Protocol
전에 어떤 동물 절차, 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 프로토콜을 승인해야합니다. 이 프로토콜은 미시간 주립 대학 IACUC 승인을 받았다.
FITC - 이눌린 솔루션 1. 사전 실험 준비
- 모든 이눌린이 용해 될 때까지 천천히 따뜻한 20 ~ 70 ° C의 식염수 용액 및 FITC - 이눌린 (5 ㎎ / ㎖ FITC - 이눌린) 100 mg을 안으로 약동.
- 차가운 용액을 RT 및 소 혈청 알부민의 800 mg을 추가 (40 ㎎ / ㎖ BSA, 동결 건조 분말, 본질적으로 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 무료, 낮은 내 독소, ≥98 % 순도 글로불린).
- 여과지 (1 등급)과 이눌린-BSA 솔루션을 필터링합니다. 주사기 팁 필터 (0.2 μm의)와 20 ML의 주사기에서 여과 된 용액을 넣고 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 커버한다.
2. 마취 및 수술
- 마취를 유도하기 위해 5 %의 이소 플루 란 가득 유도 챔버에서 쥐를 놓습니다. 기록 죽인다Y 중량 (250~350g)와 실험을하는 동안 37 ° C의 체온을 유지하기위한 가열 외과 플랫폼 쥐 놓는다. 조심스럽게 발을 통해 실험실 테이프로 플랫폼에 쥐를 고정합니다. 0.8-1.0 L / 분의 공기 흐름 속도로 의료 학년 100 % O 2와 1 ~ 2 %의 이소 플루 란으로 마취를 유지한다.
- 혈압과 심장 박동 모니터링, 혈액 샘플링에 대한 대퇴 동맥에 테이퍼 카테터 (혈관 팁 외경, 2.7F)를 삽입합니다.
- 이눌린 주입에 대한 대퇴 정맥에 카테터 (PE-50)를 삽입합니다. 5-O 꼰 실크 수술 봉합사 (6)와 주변 조직에 카테터를 고정합니다.
- 스트레인 게이지 압력 변환기에 동맥 카테터를 연결. 녹음 혈압 실시간으로 컴퓨터 스크린상에서의 데이터 수집 소프트웨어를 이용하여 디스플레이 및 심박수. 이 기술은 비디오 6에 상세하게 설명된다.
- 치골 상부 절개를 통해 방광을 노출. 작은 컷방광의 끝 부분에 구멍 열을 캐 뉼러 (PE-190)를 삽입 소변 수집 방광 내부의 팁 플레어. 지갑 문자열 봉합과 방광에 캐 뉼러를 고정합니다.
3. 소변 및 혈액 수집
- (300g 무게 쥐에 대한 3 ㎖ / 시간)를 체중 100g 당 1 ㎖ / hr의 유량 설정 주사기 펌프에 FITC - 이눌린의 주사기를 놓습니다. 대퇴 정맥 카테터에 주사기를 연결합니다. 이눌린의 주입을 시작하고 1 ~ 2 시간의 평균 기간을 허용합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 덮여 주사기를 유지합니다.
- 소변 유량이 안정하고 10 분 동안 예비 칭량 수집 바이알에 소변 시료를 수집하여 분석 샘플 (20 μL / 분)에 적합한 지 여부를 결정. 디지털 규모 중량 측정 소변의 양을 결정합니다. 10 분 동안 수거 적절한 소변 부피는 0.2 ml 인 것을. 두 개의 연속 콜렉션 20 μL / m의 소변 유량을 나타낼 때까지 소변을 채취 계속또는 더.
- 사전 의약품 샘플
- 20 분 기간 동안 소변 시료를 수집. 소변 수집 기간의 중간 지점에서 동맥 카테터로부터 혈액 시료 (0.5 ml)에 수집. 1 U 헤파린를 포함한 컬렉션 유리 병에 혈액 샘플을 수집하기 전에 식염수 완전히 명확 동맥 카테터에주의해야합니다. 동맥혈 0.5ml의 수집을 용이하게하기 위해 볼륨 표시와 수집 튜브를 사용한다.
- 피 (약. 0.1 ㎖)의 카테터을 취소 헤파린 식염수 (20 U / mL)로 동맥 카테터를 플래시합니다. 플러시 할 필요 헤파린 식염수의 부피를 제한하기 위해 가능한 동맥 카테터의 길이가 짧아야한다.
