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Biology

Laboratório de Fisiologia Demonstração: Taxa de filtração glomerular em um Rat

Published: July 26, 2015 doi: 10.3791/52425

Protocol

Antes de qualquer procedimento animal, o cuidado com os animais e uso comitê institucional (IACUC) deve aprovar o protocolo. Este protocolo foi aprovado pela Michigan State University IACUC.

1. Preparação de pré-laboratório de solução de FITC-inulina

  1. Aqueça 20 ml de solução salina a 70 ° C e agita-se lentamente em 100 mg de FITC-inulina (5 mg / ml de FITC-inulina) de inulina é até que todo dissolvido.
  2. Solução arrefecer até à TA e adicionar 800 mg de albumina de soro de bovino (40 mg / ml de BSA, em pó liofilizada, essencialmente livre globulina, baixa endotoxina, ≥98% de pureza por electroforese em gel de agarose).
  3. Filtra-se a solução de inulina-BSA com papel de filtro (grau 1). Coloque a solução filtrada em uma seringa de 20 ml com um filtro de seringa com ponta (0,2 um) e cobrir com folha de a proteger da luz.

2. Anestesia e Cirurgia

  1. Coloque o rato em uma câmara de indução preenchido com 5% de isoflurano para induzir a anestesia. Grave bodpeso y (250-350 g) e colocar o rato numa plataforma cirúrgica aquecido concebido para manter 37 ° C a temperatura do corpo durante todo o experimento. Segurar cuidadosamente o rato para a plataforma com fita de laboratório sobre as patas. Manter a anestesia com 1-2% de isoflurano com classe médica 100% O 2 a taxa de fluxo de ar de 0,8-1,0 L / min.
  2. Inserir um cateter cônico (OD ponta intravascular, 2.7F) na artéria femoral para pressão arterial e monitoramento da freqüência cardíaca, e coleta de sangue.
  3. Inserir um cateter (PE-50) na veia femoral para infusão de inulina. Prenda o cateter ao tecido com 5-O trançado de seda de sutura cirúrgica 6 circundante.
  4. Fixe o cateter arterial a um transdutor de pressão calibre de tensão. Pressão arterial e freqüência cardíaca registro usando o software de aquisição de dados e exibição em uma tela de computador em tempo real. Esta técnica é demonstrado em detalhe em vídeo 6.
  5. Expor a bexiga através de uma incisão suprapúbica. Corte um pequenoorifício na ponta da bexiga e da inserção de uma cânula (PE-190) com uma ponta de calor queimado no interior da bexiga para a recolha de urina. Fixe a cânula para a bexiga com uma sutura em bolsa.

