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Biology

Fisiologia Lab Dimostrazione: filtrazione glomerulare in un ratto

doi: 10.3791/52425 Published: July 26, 2015

Protocol

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Prima di qualsiasi procedura animale, la cura degli animali e l'uso comitato istituzionale (IACUC) deve approvare il protocollo. Questo protocollo è stato approvato dalla Michigan State University IACUC.

1. Preparazione Pre-lab di FITC-inulina Solution

  1. Warm 20 ml di soluzione salina a 70 ° C e agitare lentamente in 100 mg di FITC-inulina (5 mg / ml FITC-inulina) finché tutto inulina è disciolto.
  2. Soluzione Raffreddare a RT e aggiungere 800 mg di albumina sierica bovina (40 mg / ml BSA, polvere liofilizzata, essenzialmente globulina, basso endotossina, ≥98% di purezza mediante elettroforesi su gel di agarosio).
  3. Filtrare la soluzione di inulina-BSA con carta da filtro (grado 1). Mettere la soluzione filtrata in una siringa da 20 ml con un filtro a siringa punta (0,2 micron) e coprire con un foglio al riparo dalla luce.

2. Anestesia e Chirurgia

  1. Posizionare il ratto in una camera di induzione riempita con 5% isoflurano per indurre anestesia. Record bodpeso y (250-350 g) e posizionare il ratto su una piattaforma chirurgica riscaldato progettato per mantenere la temperatura corporea di 37 ° C tutto l'esperimento. Garantire delicatamente il topo alla piattaforma con del nastro di laboratorio sulle zampe. Mantenere anestesia con 1-2% isoflurano con grado medico di 100% O 2 al flusso d'aria di 0,8-1,0 L / min.
  2. Inserire un catetere conica (OD punta intravascolare, 2.7F) nell'arteria femorale per la pressione sanguigna e il monitoraggio della frequenza cardiaca, e il prelievo di sangue.
  3. Inserire un catetere (PE-50) nella vena femorale per inulina infusione. Fissare il catetere al tessuto con 5-O seta intrecciata sutura chirurgica 6 circostante.
  4. Fissare il catetere arterioso ad un trasduttore di pressione estensimetri. Registrare la pressione sanguigna e la frequenza cardiaca utilizzando software di acquisizione dei dati e la visualizzazione sullo schermo di un computer in tempo reale. Questa tecnica è illustrata in dettaglio in video 6.
  5. Esporre la vescica attraverso un'incisione sovrapubica. Tagliare un piccoloforo nella punta della vescica e inserire una cannula (PE-190) con un calore svasate punta all'interno della vescica per la raccolta delle urine. Fissare la cannula alla vescica con una sutura a borsa di.