참고 : 희석 된 혈액 샘플은 사구체 여과율과 나 그리고 케이의 분수 배설의 부정확 한 계산을 생산 - 10 분을 기다린 두 번째 사전 약물 소변과 혈액 샘플의 수집을 반복합니다.
- 두 사전 약물 샘플의 수집을 따르면, 이뇨제 DRU 관리g, 푸로 세 미드 (10 ㎎ / ㎏), 동맥 카테터를 통해. 약물의 카테터을 취소 헤파린 식염수 동맥 카테터를 플래시합니다. 동맥 카테터를 통해 공기의 주입을 방지하기 위해주의해야합니다. 푸로 세 미드 주입의 시간을 기록한다.
- 포스트 - 약물 샘플 아래 3 시점들 각각에서, 10 분간 수거 기간 소변 샘플 및 뇨 수집 기간의 중간 지점에서 혈액 샘플 (0.5 ㎖)에 모은다.
- 후 약물 샘플 1 - 후 푸로 세 미드 다섯 분을 수집합니다.
- 후 약 샘플 2의 - 후 푸로 세 미드 십 분을 수집합니다.
- 후 약물 샘플 3의 - 후 푸로 세 미드 십오 분을 수집합니다.
- 모든 샘플을 수집 한 후, 개흉하고 심장을 제거함으로써 제도적 절차에 따라 래트를 안락사. 모두 신장을 제거합니다. 디 캡슐은 (주변 막 제거) 및 초과 혈액을 제거하는 신장시킨다. 신장의 무게를.
- 모든 중량 측정 디지털 스케일과 소변 샘플 볼륨, 기록의 무게를 측정한다.
- 테이블 탑 원심 분리기 (1800 XG)와 원심 전혈 시료는 혈장을 분리한다. 작은 유리 병 라벨에 플라즈마 샘플을 전송합니다.
- 나트륨 / 칼륨 분석기 소변과 혈장 시료에서 나와 K 농도를 분석합니다.
- 혈장과 소변에서 FITC - 이눌린의 측정
- 전 소변 약물을 희석하고 HEPES 완충액 (500 mM의, pH 7.4의)와 후 약물 소변 (1시 10분) (1 : 400 : 200-1).
- 96 웰 플레이트 (물론 당 하나의 샘플)에 HEPES 버퍼의 표준 또는 샘플 60 μL의 40 μl를 추가하고 알루미늄 호일로 덮여 동안 10 분 동안 혼합 할 수 있습니다.
- 농도에 대한 FITC - 이눌린에 대한 표준 곡선을 생성 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 μg의 / ㎖ (도 1). EX와 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 시료와 표준에 FITC - 이눌린 형광을 결정각각 485과 538 나노 미터의 인용 및 방출 파장.
- 4 있었던 파라미터 물류 기능 회귀 분석 표준에 대한 형광 값을 맞 춥니 다. 회귀 함수 파라미터는 플라즈마 및 소변 샘플 (표 1)에 FITC-이눌린 농도를 계산하는데 사용된다.
결과 5. 후 실험실 분석 : 계산
- (UV를; ㎖ / 분) 소변 유량을 계산한다 [소변 수집 부피 (㎖)] ÷ [콜렉션의 시간 (분)]
- 사구체 여과 속도 계산 (GFR을, ml / 분) ÷ [플라즈마 이눌린 진한 [소변 이눌린 농도 (μg의 / ㎖) UV (ml / 분) X]를. (μg의 / ㎖)]
- 혈장 나트륨 농도 (μmol / ㎖) × GFR (㎖ / 분) : 필터링 나트륨로드 (μmol / 분)을 계산
- 나트륨 배설 속도 (U 나 V를; μmol / 분) 계산 : 소변 나트륨 농도 (μmol / ㎖) (㎖ / 분)을 X UV
- 계산 나트륨의 소수 배설 (FE 나, %)[U 나 V (μmol / 분)] ÷ [필터링 나트륨로드 (μmol / 분)] × 100
- 필터링 칼륨로드 (μmol / 분)를 계산 : 혈장 칼륨 농도 (μmol / ㎖ 것은) GFR을 X (ml / 분)
- 칼륨 배설 속도 (U V를 K; μmol / 분) 계산 : 소변 칼륨 농도 (μmol / ㎖) (㎖ / 분)을 X UV
- 계산 칼륨의 배출율 (FE K; %) : [U V K (μmol / 분)] ÷ [필터링 칼륨로드 (μmol / 분)] × 100
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Representative Results
실험실 데모에 사용되는 이뇨제는 매우 신속하게 약물 투여의 분 이내에 증가 나, K의 결과 신장, 물 배설에 의해 필터링 나와 K의 재 흡수를 억제 푸로 세 미드이었다. 그것의 기본 메커니즘에 의해, 푸로 세 미드는 사구체 여과율과 나 그리고 K의 필터링 된 부하에 최소한의 영향을해야하지만, 나 그리고 케이의 소변 흐름과 분수 배설을 증가
마취 된 래트에서, GFR위한 예비 약물 값의 평균 / 분, 나트륨 배설이 0.58 μmol / 분 (여과 하중의 0.1 %)를 3.2 ml의이었다 및 K 배설 해당 테이블의 대표적인 결과가도 3 4.4이었다 μmol / 분 (필터링 된 부하의 27 %). 푸로 세 미드 (후 약 1), 사구체 여과율과 나 그리고 K의 필터링 된 부하 후 5 분은 영향을받지 않았다. 하지만, 나트륨의 배출율은 11.5 %로 증가하고, K의 배출율은 각 여과 하중은 63 %로 증가 하였다. MA의 측정P와 인사 푸로 세 미드지도와 인사 (표 2)에 미치는 효과를 가지고 있음을 나타냅니다.