3. urina e coleta de sangue

  1. Colocar a seringa de FITC-inulina em uma bomba de seringa com velocidade de fluxo definido de 1 ml / h por 100 g de peso corporal (3 ml / h durante um rato pesando 300 g). Fixe a seringa para o cateter na veia femoral. Iniciar a infusão de inulina e permitir um período de equilíbrio de 1-2 horas. Manter seringa coberto de uma camada para proteger da luz.
  2. Determinar se o ritmo de fluxo de urina é estável e adequado para a análise de amostras (20 ul / min) através da recolha de uma amostra de urina de uma pré-pesados ​​para um frasco de recolha período de 10 min. Determinar o volume de urina por gravimetria com uma balança digital. Um volume de urina suficiente durante um período de recolha de 10 min é de 0,2 ml. Continuar a recolher amostras de urina até duas coleções consecutivos indicam uma taxa de fluxo de urina de 20 l / mou mais.
  3. Amostras pré-droga
    1. Recolher uma amostra de urina durante um período de 20 min. Recolher uma amostra de sangue (0,5 ml) a partir do cateter arterial, no ponto médio do período de recolha de urina. Tenha o cuidado de limpar completamente o cateter arterial de solução salina antes de coletar uma amostra de sangue em um frasco contendo uma coleção U heparina. Use frascos de coleta com marcações de volume para facilitar a recolha de 0,5 ml de sangue arterial.
    2. Lave o catéter arterial com heparina-solução salina (20 U / mL) para limpar o cateter de sangue (aprox. 0,1 mL). O comprimento do cateter arterial deve ser tão curto quanto possível, para limitar o volume de solução salina de heparina-necessária para descarregar.
      Nota: as amostras de sangue diluído produzir cálculos imprecisos de TFG e excreção fracionada de Na e K.
    3. Aguarde 10 minutos e repita a cobrança de uma segunda urina Pré-drogas e amostra de sangue.
  4. Após a coleta de duas amostras de pré-droga, administrar um diurético drug, a furosemida (10 mg / kg), através do cateter arterial. Lave o cateter arterial com solução salina heparinizada para limpar o cateter de drogas. Ter o cuidado de evitar a injecção de ar através do cateter arterial. Anote o tempo da injeção de furosemida.
  5. As amostras post-droga: Em cada um dos três pontos de tempo a seguir, recolher uma amostra de urina durante um período de recolha de 10 min, e uma amostra de sangue (0,5 ml) no ponto médio do período de recolha de urina.
    1. Para Sample Post-Drogas 1 - coletar cinco minutos após a furosemida.
    2. Para Post-Drogas Amostra 2 - recolher dez minutos após a furosemida.
    3. Para Sample Post-Drogas 3 - recolher quinze minutos após a furosemida.
  6. Depois de todas as amostras foram coletadas, eutanásia do rato em conformidade com os procedimentos institucionais por toracotomia e remoção do coração. Remova ambos os rins. Decapsulate (remover a membrana que envolve) e apagar os rins para remover o excesso de sangue. Pesar os rins.

  1. Meça todos os volumes de amostras de urina por gravimetria com uma balança digital, e pesos recordes.
  2. Amostras de sangue total de centrifugação, utilizando uma centrífuga de bancada (1800 x g) para separar o plasma. Transferir as amostras de plasma para pequenos frascos rotulados.
  3. Analisar as concentrações de sódio e potássio em amostras de urina e plasma com um analisador de sódio / potássio.
  4. Medição de FITC-inulina no plasma e urina
    1. Dilui-se a urina de pré-droga (de 1: 200 a 1: 400), e na urina pós-fármaco (1:10) com tampão HEPES (500 mM, pH 7,4).
    2. Adicionar 40 ul de padrão ou de amostra ul e 60 de tampão HEPES numa placa de 96 cavidades (uma amostra por cavidade) e deixa-se misturar durante 10 min enquanto se coberto com folha de alumínio.
    3. Gerar uma curva padrão para FITC-inulina, relativamente às concentrações de 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug / ml (Figura 1). Determinar a fluorescência de FITC-inulina em amostras e padrões usando um leitor de microplacas com excitação e comprimentos de onda de emissão de 485 e 538 nm, respectivamente.
    4. Encaixe os valores fluorescentes para os padrões de uma análise de regressão função logística de 4 paramter. Os parâmetros da função de regressão são usados ​​para calcular a concentração de FITC-inulina em amostras de plasma e de urina (Tabela 1).

5. Pós-laboratório Análise de Resultados: Cálculos

  1. Calcular Urina Taxa de Fluxo (UV; ml / min): [volume de urina recolhida (ml)] ÷ [tempo da recolha (min)]
  2. Calcular Taxa de Filtração Glomerular (GFR; ml / min): [a concentração de inulina urina (ug / ml) x UV (ml / min)] ÷ [inulina conc plasma. (Ug / ml)]
  3. Calcular filtrada Carga de sódio (pmol / min): concentração de sódio no plasma (nmol / ml) x TFG (ml / min)
  4. Calcular excreção de sódio Classificação (U Na V; umol / min): concentração de sódio na urina (pmol / ml) x UV (ml / min)
  5. Calcule Fractional excreção de sódio (FE Na;%): [L Na V (pmol / min)] ÷ [Carga de sódio filtrado (pmol / min)] x 100
  6. Calcular carga filtrada potássio (pmol / min): a concentração de potássio no plasma (nmol / ml) x TFG (ml / min)
  7. Calcular excreção de potássio Classificação (L K V; umol / min): concentração de potássio da urina (pmol / ml) x UV (ml / min)
  8. Calcule Fractional excreção de potássio (K FE;%): [U K V (mmol / min)] ÷ [Load potássio filtrado (mmol / min)] x 100

