Abstract
Investigación sobre el uso de la transferencia génica mediada por virus para detener o revertir la pérdida de la audición en gran medida ha sido relegado al sistema auditivo periférico. Pocos estudios han examinado la transferencia de genes al sistema auditivo central. El núcleo coclear dorsal (DCN) del tronco cerebral, que contiene las neuronas de segundo orden de la vía auditiva, es un sitio potencial para la transferencia de genes. En este protocolo, una técnica para la exposición directa y máxima de la murino DCN a través de un enfoque de la fosa posterior se demuestra. Este enfoque permite ya sea la cirugía aguda o supervivencia. Después de la visualización directa de la DCN, una serie de experimentos son posibles, incluyendo la inyección de opsinas en el núcleo coclear y la estimulación posterior por una fibra óptica acoplada a un láser de luz azul. Otros experimentos neurofisiología, como la estimulación eléctrica y trazados inyectores neuronales también son factibles. El nivel de Visualización y la duración de la estimulación alcanzable hacen de este enfoque aplicable a una amplia gama de experimentos.
Protocol
NOTA: Todos los procedimientos experimentales se realizan de acuerdo con el Comité de Cuidado de Animales y el empleo de la Massachusetts Eye and Ear Infirmary y la Escuela Médica de Harvard, que siguen las directrices nacionales de cuidado de animales, incluyendo la Política Pública de Salud Servicio de Cuidado Humano y Uso de Animales de laboratorio, la Guía ILAR, y la Ley de Protección de los Animales. Los procedimientos experimentales indican a continuación la exposición detallada de la DCN izquierda. Utilice instrumentos estériles mientras se realiza la cirugía de supervivencia.
1. Craneotomía Primaria y Dorsal coclear Núcleo exposición
- Anestesia
- Anestesiar a un ratón, a la edad de 8-12 semanas, con un peso de 18-24 g, con xilazina 20 mg / kg de ketamina y 100 mg / kg a través de una administración intraperitoneal. Confirmar la anestesia adecuada por la tasa de monitorización cardiaca, frecuencia respiratoria, así como reflejo de retirada pizca dedo del pie. Lugar veterinario ungüento en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Una vez adecuadamente bajo anestesia, el pelo afeitado recubre tque el cuero cabelludo para proporcionar un acceso sin obstrucciones a la zona quirúrgica.
- Posicionamiento quirúrgico
- Coloca el ratón de forma segura en un pequeño titular estereotáxica animal, sujeto por una abrazadera hocico.
- Asegúrese de que la abrazadera hocico es lo suficientemente floja para permitir la respiración adecuada, pero lo suficientemente apretado para inmovilizar por completo la cabeza del ratón. Si la cabeza del ratón está suelto, el animal es probable que caiga fuera del soporte de cabeza durante la parte craneotomía de procedimiento.
- Coloque los electrodos del implante auditivo de tronco cerebral en forma estándar, lo que permite la monitorización de la frecuencia cardíaca. La frecuencia respiratoria debe ser supervisada por la visualización. Tenga en cuenta que la frecuencia cardíaca normal y la frecuencia respiratoria variarán dependiendo de la edad del ratón.
- Un termómetro se coloca y euthermia está asegurada a través de la colocación de una manta de calefacción homeotérmico.
- Incisión de la piel y la exposición de los huesos interparietales y occipital del cráneo
- Bajo un Microscopa, hacer una incisión vertical a través de la piel a partir de la línea media, directamente entre el pabellón de la oreja, y se extiende hasta la porción caudal del occipucio. Después de incisión en la piel en la línea media, desplazar lateralmente la piel. Visualizar los músculos que cubren la izquierda de la cara posterior del cráneo.
- Retire el músculo que recubre el parietal izquierdo, interparietal, y los huesos occipitales del cráneo por la desarticulación de las inserciones musculares a sus respectivos huesos con un bisturí o tijera iris. Observar un pequeño grado de sangrado a lo largo de los bordes musculares corte. Minimizar esta por presión suave con un aplicador con punta de algodón para 10-15 seg.
