Protocol
Avant toute procédure d'animaux, les soins des animaux et l'utilisation comité institutionnel (IACUC) doit approuver le protocole. Ce protocole a été approuvé par l'Université Michigan State IACUC.
1. Préparation pré-lab de Solution FITC-inuline
- Chaud 20 ml d'une solution saline à 70 ° C et agiter lentement à 100 mg de FITC-inuline (5 mg / ml de FITC-inuline) jusqu'à ce que toute l'inuline se dissout.
- Solution refroidir à température ambiante et ajouter 800 mg d'albumine de sérum bovin (40 mg / ml de BSA, de la poudre lyophilisée, essentiellement globuline libre, endotoxine faible, ≥98% de pureté par électrophorèse sur gel d'agarose).
- Filtrer la solution inuline-BSA avec du papier filtre (grade 1). Placer la solution filtrée dans une seringue de 20 ml avec un filtre seringue pointe (0,2 um) et couvrir de papier d'aluminium pour protéger de la lumière.
2. anesthésie et la chirurgie
- Placez le rat dans une chambre d'induction rempli avec 5% d'isoflurane pour induire une anesthésie. bod d'enregistrementpoids y (250-350 g) et de placer le rat sur une plate-forme chirurgicale chauffé conçu pour maintenir 37 ° C la température du corps pendant toute l'expérience. Sécuriser doucement le rat à la plate-forme avec la bande de laboratoire sur les pattes. Maintenir l'anesthésie avec 1-2% d'isoflurane avec qualité médicale 100% O 2 au taux de 0,8-1,0 L / min de débit d'air.
- Insérer un cathéter conique (pointe de OD intravasculaire, 2.7f) dans l'artère fémorale pour la pression artérielle et la surveillance de la fréquence cardiaque, et le prélèvement de sang.
- Insérer un cathéter (PE-50) dans la veine fémorale pour l'injection d'inuline. Fixez le cathéter aux tissus de soie tressée 5-O suture chirurgicale 6 environnante.
- Attacher le cathéter artériel à un transducteur de pression à jauge de contrainte. Enregistrez la pression artérielle et le rythme cardiaque en utilisant le logiciel d'acquisition de données et l'affichage sur un écran d'ordinateur en temps réel. Cette technique est démontrée en détail sur la vidéo 6.
- Exposer la vessie par une incision sus-pubienne. Coupez un petittrou dans la pointe de la vessie et d'insérer une canule (PE-190) avec une chaleur évasées pointe intérieur de la vessie pour la collecte d'urine. Fixez la canule à la vessie avec une suture en bourse.
3. L'urine et de prélèvement sanguin
- Placer la seringue de FITC-inuline dans une pompe à seringue avec un débit fixé de 1 ml / h pour 100 g de poids corporel (3 ml / h pour un rat pesant 300 g). Fixer la seringue au cathéter de la veine fémorale. Lancer la perfusion de l'inuline et de permettre une période d'équilibrage de 1-2 h. Gardez seringue recouverts d'une feuille de protéger de la lumière.
- Déterminer si le taux d'écoulement de l'urine est stable et appropriée pour l'analyse de l'échantillon (20 pl / min) en recueillant un échantillon d'urine dans un flacon pré-pesé collecte pendant une période de 10 min. Déterminer le volume d'urine par gravimétrie avec une échelle numérique. Un volume d'urine pendant une période adéquate de collecte de 10 min est de 0,2 ml. Continuer à prélever des échantillons d'urine jusqu'à ce que deux collections consécutives indiquent un taux de 20 pi / m d'écoulement d'urineou plus.
- Échantillons de pré-drogues
- Prélever un échantillon d'urine pendant une période de 20 min. Prélever un échantillon de sang (0,5 ml) à partir du cathéter artériel au point milieu de la période de collecte d'urine. Soyez prudent pour dégager complètement le cathéter artériel de solution saline avant de recueillir un échantillon de sang dans un flacon de collection contenant 1 U héparine. Utiliser les flacons de collecte avec des marques de volume pour faciliter la collecte de 0,5 ml de sang artériel.
- Rincer le cathéter artériel avec une solution saline à l'héparine (20 U / ml) pour effacer le cathéter de sang (env. 0,1 ml). La longueur du cathéter artériel doit être aussi court que possible afin de limiter le volume de solution saline à l'héparine requis pour rincer.