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Representative Results

O diurético usado no laboratório demonstração foi furosemida que muito rapidamente inibe a reabsorção de Na e K filtrada pelo rim, resultando em aumento de Na, K, e a excreção de água dentro de minutos após a administração da droga. Por seu mecanismo primário, furosemida deve ter efeitos mínimos sobre a TFG e da carga filtrada de Na e K, mas vai aumentar o fluxo de urina, e fração de excreção de Na e K.

Os resultados representativos da Tabela 3 mostram que, num rato anestesiado, a média dos valores pré-droga para GFR foi de 3,2 ml / min, excreção de Na foi de 0,58 umol / min (0,1% da carga filtrada), e excreção de K foi de 4,4 umol / min (27% da carga filtrada). Cinco minutos após a furosemida (pós-droga 1), TFG e a carga filtrada de Na e K não foram afectadas. No entanto, a excreção fraccionada de Na aumentou para 11,5%, e a excreção fraccionada de K aumentou para 63% das respectivas cargas filtrados. As medidas do MAP e HR indicam que a furosemida teve efeitos mínimos sobre PAM e FC (Tabela 2).

Os índices da função renal avaliada no laboratório foram demonstração da TFG, definida como a taxa pela qual o plasma é filtrado pelo rim; o Na filtrado e K, definida como a taxa de Na e K, que são filtrados através dos rins; a excreção de Na e K Classificação, definida como a taxa de Na e K, que são excretados pelo rim; e a excreção fraccionada de Na e K, definida como a percentagem de filtrado Na e K que é excretada pelos rins

Figura 1
Figura 1: valores de FITC de fluorescência. A inulina curva padrão são mostrados para os padrões contendo 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200 e 400 ug / ml de inulina. A análise de regressão função logística de 4 paramter gera a melhor curva. Os parâmetros da função de regressão a partir desta curva foram usadas para calcular FIConcentração TC-inulina em amostras de plasma e urina.

ht "> 1208,9
FITC-inulina fluorescência Concentração Resultado
Padrão replicar 1 replicar 2 Significar ug / ml Diluição ug / ml
Em branco 63,9 64,8 64,4 0,4 1 0,4
6.25 253.2 264.1 258,7 5.9 1 5.9
12,5 474,0 </ Td> 491.3 482,7 12,5 1 12,5
25 854,8 881,3 868,1 24,4 1 24,4
50 1.617,1 1.618,0 1.617,6 50,3 1 50,3
100 2.813,1 2.846,1 2.829,6 101.3 1 101.3
200 4.367,3 4.588,7 4.478,0 198.2 1 198.2
400 6.258,0 6.650,0 6.454,0 401,6 1 401,6
Amostra de urina
Pré-fármaco 1 2.443,9 2.062,3 2.253,1 88,5 200 17700
Pré-droga 2 2.266,5 1.707,0 1.986,8 76,3 200 15250
Post-droga 1 1.391,2 1.300,1 44,7 10 447
Post-droga 2 2.753,4 2.120,5 2.437,0 97,0 10 970
Post-droga 3 2.888,3 3.178,0 3.033,2 124,4 10 1244

Tabela 1:. Resultados da Amostra dos valores de fluorescência FITC-inulina Ensaio inulina são mostrados para o reagente em branco, 7 padrões, e cinco amostras de urina. Padrões e amostras foram ensaiadas em duplicado e diluiu-se conforme necessário. A fluorescência média de cada amostra foi utilizada para calcular a concentração de inulina. As concentrações de inulina nestas amostras de urina são incluídos na tabela de medições (Tabela 2).