실험실 데모에서 평가 신장 기능의 지표는 플라즈마는 신장에서 여과되는 비율로 정의 사구체 여과율이었다; 필터링 된 나트륨과 K, 나하고 K는 신장에 의해 필터링되는 비율로 정의; 나하고 K는 신장으로 배설되는 비율로 정의 나와 K 배설 속도; 및 신장에 의해 분비되고, 여과 나와 K의 비율로 정의 나트륨과 K의 배출율,
그림 1. 이눌린 표준 곡선 FITC 형광 값은 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 μg의 / ㎖을 함유하는 이눌린 표준을 나타낸다. 4- 있었던 파라미터 로지스틱 함수의 회귀 분석은 최적 곡선을 생성한다. 이 곡선으로부터 회귀 함수 파라미터 FI를 계산하는데 사용 하였다혈장과 소변 샘플에서 TC-이눌린 농도.
| FITC - 이눌린 형광 | 집중 | 결과 | ||||
| 표준 | 1 복제 | 2 복제 | 평균 | μg의 / ㎖ | 희석 | μg의 / ㎖ |
| 공백 | 63.9 | 64.8 | 64.4 | 0.4 | 1 | 0.4 |
| 6.25 | 253.2 | 264.1 | 258.7 | 5.9 | 1 | 5.9 |
| 12.5 | 474.0 </ TD> | 491.3 | 482.7 | 12.5 | 1 | 12.5 |
| (25) | 854.8 | 881.3 | 868.1 | 24.4 | 1 | 24.4 |
| (50) | 1617.1 | 1618.0 | 1617.6 | 50.3 | 1 | 50.3 |
| (100) | 2813.1 | 2846.1 | 2829.6 | 101.3 | 1 | 101.3 |
| (200) | 4367.3 | 4588.7 | 4478.0 | 198.2 | 1 | 198.2 |
| (400) | 6258.0 | 6650.0 | 6454.0 | 401.6 | 1 | 401.6 |
| 소변 샘플 | ||||||
| 전 약 1 | 2443.9 | 2062.3 | 2253.1 | 88.5 | (200) | 17700 |
| 전 약 2 | 2266.5 | 1707.0 | 1986.8 | 76.3 | (200) | 15250 |
| 후 약 1 | HT "> 1208.91391.2 | 1300.1 | 44.7 | (10) | (447) | |
| 후 약 2 | 2753.4 | 2120.5 | 2437.0 | 97.0 | (10) | (970) |
| 후 약 3 | 2888.3 | 3178.0 | 3033.2 | 124.4 | (10) | 1244 |
표 1. 이눌린 정량법 FITC-이눌린 형광 값의 샘플 결과 빈 시약 7 표준, 5 소변 샘플에 대해 도시된다. 표준 및 샘플 중복 분석하고 필요에 따라 희석 하였다. 각 샘플에 대한 평균 형광 이눌린 농도를 계산 하였다. 이 소변 샘플에서 이눌린 농도는 측정 (표 2)의 표에 포함되어 있습니다.