3. urine e il prelievo di sangue

  1. Posizionare la siringa di FITC-inulina in una pompa a siringa con portata regolata di 1 ml / h per 100 g di peso corporeo (3 ml / h per un topo peso 300 g). Attaccare la siringa al catetere vena femorale. Avviare l'infusione di inulina e consentire un periodo di equilibrio 1-2 ore. Tenere la siringa ricoperto di un foglio al riparo dalla luce.
  2. Determinare se il flusso urinario è stabile e adeguata per l'analisi del campione (20 microlitri / min) per raccogliere un campione di urina in una fiala di raccolta pre-pesato per un periodo di 10 min. Determinazione del volume di urina metodo gravimetrico con una bilancia digitale. Un volume di urina adeguata per un periodo di raccolta 10 minuti è di 0,2 ml. Continuare a raccogliere campioni di urina fino a due collezioni consecutivi indicano un flusso di urina di 20 l / min o più.
  3. Campioni Pre-droga
    1. Raccogliere un campione di urina nel corso di un periodo di 20 min. Raccogliere un campione di sangue (0,5 ml) dal catetere arterioso a metà del periodo di raccolta delle urine. Fare attenzione a cancellare completamente il catetere arterioso di soluzione fisiologica prima di raccogliere un campione di sangue in una fiala di raccolta contenente 1 U eparina. Utilizzare fiale raccolta con marcature volume per facilitare la raccolta di 0,5 ml di sangue arterioso.
    2. Lavare il catetere arterioso con eparina-salina (20 U / ml) per cancellare il catetere di sangue (circa 0,1 ml.). La lunghezza del catetere arterioso deve essere il più breve possibile per limitare il volume di eparina-salina necessaria per irrigare.
      Nota: i campioni di sangue diluito producono calcoli imprecisi di GFR e l'escrezione frazionale di Na e K.
    3. Attendere 10 minuti, e ripetere la raccolta di una seconda urina pre-droga e campione di sangue.
  4. Dopo la raccolta di due campioni pre-droga, amministrare un dru diureticog, furosemide (10 mg / kg), tramite il catetere arterioso. Lavare il catetere arterioso con soluzione salina eparinizzata per cancellare il catetere di droga. Fare attenzione per evitare l'immissione di aria attraverso il catetere arterioso. Registrare il tempo di iniezione furosemide.
  5. Campioni post-farmaco: Ad ognuno dei 3 punti di tempo indicati, raccogliere un campione di urina durante un periodo di raccolta 10 min, e un campione di sangue (0,5 ml) a metà del periodo di raccolta delle urine.
    1. Per il campione post-Drug 1 - raccogliere cinque minuti dopo furosemide.
    2. Per il campione post-Drug 2 - raccogliere dieci minuti dopo furosemide.
    3. Per il campione post-Drug 3 - raccogliere quindici minuti dopo la furosemide.
  6. Dopo che tutti i campioni sono stati raccolti, eutanasia il ratto secondo procedure istituzionali da toracotomia e la rimozione del cuore. Rimuovere entrambi i reni. Decapsulate (rimuovere la membrana che circonda) e asciugare i reni per rimuovere il sangue in eccesso. Pesare i reni.

  1. Misurare tutti i volumi di campione di urina con metodo gravimetrico con una bilancia digitale, e pesi record.
  2. Campioni di centrifuga di sangue intero con una centrifuga da tavolo (1.800 xg) per separare il plasma. Trasferire campioni di plasma di piccole fiale etichettate.
  3. Analizzare le concentrazioni di Na e K in campioni di urina e di plasma con un analizzatore di sodio / potassio.
  4. Misura di FITC-inulina nel plasma e nelle urine
    1. Diluire urina pre-droga (da 1: 200 a 1: 400), e nelle urine post-droga (1,10) con tampone HEPES (500 mM, pH 7,4).
    2. Aggiungere 40 ml di microlitri standard o campione e 60 di tampone HEPES in una piastra da 96 pozzetti (un campione per pozzetto) e lasciare mescolare per 10 minuti mentre coperto con un foglio di alluminio.
    3. Generare una curva standard per FITC-inulina per le concentrazioni di 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug / ml (Figura 1). Determinare FITC-inulina fluorescenza in campioni e standard utilizzando un lettore di micropiastre con l'excitazioni e di emissione lunghezze d'onda di 485 e 538 nm, rispettivamente.
    4. Montare i valori fluorescenti per gli standard di un 4 Parametro analisi di regressione funzione logistica. I parametri della funzione di regressione sono utilizzati per calcolare la concentrazione FITC-inulina in campioni di plasma ed urina (Tabella 1).

5. Post-laboratorio Analisi dei risultati: Calcoli

  1. Calcola urina Portata (UV; ml / min): [volume di urina raccolto (ml)] ÷ [momento della raccolta (min)]
  2. Calcola velocità di filtrazione glomerulare (GFR; ml / min): [concentrazione inulina Urina (mg / ml) x UV (ml / min)] ÷ [plasma inulina conc. (Mg / ml)]
  3. Calcola filtrata carico di sodio (mmol / min): concentrazione di sodio al plasma (mmol / ml) x GFR (ml / min)
  4. Calcola sodio escrezione Rate (U Na V; mmol / min): concentrazione di sodio Urina (mmol / ml) x UV (ml / min)
  5. Calcola frazionale escrezione di sodio (Na FE;%): [U Na V (mmol / min)] ÷ [filtrato sodio Load (mmol / min)] x 100
  6. Calcola carico filtrato di potassio (mmol / min): la concentrazione di potassio del plasma (mmol / ml) x GFR (ml / min)
  7. Calcola potassio escrezione Rate (U K V; mmol / min): concentrazione di potassio Urina (mmol / ml) x UV (ml / min)
  8. Calcola frazionale escrezione di potassio (FE K;%): [U K V (mmol / min)] ÷ [filtrato carico di potassio (mmol / min)] x 100