Tabela 2
Tabela 2: Medidas gravados durante o Lab Função Renal Demonstração As variáveis ​​verificadas durante cinco períodos de tempo (dois pré-droga e três pós-droga) da função renal demonstração laboratório são peso do rim direito e esquerdo, pressão arterial média (PAM),. frequência cardíaca (FC), o tempo da amostra, volume de urina, plasma e urina de sódio (Na), potássio (K), e as concentrações de inulina. As concentrações de inulina de urina foram determinados a partir do ensaio de inulina mostrado na Tabela 1.

25table3.jpg "/>
Tabela 3: parâmetros da função renal. Calculados a partir de medições gravadas usando as fórmulas indicadas no Protocolo Seção 5, as variáveis ​​registradas (Tabela 2) são usados ​​para calcular a urina fluxo, taxa de filtração glomerular (TFG), peso TFG / g renal, taxa de excreção , carga filtrada, e excreção fraccionada de sódio (Na) e potássio (K) nos dois pré-droga e três períodos pós-droga.

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Discussion

Um marcador apropriado para a medição de GFR deve atender quatro critérios: ser livremente filtrada no glomérulo, ser independente para proteínas do plasma, e nem ser absorvido nem secretada no néfron. A inulina é um polímero de frutose, que satisfaz estes critérios. Como resultado, a depuração renal da inulina é considerada o padrão ouro para medir GFR 7. A técnica demonstrada representa a abordagem tradicional da determinação da eliminação renal de inulina utilizando recolhas de urina cronometrados durante uma infusão constante de inulina 8,9. Medições inulina tradicionais foram feitas usando o método de antrona para produzir uma determinação colorimétrica quantitativa de inulina medidos com um espectrof otómetro 10,11. Contudo, numa tentativa de facilitar a medição da inulina no menor volume de urina e no plasma, de inulina foi marcado com radioactivo 12-14, e marcadores fluorescentes 15-17. A demonstração laboratório apresentada neste vídeo used marcado com FITC de inulina, para a medição da função renal devido à ausência de risco de exposição à radiação humana e a facilidade de medição de fluorescência 15 de FITC.

Esta demonstração laboratório destina-se a fornecer uma compreensão conceitual de como medir a função renal para os alunos com habilidades laboratoriais mínimos. Por conseguinte, a preparação pré-laboratório de solução de FITC-inulina, e a preparação cirúrgica dos animais são realizadas por técnicos experientes antes do início da manifestação. Os alunos chegam para a demonstração no final do período de equilibração de inulina 1-2 h. Neste momento, os alunos são apresentados com uma visão pré-lab e informado dos procedimentos que foram realizados sobre os animais. Dois estudantes são atribuídas a um experimento animal, e instruídos sobre como coletar amostras de sangue e urina antes e depois da administração do fármaco diurético. A análise de amostras de sangue e de urina é conduzida por experietécnicos nç ada s e os resultados são entregues aos alunos para os cálculos da função renal. Os resultados são apresentados durante uma discussão pós-laboratório que pode ser agendada após a demonstração.