표 2 : 신장 기능 랩 데모 동안 기록 측정 다섯 시간 기간 동안 기록 된 변수 신장 기능 실험실 데모 (이 전 약물 및 세 후 약물) 동맥압 (MAP)을 의미, 오른쪽과 왼쪽 신장의 무게입니다. 심장 박동수 (HR), 샘플 시간, 소변량, 혈장 및 소변 나트륨 (Na), 칼륨 (K)과 이눌린 농도. 소변 이눌린 농도는 표 1에 나타낸 이눌린 분석에서 측정 하였다.
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표 3 :. 프로토콜 섹션 5에서 도시 된 식을 사용하여 기록 측정으로부터 계산 된 신장 기능 파라미터, 기록 된 변수 (표 2) 소변 유량, 사구체 여과율, GFR / g 신장 중량, 배설 율을 계산하는데 사용되는 두 전 약물 및 세 이후 기간 동안 약물 여과 부하, 및 나트륨의 배출율 (Na), 칼륨 (K).
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Discussion
4 가지 기준을 충족시켜야 GFR 측정 적절한 마커 : 자유롭게 사구체에서 여과 될, 혈장 단백질에 결합되지 않은, 그리고 둘 흡수하지도 네프론으로 분비 될 수있다. 이눌린은 이러한 기준을 만족 과당 중합체이다. 그 결과, 신장 이눌린 클리어런스 GFR 7 측정 금 표준 여겨진다. 입증 기술은 이눌린 8,9의 지속적인 주입하는 동안 시간 제한 소변 컬렉션을 사용하여 이눌린의 신장 클리어런스를 결정하는 전통적인 접근 방식을 나타냅니다. 전통적인 이눌린 측정은 분광 광도계 (10, 11)에 의해 측정 된 이눌린 비색 정량 결정을 제조 트론 방식을 사용하여 제조되었다. 그러나, 소변과 플라즈마의 이눌린, 소량의 측정을 용이하게하기위한 시도로, 이눌린은 12-14 방사성, 형광 라벨 15-17 태그로하고있다. 이 비디오 U에 제시된 실험 시연SED FITC 때문에 인체 피폭의 위험의 부족 및 FITC 형광 (15)을 측정 용이성 신기능 측정 이눌린 표지.
이 실험실 데모는 최소한의 실험실 기술을 가진 학생들에게 신장 기능을 측정하는 방법에 대한 개념적 이해를 제공하기위한 것입니다. 따라서, FITC-이눌린 용액 및 동물의 수술 준비 미리 실험 준비 시연의 시작 이전에 숙련 된 기술자에 의해 수행된다. 학생들은 1-2 시간 이눌린 평형 기간의 끝에 도달 시연. 이때, 학생들은 사전 실험 개요되게되고 동물에서 수행 된 절차를 알렸다. 두 학생은 한 동물 실험에 할당되고, 이전과 이뇨 약물의 투여 후 혈액과 소변 샘플을 수집하는 방법에 대한 지시. 혈액과 소변 샘플의 분석은 experie에 의해 실시NCED 기술자 및 결과는 신장 기능의 계산을 위해 학생들에게 전달됩니다. 결과는 데모 후 예약 할 수 있습니다 후 실험실 토론 중에되게됩니다.
유효한 응답을 보장하는 프로토콜 내에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, FITC의 이눌린은 완전히 용해 및 동물 관리하기 전에 필터링해야합니다. 이상적으로, FITC의 이눌린은 잔류 언 바운드 FITC를 제거하기 위해 실온에서 48 시간 동안 물에 투석해야한다. 둘째, 플라즈마 샘플은 식염수 없어야합니다. 학생들은 동맥 카테터에 생리 식염수를 모두 배출 된 후에 만 혈액 샘플을 수집하도록 지시 만 혈액 카테터로부터 유출된다. 식염수로 희석 혈액 샘플 플라즈마 이눌린, 나트륨 및 칼륨에 대한 부정확 한 값을 제공 할 것입니다. 셋째, 소변 흐름 분석을위한 충분한 샘플을 생산하기 위해 꾸준하고 적절한해야합니다. 그것의 표시이기 때문에 초기에 정상 소변 유량이 중요안정적인 실험 준비. 요 흐름이 너무 낮 으면, 이눌린의 주입 속도는 모음을 샘플링 전에 증가 될 수있다. 그러나, 이눌린의 주입은 실험 과정 동안 일정해야, 즉, 이눌린 주입 속도는 실험 기간 동안 조정되지 않을 것이다. 마지막으로, 마이크로 플레이트 리더에 의해 혈장 및 뇨 샘플 이눌린 형광 측정 실험 성공에 중요하다. 샘플 희석을 필요로하는지 확인할 수있는 마이크로 플레이트 리더의 사양 때문에,이 이눌린 분석의 테스트 실행이 마이크로 플레이트 리더의 사양을 최적화하고 그 샘플의 형광 값은 보장하기위한 노력의 일환으로 실험실 시연에 앞서 실시하는 것이 좋습니다 표준 곡선의 중간 범위 내에서.
