Abstract
وقد تم إلى حد كبير هبط التحقيق في استخدام بوساطة فيروس نقل الجينات لاعتقال أو عكس فقدان السمع إلى النظام السمعي المحيطي. وقد درست قليل من الدراسات نقل الجينات إلى النظام السمعي المركزي. النواة الظهرية قوقعة (DCN) من الدماغ، الذي يحتوي على الخلايا العصبية من الدرجة الثانية من المسار السمعي، هو موقع محتمل لنقل الجينات. في هذا البروتوكول، ويتجلى تقنية لالتعرض المباشر والحد الأقصى من DCN الفئران عن طريق نهج الحفرة الخلفية. هذا النهج يسمح لأي عملية جراحية حادة أو البقاء على قيد الحياة. وبعد رؤية مباشرة للDCN، مجموعة من التجارب ممكنة، بما في ذلك حقن opsins في نواة القوقعة والتحفيز لاحق من الألياف البصرية بالإضافة إلى ضوء الليزر الأزرق. التجارب الفسيولوجيا العصبية الأخرى، مثل التحفيز الكهربائي واقتفاء أثر حاقن العصبية هي أيضا مجدية. إن مستوى visualizaنشوئها ومدة التحفيز جعل تحقيقه هذا النهج ينطبق على مجموعة واسعة من التجارب.
Protocol
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الإجراءات التجريبية وفقا للجنة رعاية الحيوان واستخدام ماساتشوستس العين والأذن مستوصف ومدرسة هارفارد الطبية، والتي تتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان الوطنية، بما في ذلك سياسة الصحة العامة خدمة للرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية، و دليل ILAR، وقانون رعاية الحيوان. الإجراءات التجريبية المذكورة أدناه التعرض التفاصيل من DCN الأيسر. استخدام الأدوات المعقمة أثناء أداء الجراحة البقاء على قيد الحياة.
1. حج القحف الابتدائية والظهرية القوقعة نواة التعرض
- خدر
- تخدير ماوس، الذين تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسابيع، وزنها 18-24 غ، مع زيلازين 20 ملغ / كغ والكيتامين 100 ملغ / كغ عن طريق إدارة داخل الصفاق. تأكيد التخدير المناسبة من خلال رصد معدل ضربات القلب ومعدل التنفس، فضلا عن أخمص القدمين قرصة الانسحاب لا ارادي. مكان البيطري مرهم على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير. مرة واحدة على نحو كاف تحت التخدير، والشعر يحلق المغطي رانه فروة الرأس لتوفير إمكانية الوصول دون عائق إلى موقع الجراحية.
- المواقع الجراحي
- ضع الماوس بشكل آمن في حامل التجسيمي الحيوانات الصغيرة، والذي عقد في مكان من قبل المشبك الخطم.
- تأكد من أن المشبك خطم واهية بما يكفي للسماح للتنفس كافية ولكن ضيق بما يكفي لشل تماما الرأس من الفأرة. إذا كان رئيس الماوس واهية، ومن المرجح أن تسقط من صاحب الرأس أثناء الجزء حج القحف الداخلي الحيوان.
- وضع أقطاب كهربائية الدماغ السمعية زرع في الأزياء القياسية، والذي يسمح لرصد معدل ضربات القلب. وينبغي رصد معدل التنفس عن طريق التصور. لاحظ أن معدل ضربات القلب الطبيعي ومعدل التنفس وسوف تختلف تبعا للعمر من الفأرة.
- يتم وضع ميزان الحرارة ويتم ضمان euthermia عن طريق وضع على بطانية التدفئة homeothermic.
- شق الجلد والتعرض للعظام الجداريين والقفوية من الجمجمة
- تحت microscمكتب مستشار رئيس الوزراء، وجعل شق عمودي من خلال الجلد تبدأ في خط الوسط، مباشرة بين الصيوان، وتمتد إلى الجزء الذيلية من قفا. بعد خط الوسط شق الجلد، تهجير الجلد أفقيا. تصور العضلات التي تغطي ترك الجانب الخلفي من الجمجمة.
- إزالة العضلات التي تغمر الأيسر الجدارية، بين الجداريين، والعظام القفوية من الجمجمة عن طريق التفكك المرفقات العضلات بالعظام كل منها مع مشرط أو مقص القزحية. مراقبة درجة صغيرة من النزيف على طول حواف قطع العضلات. تقليل ذلك عن طريق ضغط لطيف مع قضيب من القطن ذات الرؤوس لمدة 10-15 ثانية.
- المغطي حج القحف القوقعة نواة
- تحديد خطوط خياطة ذات الصلة، بما في ذلك خطوط الغرز السهمي وامدا (الشكل 1، لوحة اليسار).
- باستخدام رينجرز، وجعل حج القحف على العظم الجداري، غادر من خط الوسط، ~ 2 ملم الذيلية إلى خط امدا خياطة. هذه المنطقة يعتلي على DCN.
- Followinز حج القحف، ومراقبة طبقة رقيقة من الجافية أن يعتلي المخيخ. باستخدام شفرة مشرط، وإزالة الجافية. (الشكل 1، لوحة الأوسط).
