Abstract
Undersøgelse af brug af virus-medieret genoverførsel til at arrestere eller vende høretab er stort set blevet forvist til det perifere auditive system. Kun få studier har undersøgt genoverførsel til det centrale auditive system. Den dorsale cochlear kerne (DCN) af hjernestammen, som indeholder anden ordens neuroner i den auditive vej, er et potentielt sted for genoverførsel. I denne protokol, er en teknik til direkte og maksimal eksponering af murine DCN via en posterior fossa tilgang demonstreret. Denne fremgangsmåde giver mulighed for enten akut eller overlevelse kirurgi. Efter direkte visualisering af DCN, er mulige med en masse af eksperimenter, herunder injektion af opsiner i cochlear kerne og efterfølgende stimulering med en optisk fiber koblet til et blåt lys laser. Andre neurofysiologi eksperimenter, såsom elektrisk stimulering og neurale injektor tracings er også mulig. Niveauet af visualization og varigheden af stimulation opnåelige gøre denne fremgangsmåde gælder for en bred vifte af eksperimenter.
Protocol
BEMÆRK: Alle eksperimentelle procedurer udføres i overensstemmelse med Animal Care og brug Udvalg for Massachusetts øjet og øret Ambulatorium og Harvard Medical School, som følger nationale retningslinjer dyr behandling, herunder Public Health Service Politik om Humane Pleje og anvendelse af forsøgsdyr, den nende Guide, og dyreværnsloven. Eksperimentelle procedurer anført nedenfor detaljeret eksponering af den venstre DCN. Brug sterile instrumenter, mens de udfører overlevelse kirurgi.
1. Primær kraniotomi og Dorsal Cochlear Nucleus Exposure
- Anæstesi
- Bedøver en mus, alderen 8-12 uger, vejer 18-24 g, med xylazin 20 mg / kg og ketamin 100 mg / kg via en intraperitoneal administration. Bekræft korrekt anæstesi ved pulsmåling, respirationsfrekvens samt tå knivspids tilbagetrækning refleks. Placer dyrlæge salve på øjne for at forhindre tørhed, mens under anæstesi. Når tilstrækkeligt under anæstesi, overliggende barbering hår than hovedbund at give uhindret adgang til det kirurgiske sted.
- Kirurgisk positionering
- Placer musen sikkert på et lille dyr stereotaktisk holder, holdt på plads af en snude klemme.
- Sørg for, at snuden klemme er løst nok til at give mulighed for tilstrækkelig respiration men stramme nok til helt at immobilisere lederen af musen. Hvis musen hoved er løst, dyret sandsynligvis falde ud af hovedet holderen under kraniotomi del af proceduren.
- Placer auditive hjernestammen implantat elektroder i standard mode, som giver mulighed for pulsmåling. Respirationsfrekvens bør overvåges af visualisering. Bemærk, at den normale puls og respirationsfrekvens vil variere afhængigt af alder af musen.
- Et termometer anbringes og euthermia sikres via placering på en homeotermisk varmetæppe.
- Hud incision og eksponering af interparietal og occipital knoglerne i kraniet
- Under en Microscope, lave en lodret snit gennem huden starter ved midterlinjen direkte mellem det ydre øre, og strækker sig til den caudale del af nakkeknude. Efter midterlinjen hud indsnit fortrænge huden lateralt. Pletterne af musklerne, der dækker den venstre posteriore aspekt af kraniet.
- Fjern muskel overliggende venstre parietal, interparietal og occipital knoglerne i kraniet ved disartikulation af muskel vedhæftede filer til deres respektive knogler med en skalpel eller iris saks. Overhold en lille grad af blødning langs cut muscle kanter. Minimer dette ved et let tryk med en bomuld spids applikator til 10-15 sek.
- Kraniotomi overliggende Cochlear Nucleus
- Identificere relevante suturlinjer, herunder sagittale og lambda suturer linjer (Figur 1, venstre panel).