고려 금 표준 이눌린 소율에 기초 신장 기능을 평가하는 동안,이 방법은 동물을 마취되어야하기 때문에 한계가 있고,혈관과 방광 카테터와 계측. Anesthethetic 제제는 신장 혈역학 및 GFR 18,19 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다; 그러나 이소 플루 란과 inactin는 일반적으로 인해 신장 (19, 20)에 자신의 최소한의 영향으로 신장 기능 실험에 사용됩니다. 이눌린 통관 기술은 또한 쥐 같은 작은 동물을 금지 할 수 있습니다 이눌린 여러 혈액과 혈장 시료의 일정한 주입을 필요로한다. 이 기술의 수정은 의식 동물 21 이눌린 단일 주입으로부터 혈장 클리어런스의 측정을 허용하도록 개발되었다. 이러한 변형은 또한 분석을 위해 혈액 샘플의 작은 양을 필요로하고, 쥐에서 신장 기능을 평가하기위한 또 다른 방법을 제공한다.
신장 기능의 측정은 생리학, 병리학, 독성학, 약학 및 질병 상태의 연구에 적용 할 수있다. 신장 기능 데모에 참여하는 학생들은 T를 배울 것이눌린의 신장 클리어런스 그는 금 표준 기술은 신장 기능을 평가합니다. 이 기술을 습득함으로써, 학생들은 신장 기능의 원리를 이해하고 자신의 연구 기술을 적용하고 기술에 대한 수정이 자신의 연구에 적합 여부를 결정 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 의견 또는 여기에 포함 된 주장은 저자의 개인 의견이며, 공식 또는 육군의 부 또는 국방부의 의견을 반영하는 것으로 해석되어서는 안된다.
Acknowledgments
실험실 시연을위한 자금 조달 원은 NIGMS 부여했다 : GM077119. 우리는 통합적인 장기 및 시스템 약리학의 짧은 나오긴의지지 박사 조셉 R. 헤이 우드 박사 피터 Cobbett 감사합니다. 우리는 또한 실험실 데모 그녀의 기술 지원 양 한나 가버 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Braided Silk Surgical Suture | Surgical Specialties Corp | SP1033 | |
| Assay Plate, 96-Well | Costar | 3922 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Chemical Co | A2934-25G | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | MicroFuge 18, 357160 | |
| Conical Sample Tubes | Dot Scientific Inc. | #711-FTG | |
| Cotton Tipped Applicators | Solon Manufacturing Co | 56200 | |
| Data Acquisition Software | ADInstruments | LabChart Pro 7.0 | |
| Digital Scale | Denver Instrument | APX-4001 | |
| FITC-Inulin | Sigma Chemical Co | F3272-1G | |
| Gauze Sponges | Covidien | 2146 | |
| Heated Surgical Bed | EZ-Anesthesia | EZ-212 | |
| Heparin | Sagnet | NDC 25021-402-10 | |
| HEPES | Sigma Chemical Co | H3375 | |
| Isoflurane | Abbott Animal Health | IsoFlo, 5260-04-05 | |
| Isoflurane Vaporizer | EZ-Anesthesia | EZ-190F | |
| Micro Dissecting Forceps | Biomedical Research Instruments Inc. | 70-1020 | |
| Microplate Reader - Fluoroskan | ThermoScientific | Ascent FL, 5210460 | |
| NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer | NOVA BioMedical | 14156 | |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| PE-190 (for bladder catheter) | BD Medical | 427435 | |
| Pressure Transducer | ADInstruments | MLT1199 | |
| Pyrex Culture Tubes | Corning Inc. | 99445-12 | |
| Rat Femoral Tapered Artery Catheter | Strategic Applications Inc. | RFA-01 | |
| Salix Furosemide 5% | Intervet | #34-478 | |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Student Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Surgical Gloves | Kimberly-Clark | Sterling Nitrile Gloves | |
| Syringe pump | Razel Scientific | R99-E | |
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 91121-12 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann Co | 105-420 | |
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar 3922 Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc. #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scale Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Gauze Sponges Covidien 2146 Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435 Pressure Transducer ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann Co 105-420 |
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References
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