Abstract
Untersuchung über die Verwendung von virusvermittelten Gentransfer zu verhaften oder rückwärts Hörverlust hat sich weitgehend auf die Umfangs Hörsystem verbannt worden. Nur wenige Studien haben den Gentransfer mit dem zentralen auditorischen Systems untersucht. Dorsalen cochlearen Nukleus (DCN) des Hirnstamms, die Neuronen zweiter Ordnung der Hörbahn enthält, ist eine potentielle Stelle für einen Gentransfer. In diesem Protokoll wird ein Verfahren zur direkten und maximale Exposition des murinen DCN über einen posterioren Fossa Ansatz demonstriert. Dieser Ansatz ermöglicht entweder akut oder das Überleben der Operation. Nach direkten Visualisierung des DCN, eine Vielzahl von Experimenten sind möglich, einschließlich Injektion in die Opsinen Cochleariskern und nachfolgende Stimulation durch eine optische Faser zu einer Blaulicht-Laser gekoppelt ist. Andere Neuro Experimenten wie elektrische Stimulation und neuronalen Injektor Kurven sind denkbar. Die Höhe der Visualisierungstion und die Dauer der Stimulation erreichbar machen diesen Ansatz für eine Vielzahl von Experimenten.
Protocol
HINWEIS: Alle experimentellen Verfahren sind in Übereinstimmung mit dem Animal Care und Verwenden Ausschuss der Massachusetts Eye and Ear Infirmary und der Harvard Medical School, die nationalen Tierpflege Richtlinien befolgen, einschließlich Public Health Service Politik über humane Pflege und Verwendung von Labortieren, die durchgeführt ILAR Guide, und das Tierschutzgesetz. Experimentelle Verfahren nachstehend im Detail Exposition der linken DCN aufgeführt. Verwenden Sie sterile Instrumente während der Durchführung Überleben Chirurgie.
1. Primär Kraniotomie und Rücken Cochlear Nucleus Belichtungs
- Anästhesie
- Anesthetize einer Maus im Alter von 8-12 Wochen mit einem Gewicht von 18-24 g, Xylazin 20 mg / kg Ketamin 100 mg / kg über eine intraperitoneale Verabreichung. Überprüfen Sie die Anästhesie durch die Überwachung der Herzfrequenz, Atemfrequenz, sowie toe Prise Rückzug Reflex. Platz Tierarzt Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Sobald ausreichend unter Narkose, Rasur Haarüberlagert ter Kopfhaut, um ungehinderten Zugang zu der Operationsstelle zu schaffen.
- Chirurgische Positionierung
- Platzieren Sie die Maus sicher in einer Kleintierstereotaktischen Halterung, an Ort und Stelle durch eine Schnauze Klammer gehalten.
- Stellen Sie sicher, dass die Schnauze Klemme locker genug, um für eine ausreichende Atmung aber fest genug, lassen den Kopf der Maus vollständig zu immobilisieren. Wenn die Maus den Kopf locker ist, ist das Tier wahrscheinlich während der Kraniotomie Teil der Verfahren des Kopfhalters fallen.
- Zeigen auditorischen Hirnstamm-Implantat Elektroden in üblicher Weise, die für die Überwachung der Herzfrequenz ermöglicht. Die Atemfrequenz sollte durch Visualisierung überwacht werden. Beachten Sie, dass die normale Herzfrequenz und die Atemfrequenz wird in Abhängigkeit vom Alter des Maus variieren.
- Ein Thermometer ist auf einer homeothermic Heizdecke platziert und über die Platzierung euthermia gewährleistet ist.
- Hautschnitt und Exposition der interparietal und occipital Knochen des Schädels
- Unter einem Microscopa, stellen ein vertikaler Schnitt durch die Haut ausgehend von der Mittellinie, direkt zwischen der Ohrmuschel und sich bis zum Schwanzteil des Hinterhauptbein. Nach der Mittellinie Hautschnitt, verdrängen die Haut seitlich. Visualisieren Sie die Muskeln für den verließ den hinteren Teil des Schädels.