- Ved hjælp rongeurs, lave en kraniotomi over interparietal knogle, til venstre for midterlinjen ~ 2 mm caudale til lambda sutur linje. Denne region ligger over DCN.
- Following kraniotomi, observere et tyndt lag af dura som ligger over lillehjernen. Ved hjælp af en skalpel, fjerne dura. (Figur 1, midterste panel).
BEMÆRK: Fjernelse af dura kan forårsage en lille grad af blødning. Denne proces med at bruge skalpel for at fjerne dura er beregnet til at reducere mængden af blodtab under lillehjernen aspiration, som vil pulje på hjernestammen overflade og uklar identifikation af DCN. Totale blodvolumen af muse er ~ 1,5 ml bør ikke overstige> end 15%. Hvis blødning overstiger dette beløb, skal musen være forsynet med med flydende tilskud. - Fjern koaguleret blod overlejre cerebellum med vatpind. Eventuelt forsigtigt dryppe saltvand ved hjælp af en dental punkt på lillehjernen at rydde blod væk blod.
- Cerebellar Aspiration
- Ved hjælp af en 5 French sugning, aspireres lateral mest del af venstre cerebellum overlejrer DCN indtil DCN er overual (figur 1, højre panel). Fjern ca. 1/4 til 1/3 af den venstre cerebellum. Den vigtigste skelsættende støder op til DCN er ampulla af den overlegne halvrunde kanalen.
BEMÆRK: Aspiration af lillehjernen er nøglen trin i protokollen. Instrueret aspiration af lillehjernen er mest positivt resultat, hvis den forekommer i et enkelt forsøg og ikke med flere passager af sugning, da dette vil forårsage blødninger. For at hjælpe med aspiration, indstille brændplanet af mikroskopet på det forventede dybde af KN, hvilket vil være en smule distalt for overfladen af cerebellum. Indstilling brændplanet af KN vil forbedre visualisering og sikre et skarpt billede. - Efter aspiration, yderligere blødning, cerebrospinalvæske (CSF) opbygning, og lillehjernen forskydning på DCN forventes. Instill 0,5 cc sterilt saltvand hurtigt i kraniotomi at forhindre blodkoagulation. En kombination af blid duppe med en dental punkt og sugning kan derefteranvendes til at rydde en sti til direkte visualisering af DCN. Ikke direkte kontakt med overfladen af DCN.
- Ved hjælp af en 5 French sugning, aspireres lateral mest del af venstre cerebellum overlejrer DCN indtil DCN er overual (figur 1, højre panel). Fjern ca. 1/4 til 1/3 af den venstre cerebellum. Den vigtigste skelsættende støder op til DCN er ampulla af den overlegne halvrunde kanalen.
2. Pres Mikroinjektion for Virus genoverførsel og Kirurgisk Recovery
- Efter DCN er fri for overliggende blod og CSF og er klart synlige, lave tryk mikroinjektioner i DCN anvendelse af en 10 pi Hamilton-sprøjte over en 2 min periode.
- Nålen indføres med en mikromanipulator indtil spidsen ikke længere er synlig under overfladen af DCN.
- For optimal ydeevne, skal du bruge en 33 eller 34 gauge kanyle (brug en gastæt sprøjte med 34 gauge nål) med en lavvandet facet, såsom 45 °, for at minimere traume og lokalisere injektionsvolumenet i DCN, som er en tynd og lavvandet hjernestammen struktur (<300 um tyk).
BEMÆRK: Andre mikroinjektion instrumenter kan anvendes baseret på. Ideelt set bør injektionsinstrumentet være fleksible for at give mulighed for nogle mindre bend, hvis det er nødvendigt direkte at målrette DCN. Endvidere, som musen bevæger sig en smule under hele proceduren på grund af respiration, bør instrumentet være robust nok til at modstå mindre mængder af bevægelse.