Remarque: des échantillons de sang dilué produisent des calculs inexacts de DFG et l'excrétion fractionnaire de Na et K. - Attendre 10 min, et répéter la collecte de l'urine une seconde pré-médicament et de l'échantillon de sang.
- Après la collecte de deux échantillons de pré-drogue, administrer un diurétique drug, furosémide (10 mg / kg), par l'intermédiaire du cathéter artériel. Rincer le cathéter artériel avec une solution saline héparinée pour effacer le cathéter de médicament. Faire attention à empêcher l'injection d'air à travers le cathéter artériel. Notez l'heure de l'injection de furosémide.
- Les échantillons post-médicaments: A chacun des points dans le temps 3 ci-dessous, de recueillir un échantillon d'urine pendant une période de collecte de 10 min, et un échantillon de sang (0,5 ml) au milieu de la période de collecte d'urine.
- Pour l'échantillon post-Drug 1 - recueillir cinq minutes après le furosémide.
- Pour l'échantillon post-Drug 2 - recueillir dix minutes après le furosémide.
- Pour l'échantillon post-Drug 3 - recueillir quinze minutes après le furosémide.
- Lorsque tous les échantillons ont été collectés, euthanasier le rat conformément aux procédures institutionnelles par thoracotomie et l'ablation du cœur. Retirez les deux reins. Décapsuler (retirer la membrane entourant) et efface les reins à éliminer l'excès de sang. Peser les reins.
- Mesurer tous les volumes d'échantillon d'urine par gravimétrie avec une balance numérique, et des poids records.
- Centrifugeuse échantillons de sang entier avec une centrifugeuse de table (1800 xg) pour séparer le plasma. Transférer des échantillons de plasma de petits flacons étiquetés.
- Analyser concentrations de Na et K dans les échantillons d'urine et de plasma avec un analyseur de sodium / potassium.
- Mesure de FITC-inuline dans le plasma et l'urine
- Diluer l'urine pré-drogue (de 1: 200 à 1: 400), et l'urine post-drogue (1:10) avec un tampon HEPES (500 mM, pH 7,4).
- Ajouter 40 pi de pi étalon ou d'échantillon et 60 de tampon HEPES dans une plaque de 96 puits (un échantillon par puits) et de permettre à mélanger pendant 10 min tout recouvert d'une feuille d'aluminium.
- Générer une courbe d'étalonnage pour FITC-inuline pour des concentrations de 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug / ml (Figure 1). Déterminer FITC-inuline fluorescence dans les échantillons et les normes en utilisant un lecteur de microplaques avec son excitations et d'émission des longueurs d'onde de 485 nm et 538, respectivement.
- Monter les valeurs fluorescents pour les normes à une fonction logistique analyse de régression de 4 paramter. Les paramètres de la fonction de régression sont utilisés pour calculer la concentration FITC-inuline dans des échantillons de plasma et d'urine (tableau 1).
5. Analyse post-laboratoire des résultats: Calculs
- Calculer urine Débit (UV; ml / min): [volume d'urine recueillis (ml)] ÷ [moment de la collecte (min)]
- Calculer débit de filtration glomérulaire (GFR; ml / min): [concentration d'inuline urine (pg / ml) x UV (ml / min)] ÷ [Plasma inuline conc. (Ug / ml)]
- Calculer la charge filtrée de sodium (pmol / min): concentration en sodium du plasma (umoles / ml) x DFG (ml / min)
- Calculer l'excrétion de sodium Taux (U Na V; pmol / min): la concentration de sodium dans l'urine (pmol / ml) x UV (ml / min)
- Calculer fractionnaire excrétion de sodium (FE Na;%): [U Na V (pmol / min)] ÷ [Charge de sodium filtré (pmol / min)] x 100
- Calculer la charge filtrée potassium (pmol / min): Plasma concentration de potassium (umol / ml) x DFG (ml / min)
- Calculer excrétion de potassium Taux (U K V; pmol / min): la concentration de potassium dans l'urine (pmol / ml) x UV (ml / min)
- Calculer fractionnaire excrétion de potassium (K FE;%): [U K V (pmol / min)] ÷ [Charge de potassium filtrée (pmol / min)] x 100
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Representative Results
Le diurétique utilisé dans la démonstration de laboratoire était furosémide qui inhibe très rapidement la réabsorption de Na et K filtré par le rein entraînant une augmentation de Na, K, et l'excrétion de l'eau dans les minutes suivant l'administration du médicament. Par son mécanisme primaire, furosémide devrait avoir des effets minimes sur GFR et la charge filtrée de Na et K, mais va augmenter le flux d'urine et l'excrétion fractionnaire de Na et K.