- Suprayacente craneotomía coclear Núcleo
- Identificar las líneas de sutura pertinentes, incluidas las líneas de suturas sagital y lambda (Figura 1, panel izquierdo).
- Usando unas pinzas, hacer una craneotomía sobre el hueso interparietal, izquierda de la línea media, ~ 2 mm caudal a la línea de sutura lambda. Esta región se superpone a la DCN.
- Following craneotomía, observar una fina capa de duramadre que recubre el cerebelo. Usando una hoja de bisturí, retire la duramadre. (Figura 1, el panel medio).
NOTA: La eliminación de la duramadre puede causar un pequeño grado de sangrado. Este proceso de usar la hoja de bisturí para eliminar la duramadre está destinado a reducir la cantidad de pérdida de sangre durante la aspiración cerebelo, que será común en la superficie del tronco cerebral y la identificación oscura de la DCN. El volumen de sangre total de ratón es ~ 1,5 ml no deben exceder> al 15%. Si el sangrado es superior a esta cantidad, el ratón debe estar provista con suplementos de fluido. - Retire la sangre coagulada superponer el cerebelo con el aplicador con punta de algodón. Opcionalmente, escurrir suavemente salina utilizando una punta dental en el cerebelo para limpiar la sangre fuera sangre.
- Cerebelosa Aspiración
- Usando una succión Francés 5, aspirar la porción lateral más del cerebelo izquierdo que recubre el DCN hasta que el DCN es visual (Figura 1, panel derecho). Retire aproximadamente 1/4 a 1/3 del cerebelo izquierdo. El hito principal adyacente a la DCN es la ampolla del canal semicircular superior.
NOTA: La aspiración del cerebelo es el paso clave del protocolo. Dirigida aspiración del cerebelo se lleva a cabo con mayor éxito si se produce en un solo intento y no con varias pasadas de la succión, ya que esto causar sangrado. Para ayudar en la aspiración, definir el plano focal del microscopio a la profundidad prevista de la NC, que será ligeramente distal a la superficie del cerebelo. Ajuste del plano focal a la CN mejorará la visualización y asegurar una imagen nítida. - Se espera que después de la aspiración, más sangrado, el líquido cefalorraquídeo (LCR) la acumulación y el desplazamiento cerebelo en la DCN. Inculcar 0,5 cc de solución salina estéril rápidamente en la craneotomía para prevenir la coagulación de la sangre. Una combinación de dabbing suave con un punto dental y la succión puede ser entoncesutilizado para despejar un camino para la visualización directa de la DCN. No entre en contacto directo con la superficie de la DCN.
- Usando una succión Francés 5, aspirar la porción lateral más del cerebelo izquierdo que recubre el DCN hasta que el DCN es visual (Figura 1, panel derecho). Retire aproximadamente 1/4 a 1/3 del cerebelo izquierdo. El hito principal adyacente a la DCN es la ampolla del canal semicircular superior.
2. La microinyección de presión para la transferencia génica mediada por virus y la recuperación quirúrgica
- Después de la DCN es libre de sangre suprayacente y CSF y es claramente visible, hacer microinyecciones de presión en el DCN utilizando una jeringa Hamilton de 10 l durante un período de 2 min.
- Introducir la aguja con un micromanipulador hasta que la punta ya no es visible bajo la superficie de la DCN.
- Para un rendimiento óptimo, utilice una aguja de calibre 33 o 34 (utilizar una jeringa estanca a los gases con la aguja de calibre 34) con un bisel de poca profundidad, tales como 45 °, para reducir al mínimo el traumatismo cerrado y localizar el volumen de inyección dentro de la DCN, que es un delgado y estructura del tronco cerebral profunda (<300 micras de espesor).
NOTA: Otros instrumentos de microinyección pueden basarse utilizado. Idealmente, el instrumento de inyección debe ser flexible para permitir una ligera bend, si es necesario apuntar directamente a la DCN. Además, como el ratón se mueve ligeramente durante todo el procedimiento debido a la respiración, el instrumento debe ser lo suficientemente robusta como para soportar pequeñas cantidades de movimiento.