3. Kirurgisk Recovery
- Umiddelbart efter injektion, re-tilnærme huden og lade musen til at komme sig per standard inddrivelsesproceduren. Resterende cerebellum og arvæv vil udfylde hulrummet forårsaget af aspiration af cerebellum. Konstant overvågning af dyrene, indtil tilstrækkelig bevidsthed genvindes at opretholde brystleje. Overvåg puls, respirationsfrekvens, samt evnen til at fodre.
BEMÆRK: Intet dyr, som har undergået kirurgi returneres til et bur med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt. - Hvis en mus begynder at gå i cirkler postoperativt (<5% af tilfældene), typisk 2-4 timer efter afslutningen af huden indsnit, straks ofre musen, da det sandsynligvis ville have en vanskelig tid fodring. Thans bivirkning skyldes sandsynligvis aspiration af lillehjernen. Bør overvåges Dyret for smerter postoperativt, og der bør gives passende narkotika for at sikre dyr komfort baseret på institutionelle standarder. Antibiotika kan være nødvendig, hvis tegn på infektion.
4. Sekundær kraniotomi og Cochlear Nucleus Exposure
- Efter 2-4 ugers heling og virus-medieret genoverførsel inkubation, re-bedøver en tidligere injiceret mus og gentag trin 1,1-1,5 Optimal inkubationstid varierer med typen af gen overføres.
- Fjern arvæv over kraniotomi stedet af en kombination af en pincet, skalpel og rongeurs.
- Efter visualisering kraniotomi, identificere en kombination af resterende cerebellum og arvæv overliggende DCN. Brug en 5 French sug at aspirere overliggende lillehjernen / arvæv (svarende til den tidligere cerebellar aspiration).
- Efter aspiration, forventer yderligere blødning, CSF Build-up, og de resterende bits af cerebellum. Hurtigt indføre saltvand i kraniotomi at forhindre blodkoagulation. Brug en kombination af blid dental punkt duppe og sug for at rydde vejen til direkte visualisering af DCN.
- Observer overflade DCN. Udfør optogenetics-baserede fysiologi eksperimenter som DCN er nu tilgængelig. Indføre en let stimulus, for eksempel med en optisk fiber (figur 2), til at drive en optogenetics baseret eksperiment.
5. Histologi
- Efter indgåelse af eksperimenter, aflive musen med en overdosis af ketamin. Perfundere musen med normalt saltvand efterfulgt af 4% paraformaldehyd.
- Uddrag hjernestammen fra kraniet og post-fix i 2 timer. Cryoprotect hjernestammen i 30% saccharose i 24-48 timer. Afsnit hjernestammen ved hjælp af en standard kryostat anvendelse af 60 um sektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Delvis cerebellare Aspiration Demonstrerer Adgang til Cochlear Nucleus
Efter huden og musklen overliggende kraniet fjernes, landmærker kraniet overflade, såsom den koronale og Lamda suturlinjer, viser den omtrentlige lokalisering af kraniotomi. Efter kraniotomi med rongeurs er lillehjernen visualiseres. Omhyggelig aspiration af den lille del af lillehjernen viser visualisering af KN, som derefter kan injiceres (figur 1).
Sekundær Cochlear Nucleus Eksponering for stimulation med blåt lys laser
Efter indledende eksponering af DCN, genoverførsel med en opsin, og inkubationstiden kan DCN derefter blive stimuleret af et blåt lys laser. Den sekundære kraniotomi udsætte overfladen af DCN til optisk stimulation ligner i teknisk tilgang til den primære kraniotomi (Supp. Movie 1). DCN, eren overfladestruktur, der er mindre end 300 um i tykkelse. Den eksperimentelle murine forberedelse forbliver levedygtige i op til 6 timer.
Figur 1: Delvis cerebellar aspiration viser adgang til det dorsale cochlear kerne. Venstre panel: Når mus anbringes i holderen, er et snit lodret gennem hud og blødt væv langs den bageste del af kraniet til det bløde væv i halsen. Huden er lateraliseret og musklen overliggende koronale sutur linje fjernes midterste panel: a. Kraniotomi derefter gennemført over regionen af lillehjernen og underliggende dorsale cochlear kerne med knoglen rongeurs Højre panel:. For eksponering af den dorsale cochlear kerne en 5 French sugning anvendes derefter til at aspirere cerebellumoverliggende cochlear kerne indtil den dorsale cochlear kerne visualiseres.