Há vários passos críticos no âmbito do protocolo para segurar respostas válidas. Em primeiro lugar, FITC inulina deve ser completamente dissolvido e filtrou-se, antes da administração animal. Idealmente, deve ser inulina FITC dialisado em água durante 48 horas à temperatura ambiente para remover a FITC não ligado residual. Em segundo lugar, as amostras de plasma deve ser livre de soro fisiológico. Os alunos são instruídos a coletar uma amostra de sangue somente após toda a solução salina no cateter arterial foi expulso e só sangue está fluindo para fora do cateter. As amostras de sangue que são diluídos com solução salina irá proporcionar valores para imprecisos de inulina no plasma, de sódio e de potássio. Em terceiro lugar, o fluxo de urina deve ser constante e adequada para a produção de amostra suficiente para análise. Uma taxa de fluxo constante de urina na linha de base é fundamental, porque isto é uma indicação deuma preparação estável experimental. Se o fluxo de urina é demasiado baixo, a taxa de infusão de inulina pode ser aumentada antes de experimentar colecções. No entanto, a infusão de inulina tem de ser constante durante o curso da experiência, isto é, a taxa de infusão de inulina não deve ser ajustada durante a experiência. Finalmente, a medição de fluorescência em amostras de inulina no plasma e urina por leitor de microplacas é crítica para uma experiência de sucesso. Desde as especificações do leitor de microplacas irão determinar se as amostras exigem diluições, recomenda-se que o teste de funcionamento do ensaio de inulina ser realizada antes da demonstração de laboratório em um esforço para otimizar as especificações do leitor de microplacas e garantir que os valores de amostra de fluorescência são no meio da gama da curva padrão.

Enquanto a avaliação da função renal com base na depuração renal da inulina é considerada o padrão-ouro, esta técnica tem limitações porque os animais têm de ser anestesiado, einstrumentados com cateteres vasculares e da bexiga. Agentes Anesthethetic foram mostrados para afetar a hemodinâmica renal e TFG 18,19; no entanto isoflurano e inactina são tipicamente usados ​​em experiências de função renal devido aos seus efeitos mínimos sobre o rim 19,20. A técnica de depuração de inulina também exige uma infusão constante de amostras de sangue de inulina e múltiplos e plasma que pode ser proibitivo em pequenos animais, como ratos. Modificações desta técnica foram desenvolvidos para permitir a medição da depuração plasmática a partir de uma única injecção de inulina em animais conscientes 21. Estas alterações também requerem menores volumes de amostras de sangue para análise, e proporcionar um método alternativo para avaliar a função renal em ratinhos.

A medição da função renal é aplicável aos estudos de fisiologia, patologia, toxicologia, farmacologia e doença estados. Os estudantes que participam na manifestação da Função Renal vai aprender tele técnica padrão de depuração renal da inulina para avaliar a função renal. Ao dominar esta técnica, os alunos irão compreender os princípios da função renal e permitir-lhes aplicar a técnica para sua própria investigação e determinar se as modificações para a técnica são apropriadas para seus estudos.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. As opiniões ou afirmações contidas neste documento são os pontos de vista particulares do autor e não devem ser interpretadas como funcionário ou como refletindo os pontos de vista do Departamento do Exército ou do Departamento de Defesa.

Acknowledgments

A fonte de financiamento para a demonstração laboratório estava concessão NIGMS: GM077119. Agradecemos ao Dr. Joseph R. Haywood e Dr. Peter Cobbett pelo apoio do Short Couse em Integrative e Órgão Sistemas de Farmacologia. Agradecemos também a Senhora Hannah Garver por seu apoio técnico da demonstração laboratorial.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033
Assay Plate, 96-Well Costar  3922
Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G
Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160
Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc.  #711-FTG
Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200
Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0
Digital Scale  Denver Instrument APX-4001
FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G
Gauze Sponges Covidien 2146
Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212
Heparin Sagnet NDC 25021-402-10
HEPES Sigma Chemical Co H3375
Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05
Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F
Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020
Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460
NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156
Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12
PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435
Pressure Transducer  ADInstruments MLT1199
Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12
Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01
Salix Furosemide 5% Intervet #34-478
Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11
Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12
Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves
Syringe pump Razel Scientific R99-E
Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12
Tissue Scissors George Tiemann  Co 105-420

5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar  3922 Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc.  #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scale  Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Gauze Sponges Covidien 2146 Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435 Pressure Transducer  ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann  Co 105-420

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References

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Physiology 101 Edição rim de rato a taxa de filtração glomerular taxa de fluxo de urina excreção de sódio e potássio filtrada carga pressão arterial
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