3. Recuperación Quirúrgica
- Inmediatamente después de la inyección, vuelva a la aproximación de la piel y permitir el ratón para recuperar por procedimiento de recuperación estándar. Restante cerebelo y tejido cicatrizal se llenará en la cavidad causada por la aspiración del cerebelo. Constantemente observar a los animales hasta que la conciencia suficiente se recuperó para mantener decúbito esternal. Monitorear la frecuencia cardiaca, la frecuencia respiratoria, así como la capacidad para alimentarse.
NOTA: No animal que ha sido sometido a cirugía es devuelto a una jaula con otros animales hasta que se recupere totalmente. - Si un ratón comienza a caminar en círculos después de la intervención (<5% de los casos), típicamente 2-4 horas después del cierre de la incisión de la piel, sacrificar inmediatamente el ratón, ya que probablemente tendría una alimentación momento difícil. Tsu efecto secundario es probable debido a la aspiración del cerebelo. El animal debe ser supervisada para el dolor después de la operación, y los narcóticos también se debe prestar para asegurar el confort de los animales sobre la base de las normas institucionales. Los antibióticos pueden ser necesarios, si la evidencia de infección.
4. Secundaria exposición craneotomía y coclear Núcleo
- Después de 2-4 semanas de curación y el gen de incubación transferencia mediada por virus, volver a anestesiar un ratón y repita el paso 1.1 a 1.5 tiempo de incubación óptimo previamente inyectado varía con el tipo de gen transferido.
- Quitar el tejido de la cicatriz sobre el sitio de la craneotomía por una combinación de pinzas, bisturí, y rongeurs.
- Después de visualizar la craneotomía, identificar una combinación de permanecer cerebelo y tejido cicatrizal que recubre la DCN. Utilice una succión Francés 5 para aspirar cerebelo suprayacente / tejido de la cicatriz (similar a la aspiración cerebelar anterior).
- Después de la aspiración, le espera un sangrado posterior, CSF build-up, y el resto de bits de cerebelo. Introducir rápidamente salina en la craneotomía para evitar la coagulación de la sangre. Use una combinación de suave dabbing punto dental y de succión para despejar el camino para la visualización directa de la DCN.
- Observar la superficie de la DCN. Realizar experimentos de fisiología con sede en la optogenética como DCN es ahora accesible. Introducir un estímulo de luz, por ejemplo, con una fibra óptica (Figura 2), para conducir un experimento basado en la optogenética.
5. Histología
- Tras la conclusión de los experimentos, sacrificar al ratón con una sobredosis de ketamina. Perfundir el ratón con solución salina normal seguido de paraformaldehído al 4%.
- Extraer el tronco cerebral del cráneo y post-fix durante 2 horas. Cryoprotect el tronco cerebral en el 30% de sacarosa durante 24 a 48 horas. Sección del tronco cerebral usando un criostato estándar con 60 micras secciones.
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Representative Results
Parcial cerebelosa Aspiración demuestre tener acceso a la coclear Núcleo
Después de la piel y el músculo que recubre el cráneo se retiran, superficie cráneo puntos de referencia, tales como las líneas de sutura coronal y Lamda, demostrar la localización aproximada de la craneotomía. Siguiendo craneotomía con gubia, el cerebelo se visualiza. La aspiración cuidadosa de la pequeña porción del cerebelo demuestra la visualización de la CN, que luego se puede inyectar (Figura 1).
Secundaria exposición coclear Núcleo de estimulación con láser azul claro
Después de la exposición inicial de la DCN, la transferencia de genes con una opsina, y el período de incubación, el DCN a continuación, puede ser estimulada por un láser de luz azul. La craneotomía secundaria exposición de la superficie de la DCN para la estimulación óptica es similar en enfoque técnico a la craneotomía primaria (Supp. Película 1). El DCN, siendouna estructura de superficie que es menos de 300 micras de espesor. La preparación experimental murino permanece viable durante un máximo de 6 horas.
