjas, i detta fall fibronektin. - Tvätta ytor två gånger med HBSS.
OBS: Ingen av de föregående ytbehandlingar märkbart påverkar cellsubstrat readings. - Seed suspenderade endotelceller (lägg 200 pl / brunn vid ca 2,5 x 10 5 celler / ml, framställd i serumfritt Medium 199 innehållande 1% BSA, se 1,3) på de nativa eller MPO-oxiderade fibronektin belagda ytor.
- Omedelbart efter sådd celler (dvs innan någon cellbindning och spridning), montera mikroelektrod array plattan på inkubatorn sporten (inrymt i en 37 ° C inkubator i närvaro av 5% CO2).
- Använda instrumentets programvara omedelbart vidta en "tom" läsa för att normalisera efterföljande cellsubstrat impedans ("cell index") värden till de ursprungliga bakgrundsvärden som erhållits i frånvaro av cell vidhäftning.
- Initiera förvärv av kontinuerliga cellregisterdata (minst en cell index läsning / min).
- Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 under 2 h, en tidsperiod under vilken maximal cellvidhäftning och spridning åstadkommes; detta återspeglas ien plateauing av cellindexvärden (se figur 3A).
OBS: Den föregående experimentet (experiment 1) undersöker hur initial MPO-medierad oxidation av fibronektin begränsar möjligheterna för endotelceller att etablera celladhesion på detta substrat. Följande experiment (experiment 2) undersöker hur MPO-medierad fibronektin oxidation främjar minskningar i cell-matrix adhesion (dvs, de-adhesion) i endotelceller med etablerad vidhäftning på detta substrat. Behandlingarna i dessa två experiment är i huvudsak identiska, med undantag för tidpunkten för MPO-medierad fibronektin oxidation (dvs. innan celladhesion - Experiment 1; efter celladhesion - Experiment 2).
3. Experiment 2: Kvantifiera Endotelcell De-adhesion från fibronektin som svar på MPO-medierad Fibronectin Oxidation (Cell-substrat Impedans och levande cell imaging)
- Coat fibronektin på 96-brunnars guld mikroelektrod enrrays för cellsubstrat impedansmätningar (lägga 80 ul / brunn av fibronektin på 5 ng / ml i PBS och inkubera i 2 timmar vid 37 ° C) eller 35 mm glas botten cellodlingsskålar för levande cell imaging analyser (tillsätt 2 ml / skål av fibronektin vid 5 pg / ml i PBS och inkubera i 2 h vid 37 ° C).
- Blockera ytor med BSA. Lägg BSA vid 0,2% vikt / volym i PBS med de volymer som anges i 3.1 och inkubera i 2 timmar vid 37 ° C.
- Inkubera ytor med MPO att tillåta bindningen av MPO till fibronektin. Lägg 20 nM renad human MPO i HBSS med de volymer som anges i 3.1 och inkubera under 0,5 timmar vid 37 ° C.
- Tvätta ytor två gånger med HBSS för att avlägsna allt obundet MPO.
- Seed suspenderade endotelceller (framställda i serumfritt Medium 199 innehållande 1% vikt / volym BSA, se 1.3) på de nativa eller MPO-bärande fibronektin belagda ytor.
- Lägg 200 l / brunn vid 2,5 x 10 5 celler / ml till 96 brunnar cellsubstrat impedans mikroelektrod arrayer. <li> Tillsätt 2 ml / maträtt på 5 x 10 5 celler / ml till 35 mm glas botten cellodlingsskålar.
- Mount 96 brunnar mikroelektrod array plattor har laddats in i cellsubstrat impedans inkubator port (inrymt i en 37 ° C inkubator i närvaro av 5% CO2) och ta "tomma" avläsningar att initiera kontinuerlig förvärv av cellregisterdata (jfr avsnitt 2.10 ).
- Överför 35 mm glas bottnade cellodlingsskålar till en 37 ° C inkubator i närvaro av 5% CO2.
OBS: HBSS är anställd vid studier MPO-katalyse oxidativa reaktioner istället för kompletta odlingsmedier som den senare innehåller oxider arter som stör oxidationsreaktionerna.
OBS: Efter 0,5 h jämvikt i HBSS, cellindexvärden stabiliseras på något lägre värden; när förinkubera celler med enzymsubstrat, enzym och cellsignalering hämmare eller antioxidanter, först se till att tessa inte signifikant påverkar de värden som erhålls efter jämvikt.
- För cell impedans studier med 96 well mikroelektrod array plattor:
- Avlägsna mikroelektrod array plattan från kuvösen och pausa cellindexmätningar.