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Representative Results

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Il diuretico usato nella dimostrazione laboratorio era furosemide che inibisce molto rapidamente il riassorbimento di Na e K filtrati dal rene con conseguente aumento Na, K, e l'escrezione dell'acqua entro minuti dalla somministrazione del farmaco. Con il suo meccanismo primario, furosemide dovrebbe avere effetti minimi sul GFR e il carico filtrato di Na e K, ma aumenterà il flusso di urina, e l'escrezione frazionale di Na e K.

I risultati rappresentativi in Tabella 3 mostrano che in un ratto anestetizzato, la media dei valori pre-farmacologici per GFR è stata di 3,2 ml / min, Na escrezione è 0,58 mmol / min (0,1% del carico filtrato), e K escrezione era 4.4 mmol / min (27% del carico filtrato). Cinque minuti dopo furosemide (post-droga 1), GFR e il carico filtrato di Na e K non sono stati influenzati. Tuttavia, l'escrezione frazionata di Na aumentato al 11,5%, e l'escrezione frazionata di K aumentato al 63% dei rispettivi carichi filtrati. Le misure di MAP e HR indicano che furosemide ha avuto effetti minimi sul MAP e HR (Tabella 2).

Gli indici di funzionalità renale valutati nella dimostrazione laboratorio erano la GFR, definito come il tasso con cui il plasma viene filtrata dal rene; Na filtrato e K, definito come il tasso con cui Na e K sono filtrati dal rene; Na e K Escrezione Rate, definito come il tasso con cui Na e K sono escreti per via renale; e l'escrezione frazionata di Na e K, definito come la percentuale di filtrato Na e K che è escreta dal rene

Figura 1
Figura 1: valori. Inulina curva standard FITC fluorescenza sono mostrate per standard contenenti 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200 e 400 ug / ml di inulina. Un'analisi funzione di regressione logistica a 4 Parametro genera la curva di best-fit. I parametri della funzione di regressione di questa curva sono stati usati per calcolare FIConcentrazione TC-inulina in campioni di plasma e nelle urine.

HT "> 1.208,9
FITC-inulina fluorescenza Concentrazione Risultato
Standard replicare 1 replicare 2 Significare ug / ml Diluizione ug / ml
Vuoto 63,9 64.8 64,4 0.4 1 0.4
6.25 253,2 264,1 258,7 5.9 1 5.9
12.5 474.0 </ Td> 491,3 482,7 12.5 1 12.5
25 854,8 881,3 868,1 24.4 1 24.4
50 1.617,1 1.618,0 1.617,6 50.3 1 50.3
100 2.813,1 2.846,1 2.829,6 101.3 1 101.3
200 4.367,3 4.588,7 4.478,0 198,2 1 198,2
400 6.258,0 6.650,0 6.454,0 401,6 1 401,6
Urine Sample
Pre-droga 1 2.443,9 2.062,3 2.253,1 88.5 200 17700
Pre-droga 2 2.266,5 1.707,0 1.986,8 76.3 200 15250
Post-droga 1 1.391,2 1.300,1 44.7 10 447
Post-droga 2 2.753,4 2.120,5 2.437,0 97.0 10 970
Post-droga 3 2.888,3 3.178,0 3.033,2 124,4 10 1244

Tabella 1:. Risultati del campione di valori di fluorescenza inulina Assay FITC-inulina sono indicati per il bianco reagente, standard 7 e 5 campioni di urina. Norme e campioni sono stati analizzati in duplicato e diluiti, se necessario. La fluorescenza media per ciascun campione è stato utilizzato per calcolare la concentrazione di inulina. Le concentrazioni di inulina in questi campioni di urina sono inclusi nella tabella di misurazioni (Tabella 2).