- Entfernen Muskel über dem linken Scheitel, interparietal und occipital Knochen des Schädels durch Exartikulation der Muskelansätze an ihre jeweiligen Knochen mit einem Skalpell oder Iris Schere. Beachten Sie ein kleines Maß an Blutungen entlang der Schnittmuskel Kanten. Minimieren Sie dies durch sanften Druck mit einem Wattestäbchen für 10-15 Sek.
- Kraniotomie darüberliegenden Cochlear Nucleus
- Identifizieren Sie relevanten Nahtlinien, einschließlich sagittalen und Lambdanähte Linien (Abbildung 1, links).
- Mit Rongeure, machen Sie eine Kraniotomie über die Inkabein, links von der Mittellinie, ~ 2 mm kaudal der Lambda-Naht. Diese Region liegt über dem DCN.
- Following Kraniotomie, beachten Sie eine dünne Schicht der Dura, die das Kleinhirn überlagert. Mit einem Skalpell, entfernen Sie die Dura. (Bild 1, Mitte).
HINWEIS: Das Entfernen der Dura kann ein kleines Maß an Blutungen. Dieses Verfahren der Verwendung der Skalpellklinge, um die Dura zu entfernen, ist beabsichtigt, um die Menge des Blutverlustes während der Cerebellum Aspiration, die auf der Hirnoberfläche und undurchsichtig Identifizierung des DCN Pool wird reduzieren. Gesamtblutvolumen von Maus ist ~ 1,5 ml nicht überschreiten soll> als 15%. Wenn die Blutung diesen Betrag übersteigt, sollte die Maus mit mit Flüssigkeit Ergänzung zur Verfügung gestellt werden. - Entfernen geronnenem Blut überlagert das Kleinhirn mit dem Wattestäbchen. Optional sanft tropfen Kochsalzlösung mit einem Zahnpunkt auf das Kleinhirn, um Blut zu Blut entfernt.
- Kleinhirn-Aspiration
- Verwendung eines 5 Französisch Saug absaugen seitlichen äußersten Abschnitt der linken Cerebellum über der DCN bis der DCN visBuchs (Abbildung 1, rechts). Entfernen etwa 1/4 bis 1/3 des linken Kleinhirn. Das Wahrzeichen neben dem DCN ist die Ampulle des oberen Bogenganges.
HINWEIS: Aspiration des Kleinhirns ist der entscheidende Schritt des Protokolls. Gerichtete Streben des Cerebellum meisten erfolgreich durchgeführt, wenn es in einem einzigen Versuch auftritt und nicht mit Mehrfachdurchgänge des Saug da dies zu Blutungen führen. In Ansaugen zu unterstützen, setzen die Brennebene des Mikroskops an der erwarteten Tiefe des CN, die geringfügig distal der Oberfläche der Kleinhirn wird. Einstellen der Brennebene mit dem CN wird Visualisierung verbessern und ein scharfes Bild. - Nach Aspiration, weitere Blutungen, Liquor (CSF) Aufbau und Kleinhirn Verschiebung auf der DCN erwartet. Vermitteln 0,5 cc steriler Kochsalzlösung schnell in die Kraniotomie Blutgerinnung verhindern. Eine Kombination aus sanften Abtupfen mit einem Zahnpunkt und Absaugung kann dannverwendet, um abzuräumen einen Weg für die direkte Visualisierung des DCN. Nicht direkt an die Oberfläche des DCN.
- Verwendung eines 5 Französisch Saug absaugen seitlichen äußersten Abschnitt der linken Cerebellum über der DCN bis der DCN visBuchs (Abbildung 1, rechts). Entfernen etwa 1/4 bis 1/3 des linken Kleinhirn. Das Wahrzeichen neben dem DCN ist die Ampulle des oberen Bogenganges.
2. Druckmikroinjektion für Virus-vermittelte Gentransfer und chirurgische Wiederherstellung
- Nachdem der DCN ist frei von überlagernden Blut und CSF und ist deutlich sichtbar, machen Druck Mikroinjektionen in das DCN mit einem 10 & mgr; l Hamilton-Spritze über einen Zeitraum 2 min.