Les résultats représentatifs dans le tableau 3 montrent que, dans un rat anesthésié, la moyenne des valeurs pré-médicaments pour les GFR était de 3,2 ml / min, excrétion de Na était de 0,58 pmol / min (0,1% de la charge filtrée), et K excrétion était 4.4 umol / min (27% de la charge filtrée). Cinq minutes après le furosémide (post-médicament 1), GFR et la charge filtrée de Na et K ne sont pas affectées. Cependant, l'excrétion fractionnaire de Na augmenté à 11,5%, et l'excrétion fractionnaire de K a augmenté à 63% des charges filtrés respectifs. Les mesures de MAP et HR indiquer que le furosémide avait des effets minimes sur la carte et HR (tableau 2).
Les indices de la fonction rénale évalués dans la démonstration en laboratoire étaient la GFR, définie comme la vitesse à laquelle le plasma est filtré par les reins; filtré et le Na K, définie comme la vitesse à laquelle Na et K sont filtrés par les reins; l'excrétion de Na et K noter, défini comme le taux de Na et K qui sont excrétés par les reins; et l'excrétion fractionnaire de Na et K, définie comme le pourcentage de Na et K filtré qui est excrété par les reins
Figure 1: L'inuline valeurs standard. La courbe de fluorescence de FITC sont présentés pour les normes contenant 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200 et 400 pg / ml d'inuline. Une analyse logistique fonction de régression de 4 paramter génère la courbe de meilleur ajustement. La fonction de régression paramètres de cette courbe ont été utilisés pour calculer FIConcentration TC-inuline dans des échantillons de plasma et d'urine.
| FITC-inuline fluorescence | Concentration | Résultat | ||||
| Standard | répliquer 1 | répliquer 2 | Signifier | ug / ml | Dilution | ug / ml |
| Vide | 63,9 | 64,8 | 64,4 | 0,4 | 1 | 0,4 |
| 6,25 | 253,2 | 264,1 | 258,7 | 5.9 | 1 | 5.9 |
| 12,5 | 474,0 </ Td> | 491,3 | 482,7 | 12,5 | 1 | 12,5 |
| 25 | 854,8 | 881,3 | 868,1 | 24,4 | 1 | 24,4 |
| 50 | 1617,1 | 1618,0 | 1617,6 | 50,3 | 1 | 50,3 |
| 100 | 2813,1 | 2846,1 | 2829,6 | 101,3 | 1 | 101,3 |
| 200 | 4367,3 | 4588,7 | 4478,0 | 198,2 | 1 | 198,2 |
| 400 | 6258,0 | 6650,0 | 6454,0 | 401,6 | 1 | 401,6 |
| Échantillon d'urine | ||||||
| Pré-médicament 1 | 2443,9 | 2062,3 | 2253,1 | 88,5 | 200 | 17700 |
| Pré-drogue 2 | 2266,5 | 1707,0 | 1986,8 | 76,3 | 200 | 15250 |
| Post-médicament 1 | ht "> 1208,91391,2 | 1300.1 | 44,7 | 10 | 447 | |
| Post-drogue 2 | 2753,4 | 2120,5 | 2437,0 | 97,0 | 10 | 970 |
| Post-drogues 3 | 2888,3 | 3178,0 | 3033,2 | 124,4 | 10 | 1244 |
Tableau 1:. Résultats des échantillons de valeurs de fluorescence inuline Assay FITC-inuline sont présentés pour le blanc réactif, 7 normes, et 5 échantillons d'urine. Étalons et les échantillons ont été dosés en double et diluées au besoin. La fluorescence moyenne de chaque échantillon a été utilisé pour calculer la concentration de l'inuline. Les concentrations d'inuline dans ces échantillons d'urine sont inclus dans le tableau de mesures (tableau 2).
Tableau 2: mesures enregistrées au cours de la fonction rénale Lab démonstration Les variables enregistrées au cours de cinq périodes de temps (deux pré-drogue et trois post-médicament) de la fonction rénale laboratoire de démonstration sont à droite et à gauche du poids des reins, la pression artérielle moyenne (PAM),. la fréquence cardiaque (HR), le temps échantillon, le volume d'urine, le plasma et l'urine sodium (Na), le potassium (K), et les concentrations d'inuline. Les concentrations d'inuline d'urine ont été déterminées à partir du dosage de l'inuline montre le tableau 1.