Tabella 2
Tabella 2: misurazioni registrate durante la funzione renale Lab Dimostrazione Le variabili registrate durante cinque periodi di tempo (due pre-droga e tre post-droga) della renale laboratorio funzione dimostrativa sono a destra ea sinistra il peso del rene, la pressione arteriosa media (MAP),. frequenza cardiaca (HR), tempo di campionamento, volume di urina, plasma ed urina di sodio (Na), potassio (K), e le concentrazioni di inulina. Le concentrazioni inulina urina sono stati determinati dal saggio inulina mostrato in Tabella 1.

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Tabella 3:. Parametri di funzionalità renale in base a misurazioni registrate utilizzando le formule riportate nella Sezione protocollo 5, le variabili rilevate (tabella 2) sono usati per calcolare l'urina portata, velocità di filtrazione glomerulare (GFR), peso GFR / g rene, tasso di escrezione , carico filtrato, e l'escrezione frazionale di sodio (Na) e potassio (K) nei due pre-farmaco e tre periodi post-farmaco.

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Discussion

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Un indicatore adeguato per la misura GFR devono soddisfare quattro criteri: essere liberamente filtrato a livello glomerulare, essere non legato alle proteine ​​plasmatiche, e né essere assorbiti né secreto nel nefrone. L'inulina è un polimero di fruttosio che soddisfa questi criteri. Come risultato, la clearance renale dell'inulina è considerato lo standard per misurare GFR 7. La tecnica dimostrata rappresenta l'approccio tradizionale di determinare la clearance renale di inulina utilizzando raccolta delle urine temporizzate durante un'infusione costante di inulina 8,9. Misurazioni inulina tradizionali sono state effettuate utilizzando il metodo antrone per produrre una determinazione colorimetrica quantitativa di inulina misurata allo spettrofotometro 10,11. Tuttavia, nel tentativo di facilitare la misurazione di inulina in piccoli volumi di urina e plasma, inulina è stato etichettato con radioattivi 12-14, e 15-17 etichette fluorescenti. La dimostrazione di laboratorio presentato in questo video used FITC etichettato inulina per la misurazione della funzionalità renale a causa della mancanza di rischio di esposizione a radiazioni umana e la facilità di misurare la fluorescenza FITC 15.

Questa dimostrazione di laboratorio ha lo scopo di fornire una comprensione concettuale di come misurare la funzionalità renale a studenti con minime competenze di laboratorio. Pertanto, la preparazione pre-lab di soluzione FITC-inulina, e preparazione chirurgica degli animali sono effettuate da tecnici esperti prima dell'inizio della manifestazione. Gli studenti arrivano per la manifestazione alla fine del periodo di inulina equilibrio 1-2 ore. A questo punto, gli studenti sono presentati con una panoramica Pre-laboratorio e informati delle procedure che sono stati condotti sugli animali. Due studenti sono assegnati a un esperimento animale, e istruiti su come raccogliere campioni di sangue e urine prima e dopo la somministrazione del farmaco diuretico. L'analisi dei campioni di sangue e urine è condotta da experietecnici e risultati NCED vengono consegnati agli studenti per i calcoli di funzionalità renale. I risultati sono presentati nel corso di una discussione post-laboratorio che può essere programmata dopo la manifestazione.