Figura 1: aspiración cerebelosa parcial demuestre tener acceso al núcleo coclear dorsal. Panel izquierdo: Después de que el ratón se coloca en el soporte, se hace una incisión vertical a través de la piel y tejidos blandos a lo largo de la cara posterior del cráneo hasta el tejido blando del cuello. La piel es lateralizado, y se elimina el músculo que cubre la línea de sutura coronal panel medio:. Una craneotomía se completa sobre la región del cerebelo y el núcleo coclear dorsal subyacente con las gubias óseas Panel derecho:. Para la exposición del núcleo coclear dorsal , una succión Francés 5 se utiliza entonces para aspirar el cerebeloque recubre el núcleo coclear hasta que se visualiza el núcleo coclear dorsal.
Figura 2: La exposición de la superficie del núcleo coclear para la estimulación con láser de luz azul para producir una respuesta auditiva del tronco cerebral ópticamente-evocó colocación de fibra óptica acoplada a un láser de luz azul en la superficie del núcleo coclear dorsal permite la estimulación óptica. el núcleo coclear dorsal opsina infectadas. Bar Azul = 400 micras.
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Discussion
En este trabajo se describe la técnica de la visualización directa de la DCN en el modelo murino para la manipulación del sistema auditivo central. El enfoque esbozado de visualización directa ofrece ventajas significativas sobre la principal alternativa, que son enfoques estereotáxica. Principalmente, la visualización directa de la DCN permite confirmación inmediata del sitio del tronco cerebral, mientras que los enfoques estereotáxicas no proporcionan visualización directa. En experimentos que requieren prolongados períodos de incubación, como es el caso de la transferencia de genes mediada por virus, existe el potencial para la baja eficiencia de infección si la inyección "se pierde" la ubicación de destino. Además, un enfoque visualización directa permite la inyección en un amplio rango de edades de los animales. Un enfoque quirúrgico análoga puede ser utilizado en experimentos de supervivencia con otros modelos animales, tales como ratas y conejillos de indias.
Hay varios pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, laratón debe ser colocado correctamente en el soporte estereotáctica. Cualquier movimiento de la cabeza dará lugar a dificultad para hacer la craneotomía. En segundo lugar, la ubicación de la craneotomía es crucial. Si la craneotomía no se hace en la posición correcta, la visualización de la DCN después de la aspiración del cerebelo será difícil, si no imposible. Por último, el paso más crítico del protocolo es la aspiración parcial dirigida del cerebelo. Hay dos enfoques técnicos para la aspiración del cerebelo. En el primer enfoque aspiración, la succión se mantiene constantemente en el cerebelo, levantándola hacia arriba, fuera del tronco cerebral. En este enfoque, el DCN puede ser parcialmente visualiza debajo del cerebelo y de succión se lleva a cabo hasta que el CN está totalmente visualizado y el cerebelo eliminado. En el segundo enfoque, el cerebelo es parcialmente aspirado en varias pasadas en capas hasta que el DCN se visualiza. Puntos dentales pueden usarse con dabbing suave para borrar Fragme sangre o restante cerebelonts de la CN si no se pueden visualizar por completo.
El sangrado es un gran inconveniente del enfoque de la visualización directa y principalmente se produce durante la craneotomía inicial y después de la aspiración del cerebelo. En muchos casos, durante la craneotomía inicial, el sangrado se detendrá con el tiempo dentro de 2-5 min. La colocación de un papel de seda o punto dental en el sitio de sangrado y permitiendo para la hemostasia. En términos de sangrado después de la aspiración del cerebelo, es importante para inyectar solución salina normal (0,5-1 cc) en el sitio de la craneotomía para diluir la sangre y prevenir la formación de coágulos de sangre en el nivel de la NC. Una combinación de succión y suave punto dabbing dental se puede utilizar para eliminar la sangre y solución salina. De hecho, la principal limitación de este enfoque es la naturaleza invasiva del procedimiento.