- Einführung der Nadel mit einem Mikromanipulator, bis die Spitze nicht mehr unter der Oberfläche des DCN sichtbar.
- Für eine optimale Leistung verwenden Sie eine 33 oder 34 Gauge-Nadel (verwenden Sie eine gasdichte Spritze mit der 34-Gauge-Nadel) mit einem flachen Kegel, wie 45 °, um stumpfes Trauma zu minimieren und zu lokalisieren, das Injektionsvolumen im DCN, der ein dünner ist und seichten Hirnstruktur (<300 & mgr; m dick).
Hinweis: andere Mikroinjektionsinstrumente genutzt basieren. Idealerweise sollte die Injektions Instrument flexibel sein, um für einige geringfügige ben ermöglichend, wenn nötig, direkt gezielt die DCN. Ferner ist, wie die Maus bewegt sich geringfügig, während des gesamten Verfahrens durch die Atmung, sollte das Gerät robust genug sein, um geringe Mengen an Bewegung zu widerstehen.
3. Chirurgische Wieder
- Unmittelbar nach der Injektion wieder anzunähern, die Haut und lassen Sie die Maus, um per Standard Recovery-Verfahren zu erholen. Verbleibende Cerebellum und Narbengewebe in den Hohlraum durch Absaugen des Kleinhirns verursacht füllen. Ständig Tiere zu überwachen, bis genügend Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. Überwachen Sie Herzfrequenz, Atemfrequenz, sowie die Fähigkeit zu ernähren.
HINWEIS: Kein Tier, das einer Operation unterzogen wurde, wird in einen Käfig mit anderen Tieren zurückgegeben, bis vollständig erholt. - Wenn eine Maus fängt an, im Kreis nach der Operation zu gehen (<5% der Fälle), in der Regel 2-4 Stunden nach der Schließung der Hautschnitt, sofort opfern Sie die Maus, wie es würde wahrscheinlich eine schwierige Zeit Fütterung. Tseine Nebeneffekt ist durch Aspiration des Kleinhirns wahrscheinlich. Das Tier sollte bei Schmerzen nach der Operation überwacht und entsprechende Betäubungsmittel sollte der besseren Tier Komfort auf Grund institutioneller Normen werden. Antibiotika kann notwendig sein, wenn Anzeichen einer Infektion.
4. Sekundäre Kraniotomie und Cochlear Nucleus Belichtungs
- Nach 2-4 Wochen der Heilung und virusvermittelten Gentransfer Inkubation erneut anästhesiert eine vorher injizierten Maus und Schritt 1,1-1,5 optimale Inkubationszeit hängt von der Art des Gens überführt.
- Entfernen Narbengewebe über die Kraniotomiestelle durch eine Kombination von Pinzette, Skalpell und Knochenzangen.
- Nach der Visualisierung der Kraniotomie, identifizieren eine Kombination aus Rest über der DCN Kleinhirn und Narbengewebe. Verwenden Sie einen 5 Französisch Ansaugen darüber liegenden Kleinhirn / Narbengewebe (ähnlich wie das vorherige Kleinhirn Aspiration) anzusaugen.
- Nach Aspiration, erwarten weitere Blutungen, CSF build-up, und die verbleibenden Bits des Kleinhirns. Schnell einzuführen Salzlösung in die Kraniotomie, um die Blutgerinnung zu verhindern. Verwenden Sie eine Kombination aus sanften Zahnpunkt Abtupfen und Absaugung, um den Weg für die direkte Visualisierung des DCN löschen.
- Beachten Sie die Oberfläche des DCN. Führen Optogenetik basierte Physiologie Experimente wie DCN ist jetzt zugänglich. Einführung eines Lichtreizes, zum Beispiel mit einer optischen Faser (2), um eine Optogenetik basierenden Experiment fahren.
5. Histologie
- Nach Abschluss der Experimente, einschläfern die Maus mit einer Überdosis von Ketamin. Perfundieren der Maus mit normaler Salzlösung, gefolgt von 4% Paraformaldehyd.