Ci sono diversi passaggi critici all'interno del protocollo per assicurare risposte valide. In primo luogo, FITC inulina deve essere completamente sciolto e filtrato prima della somministrazione animale. Idealmente, FITC inulina deve essere dializzato in acqua per 48 ore a temperatura ambiente per eliminare residui di FITC non legato. In secondo luogo, i campioni di plasma devono essere privi di soluzione salina. Gli studenti sono incaricati di raccogliere un campione di sangue solo dopo che tutte le saline nel catetere arterioso sono stati espulsi e solo il sangue scorre fuori del catetere. I campioni di sangue che vengono diluiti con soluzione fisiologica fornirà valori accurati per inulina plasma, sodio e potassio. In terzo luogo, il flusso di urina deve essere costante e sufficiente per produrre abbastanza campione per l'analisi. Una portata costante urine al basale è critica perché è un'indicazioneuna preparazione sperimentale stabile. Se il flusso di urina è troppo bassa, la velocità di infusione di inulina può essere aumentata prima campionare collezioni. Tuttavia, l'infusione di inulina deve essere costante durante il corso dell'esperimento, cioè, inulina velocità di infusione non deve essere regolato durante l'esperimento. Infine, la misura di inulina fluorescenza in campioni di plasma ed urina dal lettore di micropiastre è fondamentale per un esperimento riuscito. Poiché le specifiche del lettore di micropiastre determinerà se campioni richiedono diluizioni, si raccomanda un test del saggio inulina essere condotto prima della manifestazione laboratorio nel tentativo di ottimizzare le caratteristiche del lettore di micropiastre e garantiscono che i valori campione fluorescenza sono all'interno del mid-range della curva standard.

Mentre la valutazione della funzione renale in base alla clearance renale di inulina è considerato il gold standard, questa tecnica ha limiti, perché gli animali devono essere anestetizzati, estrumentato con vascolari e cateteri vescicali. Agenti Anesthethetic hanno dimostrato di influenzare l'emodinamica renale e GFR 18,19; tuttavia isoflurano e inactin sono tipicamente utilizzati in esperimenti di funzionalità renale a causa dei loro effetti minimi sul rene 19,20. La tecnica di depurazione inulina richiede anche un'infusione costante di campioni di inulina e di sangue e di plasma multiple che possono essere proibitivi in ​​animali più piccoli, come i topi. Modifiche di questa tecnica sono stati sviluppati per consentire la misurazione della clearance plasmatica da una singola iniezione di inulina in animali coscienti 21. Tali modifiche richiedono anche piccoli volumi di campioni di sangue per l'analisi, e forniscono un metodo alternativo per valutare la funzione renale nei topi.

La misura della funzione renale è applicabile a studi di fisiologia, patologia, tossicologia, farmacologia e la malattia gli stati. Gli studenti che partecipano al Function manifestazione renale impareranno tegli tecnica gold standard di clearance renale di inulina per valutare la funzionalità renale. Per padroneggiare questa tecnica, gli studenti comprendere i principi di funzionalità renale e consentire loro di applicare la tecnica per la propria attività di ricerca e di determinare se le modifiche alla tecnica sono adatti per i loro studi.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. I pareri o le affermazioni contenute nel presente documento sono le opinioni personali dell'autore e non sono da intendersi come ufficiale o come riflesso le opinioni del Dipartimento dell'Esercito o il Dipartimento della Difesa.

Acknowledgments

La fonte di finanziamento per la dimostrazione laboratorio era NIGMS concessione: GM077119. Ringraziamo il Dr. Joseph R. Haywood e il Dr. Peter Cobbett per il loro supporto Short Couse in Integrativa e organo Sistemi Farmacologia. Ringraziamo anche la signora Hannah Garver per il suo supporto tecnico della manifestazione laboratorio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033
Assay Plate, 96-Well Costar  3922
Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G
Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160
Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc.  #711-FTG
Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200
Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0
Digital Scale  Denver Instrument APX-4001
FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G
Gauze Sponges Covidien 2146
Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212
Heparin Sagnet NDC 25021-402-10
HEPES Sigma Chemical Co H3375
Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05
Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F
Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020
Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460
NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156
Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12
PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435
Pressure Transducer  ADInstruments MLT1199
Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12
Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01
Salix Furosemide 5% Intervet #34-478
Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11
Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12
Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves
Syringe pump Razel Scientific R99-E
Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12
Tissue Scissors George Tiemann  Co 105-420

5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar  3922 Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc.  #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scale  Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Gauze Sponges Covidien 2146 Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435 Pressure Transducer  ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann  Co 105-420

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References

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Hinojosa-Laborde, C., Jespersen, B., Shade, R. Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat. J. Vis. Exp. (101), e52425, doi:10.3791/52425 (2015).More

Hinojosa-Laborde, C., Jespersen, B., Shade, R. Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat. J. Vis. Exp. (101), e52425, doi:10.3791/52425 (2015).

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