Figur 2: Udsættelse af overfladen af cochlear kerne for stimulering med blåt lys laser til fremstilling af en optisk fremkaldte auditive hjernestammen svar Placering af optisk fiber koblet til et blåt lys laser på overfladen af den dorsale cochlear kerne muliggør optisk stimulering af. opsin-inficerede dorsale cochlea kerne. Blå bar = 400 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver teknikken af direkte visualisering af DCN i den murine model for manipulation af det centrale auditive system. Den skitserede fremgangsmåde med direkte visualisering giver betydelige fordele i forhold til de vigtigste alternativ, som er stereotaksiske tilgange. Primært direkte visualisering af DCN muliggør øjeblikkelig bekræftelse af stedet af hjernestammen, mens stereotaksiske fremgangsmåder ikke giver direkte visualisering. I forsøg, der nødvendiggør langvarig inkubationsperioder, som det er tilfældet i virus-medieret genoverførsel, er der potentiale for lav infektionseffektivitet hvis injektionen "misser" målet placering. Endvidere en direkte visualisering metode giver mulighed for injektion i en lang række dyr aldre. En analog kirurgisk fremgangsmåde kan anvendes i overlevelse eksperimenter med andre dyremodeller, såsom rotter og marsvin.
Der er flere kritiske trin i denne protokol. Førstmus skal placeres korrekt i stereotaktisk holder. Enhver bevægelse af hovedet vil resultere i vanskeligheder gør kraniotomi. For det andet, placering af kraniotomi er afgørende. Hvis kraniotomi ikke er lavet i den korrekte position, vil visualisering af DCN efter aspiration af lillehjernen være udfordrende, hvis ikke umuligt. Endelig det mest kritiske trin i protokollen er den delvise rettet aspiration af lillehjernen. Der er to tekniske tilgange til aspiration af lillehjernen. I den første aspiration tilgang er suge hele tiden holdt på lillehjernen, løfte den opad, væk fra hjernestammen. I denne fremgangsmåde kan DCN delvis visualiseres under lillehjernen og sug holdes til KN er fuldt visualiseres og cerebellum fjernet. I den anden fremgangsmåde, er lillehjernen delvist aspireret i flere lag passerer indtil DCN visualiseres. Dental punkter kan anvendes med forsigtig duppe at rydde blod eller resterende cerebellum fragments fra KN, hvis det ikke fuldt visualiseres.
Blødning er en væsentlig ulempe ved den direkte visualisering tilgang og hovedsageligt forekommer under den indledende kraniotomi og efter cerebellar aspiration. I mange tilfælde i den indledende kraniotomi, vil blødningen stoppe med tiden indenfor 2-5 min. Placering af et silkepapir eller dental punkt på stedet for blødning og giver mulighed for hæmostase. Med hensyn til blødning efter cerebellar aspiration, er det vigtigt at injicere normalt saltvand (0,5-1 cc) på stedet for kraniotomi at fortynde blodet og forhindre blodpropdannelse på niveau med KN. En kombination af suge- og blid dental punkt duppe kan anvendes for at fjerne blod og saltvand. Faktisk væsentlig begrænsning ved denne fremgangsmåde er den invasive karakter af proceduren.