- Lägg H 2 O 2 (slutlig koncentration av 0-10 pM) till HBSS och blanda försiktigt genom upprepad pipettering.
- Omedelbart, åter montera mikroelektrod array tillbaka på 37 ° C inkubator port och åter påbörja förvärv av cellindex avläsningar.
- För levande cell imaging studier med 35 mm glas botten cellodlingsskål:
- Ta kulturen skålen från kuvösen och montera på en 37 ° C upphettad skede av ett inverterat konfokalmikroskop utrustad med en 63x vatten objektiv med lämpliga DIC optik för inspelning av live-cell-filmer.
- Fokus på celler ochoptimera DIC optik (Köhler belysning, fördomar hämning och kamera offset / gain, för detaljer, se 13).
- Initiera DIC film och spela baslinjen avläsningar av obehandlade celler i 1 min.
- Lägg H 2 O 2 (slutlig koncentration av 0-10 pM) och blanda försiktigt genom upprepad pipettering. Åter fokusera mikroskop (om det behövs) och fortsätta inspelningen DIC filmer av de behandlade cellerna för nödvändig tidsperiod.
4. Data analys och presentation
- Cell-substrat impedans uppgifter
- Exportera rådata (index kontra tidscell) i ett kalkylblad.
- För cell de-vidhäftningsstudier (Experiment 2: Avsnitt 3), normalisera data genom att sätta värden som registrerats omedelbart före initieringen av MPO-medierad fibronektin oxidation till ett värde av 1 (dvs omedelbart före tillsats av H2O 2 i 3.11 .1.1).
OBS: Detta säkerställer att den relativaförändringar i cellindexvärden som framkallades av MPO-medierad fibronektin oxidation inte maskeras av små initiala skillnader i absoluta cellindexvärden mellan brunnar.- Nuvarande data som tomter av normaliserad cellindex (y-axel) mot tiden (x-axeln).
- Live cellavbildningsdata (cell de-vidhäftnings studier i Experiment 2: Avsnitt 3)
- Öppna DIC levande cell imaging filmer som spelats in omedelbart före och efter inledandet av MPO-medierad fibronektin oxidation i ett standardbildanalysprogram (t.ex. ImageJ programvara).
- I åtminstone två separata DIC filmer slumpmässigt välja flera celler och mäta deras projicerade område i sekventiella ramar (t.ex. vid 1 min intervaller) genom att manuellt spåra deras membrankanten och kvantifiera antalet slutna pixlar.
- Exportera rådata (projicerade cellområde kontra tid) till ett Excel-ark och normalisera datacell området genom att ställa värdena registreras omedelbart föreinledandet av MPO-medierad fibronektin oxidation till ett värde av 1 (dvs omedelbart före tillsats av H2O 2 i 3.11.2.3).
- Nuvarande data som en kurva över normaliserad cellyta (y-axel) mot tiden (x-axeln).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Realtids kvantifiering av endotelceller de-adhesion från fibronektin som svar på MPO-medierad fibronektin oxidation (försök 2). Den sådd av endotelceller cellsuspensioner på infödda (MPO gratis) fibronektin eller MPO bärande fibronektin ger maximal cellbindning och spridning inom 2 timmar, såsom bedömdes genom en plateauing av cellindexvärden i cellsubstrat impedansmätningar (figur 3A). Denna inledande fasen av cellbindning och spridning minskas markant när MPO-medierad fibronektin oxidation initieras före cellsådd i experiment utförda enligt protokollet beskrivs i experiment 1 (data visas ej, För detaljer, se 9). När maximal celladhesion är etablerad på infödda eller MPO-bärande fibronektin, målinriktad fibronektin oxidation medierad av MPO-katalyserad HOCl (initierades genom tillsats av MPO co-substrat H2O 2) orsakar en snabb minskning i suransikte område cellmatris kontakt mätt med cellsubstrat impedans (Figur 3A, B) och med levande cell imaging (Figur 3C, för ett representativt DIC film, se film 1, cell index eller cellområdet förluster efter H2O 2 tillägg är minimala i avsaknad av MPO 9). Även cell index och cellområdet förändringar under MPO-inducerad de-adhesion var mycket lika, de jämförelsevis långsammare minskning av cellindexvärden kan återspegla de isolerande effekterna av cellmembranmaterial som finns i "cellfria regioner på cell periferin under de- vidhäftning, som inte kvantifieras i mätningarna projicerade cellområdet. Den snabba cellulär de-adhesion uppenbar i endoteliala celler bundna till MPO bärande fibronektin som svar på H 2 O 2 behandling är frånvarande i celler behandlade med H2O 2 ensam (dvs celler som inte innehåller MPO) (Figur 3A) och är blockerad by MPO-hämmare eller HOCl asätare (data visas, se 9 för detaljer), identifiera att denna process är beroende av MPO-katalyse produktion av HOCl (jfr figur 1). Hämning av myosin II motorik med blebbistatin hämmar graden av endotelceller de-adhesion mätt med cellsubstrat impedans (Figur 3B) och färsk cell imaging (figur 3C, Film 2), som identifierar att cellulär de-vidhäftning och kontraktion svar till MPO-katalyserad subcellulära matris oxidation drivs av aktomyosin dragkrafter 9.