25table3.jpg "/>
Tableau 3:. Paramètres de la fonction rénale calculées à partir de mesures collectées avec les formules présentées dans la section Protocole 5, les variables enregistrées (tableau 2) sont utilisés pour calculer le taux d'urine de flux, débit de filtration glomérulaire (DFG), le poids GFR / g de rein, le taux d'excrétion , de la charge filtrée, et l'excrétion fractionnaire de sodium (Na) et potassium (K) au cours de la pré-médicament deux et trois périodes post-médicaments.
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Discussion
Un marqueur approprié pour la mesure de GFR doit répondre à quatre critères: être filtré librement le glomérule, non liée aux protéines plasmatiques, et ni être absorbé ni sécrétée dans le néphron. L'inuline est un polymère de fructose qui satisfait à ces critères. En conséquence, la clairance rénale de l'inuline est considéré comme l'étalon-or pour mesurer GFR 7. La technique démontrée représente l'approche traditionnelle de la détermination de la clairance rénale de l'inuline à partir des collections d'urine chronométrés lors d'une perfusion constante d'inuline 8,9. Les mesures classiques d'inuline ont été réalisés en utilisant la méthode à l'anthrone pour produire une détermination colorimétrique quantitative de l'inuline mesurée par spectrophotomètre 10,11. Cependant, dans le but de faciliter la mesure de l'inuline dans de plus petits volumes d'urine et de plasma, de l'inuline a été étiqueté avec des marqueurs radioactifs 12-14, 15-17 et fluorescents. La démonstration de laboratoire présentés dans cette vidéo used étiqueté FITC inuline pour la mesure de la fonction rénale en raison de l'absence de risque d'exposition au rayonnement humain et la facilité de la mesure de la fluorescence FITC 15.
Cette démonstration de laboratoire est destiné à fournir une compréhension conceptuelle de la façon de mesurer la fonction rénale pour les étudiants avec des compétences minimales de laboratoire. Par conséquent, la préparation pré-lab de solution FITC-inuline, et la préparation chirurgicale des animaux sont effectuées par des techniciens expérimentés avant le début de la manifestation. Les étudiants arrivent pour la démonstration à la fin de la période d'équilibration inuline 1-2 hr. A cette époque, les étudiants sont présentés avec un aperçu pré-laboratoire et informés des procédures qui ont été menées sur les animaux. Deux étudiants sont affectés à une expérimentation animale, et des instructions sur la façon de recueillir des échantillons de sang et d'urine avant et après l'administration du médicament diurétique. L'analyse d'échantillons de sang et d'urine est réalisée par experieNCED techniciens et les résultats sont remis aux étudiants pour les calculs de la fonction rénale. Les résultats sont présentés au cours d'une discussion post-laboratoire qui peut être prévue après la manifestation.
Il ya plusieurs étapes critiques dans le protocole pour assurer des réponses valides. Tout d'abord, FITC inuline doit être complètement dissous et on le filtre avant l'administration de l'animal. Idéalement, FITC inuline devrait être dialysée dans de l'eau pendant 48 heures à température ambiante pour éliminer FITC non lié résiduel. Deuxièmement, les échantillons de plasma doivent être exempts de sérum physiologique. Les étudiants sont chargés de recueillir un échantillon de sang seulement après tout de la solution saline dans le cathéter artériel a été expulsé et seulement le sang coule sur le cathéter. Des échantillons de sang qui sont dilués avec une solution saline fourniront des valeurs erronées d'inuline plasmatique, le sodium et le potassium. Troisièmement, l'écoulement d'urine doit être stable et suffisant pour produire assez échantillon pour analyse. Un débit d'urine stable à base est essentielle, car elle est une indication deune préparation expérimentale stable. Si l'écoulement de l'urine est trop faible, le taux d'inuline de perfusion peut être augmentée avant de goûter collections. Cependant, la perfusion d'inuline doit être constant au cours de l'expérience, à savoir, la vitesse de perfusion d'inuline ne doit pas être réglée pendant l'expérience. Enfin, la mesure de la fluorescence de l'inuline dans des échantillons de plasma et d'urine par lecteur de microplaque est essentiel pour une expérience réussie. Depuis les spécifications du lecteur de microplaques détermineront si les échantillons nécessitent des dilutions, il est recommandé un essai de l'essai de l'inuline être effectuée avant la démonstration de laboratoire dans un effort pour optimiser les spécifications du lecteur de microplaques et de veiller à ce que les valeurs de fluorescence de l'échantillon sont dans le milieu de gamme de la courbe standard.