Protokollen har konsekvenser ud over manipulation af det auditive system. In vivo genoverførsel i centralnervesystemet muliggør manipulation af diverse nervebanerne og har tilbudt indsigt i flere neurale funktioner, herunder hukommelse, motorstyring, lugtesansen, og audition. 16,21-26 Den kirurgiske tilgang muliggør direkte visualisering med henblik på genoverførsel og stimulation kan potentielt anvendes på andre områder af hjernestammen, både dem, der er anført ovenfor, og andre. Efter beherskelse af direkte visualisering af DCN, er mulige et væld af eksperimenter, herunder injektion af opsiner i KN og efterfølgende stimulation med et blåt lys laser. Andre neurofysiologi eksperimenter, såsom elektrisk stimulering og neurale injektor tracings, 18 er også mulig. Niveauet for visualisering og varigheden af stimulering af denne fremgangsmåde giver mulighed for flere applikationer til en bred vifte af eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Finansiering: Dette arbejde blev støttet af en fond Bertarelli tilskud (DJL), en MED-EL tilskud (DJL) og en National Institutes of Health Tilskud DC01089 (MCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic holder | Stoelting | 51500 | |
| Homeothermic blanket | Harvard | 507214 | |
| Scalpel blade #11 | Fine Surgical Tools | 10011-00 | |
| Iris scissor | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| 5 French suction | Symmetry Surgical | 2777914 | |
| Dental Points | Henry Schein | 100-8170 | |
| Bone rongeur | Fine Surgical Tools | 16020-14 | |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7633-01 | |
| 34 gauge, needle | Hamilton | 207434 | |
| Rongeurs | Fine Surgical Tools | 16021-14 |
References
- Lalwani, A., Mhatre, A. Cochlear gene therapy. Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).
- Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. Current issues in cochlear gene transfer. Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Koh, S., Pettis, R., Mhatre, A., Lalwani, A. Cochlear microinjection and its effects upon auditory function in the guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
- Lalwani, A., Walsh, B., Reilly, P., Muzyczka, N., Mhatre, A. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
- Wareing, M., Lalwani, A. Cochlear gene therapy: current perspectives. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 5 Suppl 1. (49), 27-30 (1999).
- Han, J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. J Clin Invest. 124 (3), 1114-1129 (2014).
- Adamantidis, A., et al. Optogenetic interrogation of dopaminergic modulation of the multiple phases of reward-seeking behavior. J Neurosci. 30 (31), 10829-10835 (2011).
- Kim, K., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PloS One. 7 (4), e33612 (2012).
- Britt, J., Bonci, A. Optogenetic interrogations of the neural circuits underlying addiction. Curr Opin Neurobiol. 23 (4), 539-545 (2013).
- Abbott, S., Coates, M., Stornetta, R., Guyenet, P. Optogenetic stimulation of c1 and retrotrapezoid nucleus neurons causes sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats. Hypertension. 61 (4), 835-841 (2013).
- Carter, M., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
- Darrow, K., et al. Optogenetic control of central auditory neurons. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. (695), (2012).
- Shimano, T., et al. Assessment of the AAV-mediated expression of channelrhodopsin-2 and halorhodopsin in brainstem neurons mediating auditory signaling. Brain Res. 1511, 138-152 (2013).
- Doucet, J., Ryugo, D. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. J Comp Neurol. 385, 245-264 (1997).
- Brown, M., Drottar, M., Benson, T., Darrow, K. Commissural axons of the mouse cochlear nucleus. J Comp Neurol. 521, 1683-1696 (2013).
- Verma, R., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hear Res. 310, 69-75 (2014).
- Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. J Neurophysiol. 93 (1), 557-569 (2005).
- Rolls, A., et al. Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation. Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 13305-13310 (2011).
- Huff, M., Miller, R., Deisseroth, K., Moorman, D., LaLumiere, R. Posttraining optogenetic manipulations of basolateral amygdala activity modulate consolidation of inhibitory avoidance memory in rats. Proc Natl Acad Sci. 110 (9), 3597-3602 (2013).
- Stortkuhl, K., Fiala, A. The Smell of Blue Light: A New Approach toward Understanding an Olfactory Neuronal Network. Front Neurosci. 5 (72), (2011).
- Hira, R., et al. Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex. J Neurosci Methods. 179 (2), 258-263 (2009).
- Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice. Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).
- Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