Figur 1. MPO-medierad subcellulära matris oxidation utlöser cellmatris de-adhesion och cellsignalering. MPO utlöser snabba de-vidhäftnings svar och förändringar i vidhäftningsberoende signalering genom att förmedla riktade oxidation av vidhäftande subendoteliala matrisproteiner, som omfattar följande händelser 9: (A) MPO binder ivrigt till den subendoteliala matrisen och använder H 2 O 2 för att generera den mycket reaktiva oxidationsmedel HOCl som reagerar lokalt med matrisproteiner (t ex fibronektin) och stör deras cellvidhäftningsegenskaper. (B) Denna skada stör självhäftande kontakter på cellmatrisgränssnitt, vilket leder till (C) membran indragning driven av enhälligt spänningar i aktincytoskelettet och förändringen av vidhäftningsberoende cellsignalvägar (återges med tillstånd från Rees et al. 9 ). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figure 2. Arbets flöde och principen om cellsubstrat impedans analyser att kvantifiera endotelceller de-adhesion från fibronektin som svar på MPO-medierad fibronektin oxidation (experiment 2). Cell indexvärden som mäts av cellsubstratmicroarray impedans biosensorsystem reflekterar förmågan av cellmembranet för att begränsa fält-inducerad jonströmmar på elektrodytan och är proportionell mot området cellsubstratkontakt 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Realtids kvantifiering av endotelcell de-adhesion från fibronektin som svar på MPO-medierad fibronektin oxidation (Experiment 2). Endoteliala cellsuspensioner (i serumfritt Medium 199 innehållande 1%BSA) såddes på nativt eller MPO-bärande fibronektin (fibronektin belagt på 5 g / ml, inkuberades sedan i frånvaro eller närvaro av 20 nM MPO) i 96 brunnars mikroelektrod kedjor (cell-substrat impedansmätningar) eller 35 mm glasbotten cellodlingsskålar (levande cell imaging analyser). Cellerna inkuberades sedan vid 37 ° C under 2 h för att tillåta maximal cellvidhäftning och spridning innan ekvilibrering celler med HBSS och initiera MPO-medierad fibronektin oxidation genom tillsats av H 2 O 2 (10 ^ iM) (tid för H2O 2 tillsats inställd på t = 0 min). (A) Heltid-lopp cellsubstrat impedansmätningar före och efter behandling med H 2 O 2 i närvaro (+ MPO) och frånvaro (-MPO) i MPO. (B) Cell-substrat impedansmätningar och (C) cellområdet mätningar av levande cell imaging analyser, efter behandling av MPO-innehållande celler med H2O 2 i närvaro (+ Blebbistatin) och frånvaro (-blebbistatin) av hämmaren blebbistatin (40 M) myosin II. Cell index och cellområdet värden är normaliserade till värden omedelbart före tidpunkten för H2O 2 tillägg, som gavs ett värde av 1. Cell registerdata representerar medelvärdet SEM, n = 6 upprepade mätningar från ett representativt experiment. Cell area värdena representerar medelvärdet SEM, n = 10 celler (två replikat filmer, 5 slumpmässigt utvalda celler per film: se Filmer 1 och 2). (Figur 3B, figur 3C, film 1 och film 2 återges med tillstånd från Rees et al. 9). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1 . Time Lapse DIC microscopy film av endotelceller vidhäftade på MPO bärande fibronektin över 0-15 minuter efter exponering för H2O 2 (10 ^ M); 1 sek = 3 min.
Film 2 . Time Lapse DIC mikroskopi film av endotelceller vidhäftade på MPO bärande fibronektin över 0-15 minuter efter exponering för H2O 2 (10 M) i närvaro av blebbistatin (40 M); 1 sek = 3 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cell-matrisvidhäftning och de-adhesionsprocesser kan kvantifieras noggrant i realtid med hög temporal upplösning med användning av cell-substrat impedans och levande cell imaging analyser. Dessa realtids metoder ger en stor fördel jämfört med slutpunkten analyser av celladhesion, vilket ger dålig tidsupplösning. Genom att noggrant kvantifiera snabba de-vidhäftnings svar med hög tidsupplösning, kan dessa analyser ger värdefull kunskap om hur morfologiska svar på matris modifieringar regleras och hur de påverkar vidhäftningsberoende cellsignalering processer, mätt i parallella använder relevanta biokemiska analyser (t.ex. Western blotting).