- Entpacken Sie die Hirnstamm aus dem Schädel und Post-fix für 2 Stunden. Cryoprotect den Hirnstamm in 30% Saccharose für 24-48 Std. Abschnitt der Hirnstamm mit einem Standard-Kryostaten mit 60 um-Schnitte.
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Representative Results
Teilweise Cerebellar Aspiration den Zugang zu der Cochlear Nucleus
Nachdem die Haut und Muskeln, die über dem Schädel sind, Schädeloberfläche Sehenswürdigkeiten wie den koronaren und lamda Nahtlinien entfernt, zeigen die ungefähre Lokalisierung der Kraniotomie. Nach Kraniotomie mit Rongeure wird das Kleinhirn visualisiert. Sorgfältige Absaugung der kleinen Teil des Kleinhirns zeigt Visualisierung des CN, die dann injiziert werden kann (Abbildung 1).
Sekundäre Cochlear Nucleus Exposure für Stimulation mit Blue Light Laser
Nach der ersten Exposition der DCN, Gentransfer mit einem Opsin und der Inkubationszeit kann das DCN dann von einem Blaulicht-Laser angeregt werden. Die Sekundär Kraniotomie Aussetzen der Oberfläche des DCN für die optische Stimulation ähnelt im technischen Ansatz zum primären Kraniotomie (Supp. Film 1). Das DCN, dasseine Oberflächenstruktur, die weniger als 300 um in der Dicke ist. Die experimentellen murinen Herstellung lebensfähig bleibt für bis zu 6 Stunden.
Abbildung 1: Teilweise Kleinhirn Aspiration den Zugang zu der dorsalen Nucleus cochlearis. Linke Seite: Nach der Maus in die Halterung, ein Schnitt senkrecht durch die Haut und Weichteile an der hinteren Seite des Schädels, um das weiche Gewebe des Halses gemacht. Die Haut ist lateralisiert, und der Muskel über der Kranznaht Linie entfernt mittlere Platte:. Ein Kraniotomie wird dann über den Bereich des Kleinhirns und des zugrunde liegenden dorsalen Nucleus cochlearis mit den Knochen Rongeurs abgeschlossen mit der rechten Maussteuerung:. Für die Belichtung der dorsalen Nucleus cochlearis einen 5 Französisch Saugwirkung wird dann verwendet, um das Kleinhirn absaugenüber dem Nucleus cochlearis, bis die Rücken Cochleariskern visualisiert.
Abbildung 2: Die Belichtung der Oberfläche des Nucleus cochlearis zur Stimulation mit Blaulicht-Laser, ein optisch-akustisch evozierte Hirnstammpotenziale erzeugen Platzierung der optischen Faser mit einem blauen Lichtlaser auf der Oberfläche des dorsalen Nucleus cochlearis gekoppelt ermöglicht optische Stimulation. die Opsin-infizierten dorsalen Nucleus Cochlea. Blau bar = 400 & mgr; m.
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Discussion
Dieses Papier beschreibt die Technik der direkten Visualisierung des DCN im Mausmodell für die Manipulation des zentralen auditorischen Systems. Das skizzierte Ansatz der direkten Visualisierung bietet erhebliche Vorteile gegenüber dem Haupt Alternative, die stereotaktische Ansätze sind. In erster Linie die direkte Visualisierung des DCN ermöglicht sofortige Bestätigung der Website des Hirnstamms, während stereo Ansätze nicht direkte Visualisierung leisten. In Experimenten, die längere Inkubationszeiten erforderlich machen, wie es in virusvermittelten Gentransfer der Fall ist, gibt es das Potenzial für niedrige Infektionseffizienz, wenn die Injektion "vermisst" den Zielort. Des Weiteren ermöglicht die Injektion in eine breite Palette Tieralter eine direkte Visualisierung Ansatz. Eine analoge Operationsverfahren kann in der Überlebensversuche mit anderen Tiermodellen, wie Ratten und Meerschweinchen verwendet werden.