El protocolo tiene implicaciones más allá de la manipulación del sistema auditivo. In vivo la transferencia génica en el sistema nervioso central permite la manipulación de divErse vías neurales y ha ofrecido penetraciones en múltiples funciones neuronales, incluyendo la memoria, el control motor, el olfato y audición. 16,21-26 El enfoque quirúrgico, que permite la visualización directa de los efectos de la transferencia de genes y la estimulación puede aplicarse potencialmente a otras regiones del tronco cerebral, tanto los enumerados anteriormente y otros. Tras el dominio de la visualización directa de la DCN, una serie de experimentos son posibles, incluyendo la inyección de opsinas en el CN y la estimulación posterior con un láser de luz azul. Otros experimentos neurofisiología, como la estimulación eléctrica y trazados inyectores neuronales, 18 también son factibles. El nivel de visualización y la duración de la estimulación de este enfoque permite múltiples aplicaciones para una amplia gama de experimentos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Financiación: Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Bertarelli (DJL), un MED-EL subvención (DJL), y los Institutos Nacionales de Salud subvenciones DC01089 (MCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic holder | Stoelting | 51500 | |
| Homeothermic blanket | Harvard | 507214 | |
| Scalpel blade #11 | Fine Surgical Tools | 10011-00 | |
| Iris scissor | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| 5 French suction | Symmetry Surgical | 2777914 | |
| Dental Points | Henry Schein | 100-8170 | |
| Bone rongeur | Fine Surgical Tools | 16020-14 | |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7633-01 | |
| 34 gauge, needle | Hamilton | 207434 | |
| Rongeurs | Fine Surgical Tools | 16021-14 |
References
- Lalwani, A., Mhatre, A. Cochlear gene therapy. Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).
- Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. Current issues in cochlear gene transfer. Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Koh, S., Pettis, R., Mhatre, A., Lalwani, A. Cochlear microinjection and its effects upon auditory function in the guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
- Lalwani, A., Walsh, B., Reilly, P., Muzyczka, N., Mhatre, A. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
- Wareing, M., Lalwani, A. Cochlear gene therapy: current perspectives. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 5 Suppl 1. (49), 27-30 (1999).
- Han, J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. J Clin Invest. 124 (3), 1114-1129 (2014).
- Adamantidis, A., et al. Optogenetic interrogation of dopaminergic modulation of the multiple phases of reward-seeking behavior. J Neurosci. 30 (31), 10829-10835 (2011).
- Kim, K., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PloS One. 7 (4), e33612 (2012).
- Britt, J., Bonci, A. Optogenetic interrogations of the neural circuits underlying addiction. Curr Opin Neurobiol. 23 (4), 539-545 (2013).
- Abbott, S., Coates, M., Stornetta, R., Guyenet, P. Optogenetic stimulation of c1 and retrotrapezoid nucleus neurons causes sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats. Hypertension. 61 (4), 835-841 (2013).
- Carter, M., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
- Darrow, K., et al. Optogenetic control of central auditory neurons. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. (695), (2012).
- Shimano, T., et al. Assessment of the AAV-mediated expression of channelrhodopsin-2 and halorhodopsin in brainstem neurons mediating auditory signaling. Brain Res. 1511, 138-152 (2013).
- Doucet, J., Ryugo, D. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. J Comp Neurol. 385, 245-264 (1997).
- Brown, M., Drottar, M., Benson, T., Darrow, K. Commissural axons of the mouse cochlear nucleus. J Comp Neurol. 521, 1683-1696 (2013).
- Verma, R., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hear Res. 310, 69-75 (2014).
- Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. J Neurophysiol. 93 (1), 557-569 (2005).
- Rolls, A., et al. Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation. Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 13305-13310 (2011).
- Huff, M., Miller, R., Deisseroth, K., Moorman, D., LaLumiere, R. Posttraining optogenetic manipulations of basolateral amygdala activity modulate consolidation of inhibitory avoidance memory in rats. Proc Natl Acad Sci. 110 (9), 3597-3602 (2013).
- Stortkuhl, K., Fiala, A. The Smell of Blue Light: A New Approach toward Understanding an Olfactory Neuronal Network. Front Neurosci. 5 (72), (2011).
- Hira, R., et al. Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex. J Neurosci Methods. 179 (2), 258-263 (2009).
- Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice. Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).
- Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