I senare studier, var dessa metoder som används för att avslöja en ny roll för MPO-medierad oxidation av subendoteliala matrisen i utlösa de-vidhäftning av endotelceller och visade: (i) att graden av de-adhesion var kritiskt beroende av för- existerande aktomyosinkontraktilitet (jfr figur 3B och 3C) och (ii) att förlusten av cellmatris vidhäftning körde förändringar i viktiga vidhäftningsberoende cellsignalvägar inklusive Src-beroende paxillin fosforylering och myosin lätt kedja II fosforylering 9 (se figur 1). Dessa data har viktiga implikationer för att förstå endotelfunktion och barriär integritet under inflammatoriska svar, där subendoteliala extracellulära matrisen inblandade som ett viktigt mål för oxidanter som produceras av subendoteliala fyndigheter av matrisbundna MPO eller andra källor för reaktiva oxidanter 3,5-9, 14.
Användningen av en mikromatris-baserade, cell-substrat impedans biosensorsystem ger en plattform för robusta, hög genomströmning cellvidhäftningsmätningar. Varje brunn i de 96 brunnar cellsubstrat impedans mikroelektrod arrayer har potential att samtidigt analysera 32 olika experimentella förhållanden (dvs 3 brunnar per skick). Då man jämför med små förändringar i celladhesion, åtminstone fyra eller flera brunnar bör användas per experimentell betingelse. Under cellsådd och efterföljande cellbehandlingar, bör försiktighet iakttas för att hålla alla lösningar vid 37 ° C och minimera den tid det tar att behandla celler utanför 37 ° C inkubator miljö (detta undviker potentiella temperaturskillnader över mikroelektrod array som kan påverka vidhäftnings svar ). Noterbart är den elektriska strömmen vid cellsubstratgränssnittet känslig för jonstyrkan av cellsupernatanten 10: följaktligen celler bör fick utjämnas efter tillsatsen av nya buffertar / media för att erhålla en jämn cellindexsvar innan övervakning av effekten av stimulans av intresse (se 3.10 och figur 3A). Minskningar i cellindex kan inte endast återspegla en minskning av den genomsnittliga området av cellmatrix kontakt, men kan också återspegla en minskning i antalet vidhäftade celler. Att diskrimineramellan dessa möjligheter, kan förändringar i antalet anslutna celler på mikroelektrod arrayer kvantifieras direkt efter cellsubstrat impedansmätningar av Crystal violett färgning detta tillvägagångssätt har använts för att bekräfta att MPO-medierad fibronektin oxidation utlöser en snabb minskning av den genomsnittliga området cell-matrix kontakt, men inte främjar cell detachement (för detaljer, se 9).
En begränsning av cellsubstrat impedans teknik är att den ger en genomsnittlig mått på vidhäftnings förändringar över alla celler som finns på mikroelektrodytan och det ger inte information om den exakta arten av vidhäftning eller morfologiska förändringar i nivå med enskilda celler. För att ta itu med denna begränsning, levande cell DIC mikroskopi och bildanalys ger ett kompletterande mått på förändringar vidhäftnings och avslöjar morfologiska förändringar i enskilda celler. Således minskar i cell index som svar på MPO-medierad fibronektin oxidation meaförsäkras genom cell-substrat impedans (figur 3A) korrelerar väl med de minskningar i den projicerade ytan av celler som mäts av levande cell bildanalys av DIC filmer (figur 3B). Viktigt DIC filmer visar att, i enskilda celler, MPO-inducerad de-vidhäftning involverar snabba indragning av perifera cellmembranet från underlaget och intilliggande celler och slutligen resulterar i celler med antagande en kompakt "avrundad" morfologi, men utan att det leder i cell lossnar (Film 1). Som med cellsubstrat impedansmätningar, för att säkerställa reproducerbara cellulära svar, bör försiktighet iakttas för att bibehålla lösningar vid 37 ° C före användning på celler och en uppvärmd mikroskop skede (eller motsvarande temperaturregleringsanordning) måste användas under levande cell imaging inspelningar.
De protokoll som beskrivs här kan modifieras lätt genom att substituera fibronektin med andra renade matrissubstrat (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga upplysningar att göra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
References
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
- Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
- Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
- Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
- Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
- Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
- Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
- Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
- Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
- Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).