Bien que l'évaluation de la fonction rénale en fonction de la clairance rénale de l'inuline est considéré comme l'étalon-or, cette technique a ses limites parce que les animaux doivent être anesthésiés, etinstrumenté avec des cathéters vasculaires et de la vessie. Anesthethetic agents ont été montré pour affecter l'hémodynamique rénale et GFR 18,19; cependant isoflurane et Inactin sont généralement utilisés dans des expériences de la fonction rénale en raison de leurs effets minimes sur le rein 19,20. La technique de clairance de l'inuline nécessite aussi une perfusion constante d'échantillons d'inuline et de sang et de plasma multiples qui peuvent être prohibitifs dans les petits animaux tels que des souris. Les modifications de cette technique ont été développées pour permettre la mesure de la clairance plasmatique d'une seule injection de l'inuline chez des animaux conscients 21. Ces modifications nécessitent également de plus petits volumes d'échantillons de sang pour l'analyse, et de fournir un autre procédé pour évaluer la fonction rénale chez les souris.
La mesure de la fonction rénale est applicable à des études de physiologie, pathologie, toxicologie, pharmacologie et états pathologiques. Les étudiants qui participent à la fonction rénale seront démonstration t apprendreil technique de l'étalon-or de la clairance rénale de l'inuline pour évaluer la fonction rénale. Par la maîtrise de cette technique, les élèves comprendront les principes de la fonction rénale et leur permettre d'appliquer la technique à leur propre recherche et de déterminer si des modifications à la technique sont appropriés pour leurs études.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes. Les opinions ou affirmations contenues dans ce document sont les opinions personnelles de l'auteur et ne doivent pas être interprétées comme fonctionnaire ou comme reflétant les vues du Département de l'armée ou du ministère de la Défense.
Acknowledgments
La source de financement pour la démonstration de laboratoire était NIGMS subvention: GM077119. Nous remercions le Dr Joseph R. Haywood et le Dr Peter Cobbett pour leur soutien de la Couse court intégrative et orgue Systems pharmacologie. Nous remercions également Mme Hannah Garver pour son soutien technique de la démonstration de laboratoire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Braided Silk Surgical Suture | Surgical Specialties Corp | SP1033 | |
| Assay Plate, 96-Well | Costar | 3922 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Chemical Co | A2934-25G | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | MicroFuge 18, 357160 | |
| Conical Sample Tubes | Dot Scientific Inc. | #711-FTG | |
| Cotton Tipped Applicators | Solon Manufacturing Co | 56200 | |
| Data Acquisition Software | ADInstruments | LabChart Pro 7.0 | |
| Digital Scale | Denver Instrument | APX-4001 | |
| FITC-Inulin | Sigma Chemical Co | F3272-1G | |
| Gauze Sponges | Covidien | 2146 | |
| Heated Surgical Bed | EZ-Anesthesia | EZ-212 | |
| Heparin | Sagnet | NDC 25021-402-10 | |
| HEPES | Sigma Chemical Co | H3375 | |
| Isoflurane | Abbott Animal Health | IsoFlo, 5260-04-05 | |
| Isoflurane Vaporizer | EZ-Anesthesia | EZ-190F | |
| Micro Dissecting Forceps | Biomedical Research Instruments Inc. | 70-1020 | |
| Microplate Reader - Fluoroskan | ThermoScientific | Ascent FL, 5210460 | |
| NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer | NOVA BioMedical | 14156 | |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| PE-190 (for bladder catheter) | BD Medical | 427435 | |
| Pressure Transducer | ADInstruments | MLT1199 | |
| Pyrex Culture Tubes | Corning Inc. | 99445-12 | |
| Rat Femoral Tapered Artery Catheter | Strategic Applications Inc. | RFA-01 | |
| Salix Furosemide 5% | Intervet | #34-478 | |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Student Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Surgical Gloves | Kimberly-Clark | Sterling Nitrile Gloves | |
| Syringe pump | Razel Scientific | R99-E | |
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 91121-12 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann Co | 105-420 | |
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar 3922 Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc. #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scale Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Gauze Sponges Covidien 2146 Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435 Pressure Transducer ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann Co 105-420 |
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