Es gibt einige kritische Schritte in diesem Protokoll. Erstens, dieMaus ist ordnungsgemäß in der stereotaktischen Halter positioniert werden. Jede Bewegung des Kopfes wird in Schwierigkeiten, die Kraniotomie führen. Zweitens, ist die Lage der Kraniotomie entscheidend. Wenn die Kraniotomie nicht in der korrekten Position hergestellt werden Visualisierung des DCN Aspiration des Cerebellum schwierig sein, wenn nicht unmöglich. Schließlich ist der wichtigste Schritt des Protokolls der Teil gerichtete Streben des Kleinhirns. Es gibt zwei technische Ansätze, um Aspiration des Kleinhirns. In der ersten Streben Ansatz wird das Ansaugen ständig Cerebellum gehalten, ihn nach oben, weg von dem Hirnstamm. Bei diesem Ansatz kann die DCN teilweise unterhalb des Kleinhirns visualisiert und Ansaugen gehalten wird, bis das CN ist vollständig sichtbar und Kleinhirn entfernt. In dem zweiten Ansatz wird das Cerebellum teilweise in mehrere geschichtete Gängen angesaugt, bis der DCN visualisiert. Dental Punkte können mit sanftem Tupfen verwendet, um Blut oder verbleibenden Kleinhirn fragme zu löschennts vom CN, wenn sie nicht vollständig dargestellt werden.
Blutungen ist ein großer Nachteil der direkten Visualisierung Ansatz und während der anfänglichen Kraniotomie und nach cerebellar Aspiration hauptsächlich. In vielen Fällen ist bei der ersten Kraniotomie werden Blutungen mit der Zeit innerhalb von 2-5 min zu stoppen. Platzieren eines Seidenpapier oder zahnärztlichen Spitze an der Stelle der Blutung und damit zur Blutstillung. Im Hinblick auf Blutungen nach cerebellar Aspiration, ist es wichtig, normaler Kochsalzlösung (0,5-1 cm) an der Stelle der Kraniotomie zu injizieren, um das Blut zu verdünnen und die Bildung von Blutgerinnseln auf der Ebene des CN zu vermeiden. Eine Kombination von Saug- und sanfte Zahnpunkt Abtupfen verwendet wegzuräumen Blut und Kochsalzlösung ist. Tatsächlich ist die Hauptbeschränkung dieses Ansatzes ist die invasive Natur des Verfahrens.
Das Protokoll hat Auswirkungen über die Manipulation des Hörsystems. In vivo-Gentransfer in das Zentralnervensystem ermöglicht Manipulation divERSE Nervenbahnen und hat Einblick in mehrere neuronale Funktionen, einschließlich Speicher, Motorsteuerung, Riechen und Probespiel angeboten. 16,21-26 Die chirurgischen Ansatz ermöglicht die direkte Visualisierung für die Zwecke des Gentransfers und Stimulation kann potenziell auf andere Regionen angewendet werden des Hirnstamms, sowohl die oben genannten und andere. Nach Beherrschung der direkten Visualisierung des DCN, eine Vielzahl von Experimenten sind möglich, einschließlich Injektion Opsinen in die KN und nachfolgende Stimulation mit einem blauen Lichtlaser. Andere Neuro Experimenten wie elektrische Stimulation und neuronalen Injektor Kurven, 18 sind denkbar. Das Niveau der Visualisierung und der Dauer der Stimulation dieser Ansatz erlaubt mehrere Anwendungen für eine Vielzahl von Experimenten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch eine Stiftung Bertarelli Zuschuss (DJL), einem MED-EL Zuschuss (DJL) und ein National Institutes of Health Grants DC01089 (MCB) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic holder | Stoelting | 51500 | |
| Homeothermic blanket | Harvard | 507214 | |
| Scalpel blade #11 | Fine Surgical Tools | 10011-00 | |
| Iris scissor | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| 5 French suction | Symmetry Surgical | 2777914 | |
| Dental Points | Henry Schein | 100-8170 | |
| Bone rongeur | Fine Surgical Tools | 16020-14 | |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7633-01 | |
| 34 gauge, needle | Hamilton | 207434 | |
| Rongeurs | Fine Surgical Tools | 16021-14 |
References
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