ملاحظة: إزالة الجافية قد تتسبب درجة صغيرة من النزيف. والقصد من هذا عملية استخدام شفرة مشرط لإزالة الجافية إلى تقليل كمية فقدان الدم أثناء التطلع المخيخ، والتي سوف تجمع على سطح الدماغ وتحديد غامضة من DCN. إجمالي حجم دم الفأر هو ~ 1.5 مل لا ينبغي أن تتجاوز> من 15٪. إذا تجاوز نزيف هذا المبلغ، وينبغي توفير الفأر مع مع مكملات السوائل. - إزالة الدم متخثر تتراكب المخيخ مع قضيب من القطن طرف. اختياريا، بالتنقيط بلطف المالحة باستخدام نقطة الأسنان على المخيخ لمسح الدم بعيدا الدم.
- مخيخي الطموح
- باستخدام الشفط الفرنسي 5، نضح الجزء الجانبي الأكثر من المخيخ الأيسر تغمر DCN حتى DCN هو مقارنةالسياقية (الشكل 1، لوحة يمين). إزالة ما يقرب من 1/4 إلى 1/3 من المخيخ الأيسر. المعلم الرئيسي المحاذي لDCN هو أمبولة القناة الهلالية العلوية.
ملاحظة: الطموح من المخيخ هي الخطوة الرئيسية للبروتوكول. يتم تنفيذ تطلع موجهة من المخيخ أكبر قدر من النجاح في حال حدوثه في محاولة واحدة وليس مع يمر متعددة من شفط وهذا سوف يسبب النزيف. للمساعدة في الطموح، تعيين البؤري للمجهر على عمق المتوقع للCN، والتي ستكون البعيدة قليلا إلى السطح من المخيخ. ووضع البؤري للCN تحسين التصور وضمان وجود صورة حادة. - ومن المتوقع التالية الطموح، المزيد من النزيف، السائل النخاعي (CSF) بناء المتابعة، وتشريد المخيخ على DCN. غرس 0.5 سم مكعب من المياه المالحة عقيمة بسرعة في حج القحف لمنع تخثر الدم. مزيج من اللمس لطيف مع نقطة الأسنان وشفط قد تكون ثمتستخدم لازالة مسار لرؤية مباشرة للDCN. عدم الاتصال مباشرة سطح DCN.
- باستخدام الشفط الفرنسي 5، نضح الجزء الجانبي الأكثر من المخيخ الأيسر تغمر DCN حتى DCN هو مقارنةالسياقية (الشكل 1، لوحة يمين). إزالة ما يقرب من 1/4 إلى 1/3 من المخيخ الأيسر. المعلم الرئيسي المحاذي لDCN هو أمبولة القناة الهلالية العلوية.
2. حقن مكروي الضغط لبوساطة الفيروسات نقل الجينات والإنعاش الجراحي
- بعد DCN خالية من الدم المغطي وCSF ومرئيا بوضوح، وجعل إبر دقيقة الضغط في DCN باستخدام 10 ميكرولتر هاميلتون حقنة على مدى فترة 2 دقيقة.
- إدخال الإبرة مع مياداة مجهرية حتى غيض لم يعد مرئية تحت سطح DCN.
- لتحقيق الأداء الأمثل، واستخدام 33 أو 34 إبرة قياس (استخدام حقنة gastight مع إبرة قياس 34) مع شطبة الضحلة، مثل 45 درجة، للحد من صدمة حادة وتوطين حجم الحقن داخل DCN، وهي رقيقة و بنية الدماغ الضحلة (<300 ميكرون سميكة).
ملاحظة: أدوات حقن مكروي أخرى يمكن استخدامها مقرا لها. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون أداة حقن مرونة للسماح لبعض طفيف بند، إذا لزم الأمر لاستهداف مباشرة DCN. وعلاوة على ذلك، كما بتحريك الماوس قليلا في جميع أنحاء الداخلي بسبب التنفس، يجب أن تكون أداة قوية بما يكفي لتحمل كميات ضئيلة من الحركة.
3. استعادة الجراحي
- على الفور حقن التالية، وإعادة تقارب الجلد والسماح الماوس لاستعادة الانتعاش في الإجراء القياسي. سوف تبقى المخيخ وندبا في ملء تجويف الناجمة عن تطلع المخيخ. باستمرار مراقبة الحيوانات حتى يتم استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. مراقبة معدل ضربات القلب ومعدل التنفس، وكذلك القدرة على إطعام.
يتم إرجاع أية الحيوان الذي خضع لعملية جراحية لقفص مع الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما: ملاحظة. - إذا يبدأ الماوس على المشي في دوائر بعد العملية (<5٪ من الحالات)، وعادة 2-4 ساعة بعد إغلاق شق الجلد، وتضحي فورا الماوس، لأنه على الأرجح تغذية الوقت صعبة. تيومن المرجح الآثار الجانبية له نظرا لتطلع المخيخ. يجب مراقبة الحيوانات لآلام بعد العمل الجراحي، ويجب أن تعطى المخدرات المناسبة لضمان راحة الحيوان على أساس المعايير المؤسسية. قد تكون المضادات الحيوية اللازمة، إذا أدلة على العدوى.
4. الثانوي حج القحف والقوقعة نواة التعرض
- بعد 2-4 أسابيع للشفاء وبوساطة الفيروسات الجينات نقل الحضانة، وإعادة تخدير واحد حقن سابقا الماوس وكرر الخطوة 1،1-1،5 فترة حضانة الأمثل يختلف مع نوع الجين المنقول.
- إزالة ندبة الأنسجة اكثر من موقع حج القحف من قبل مجموعة من ملاقط، مشرط، ورينجرز.
- بعد تصور حج القحف، وتحديد مجموعة من المخيخ وندبا التي تغمر DCN المتبقية. استخدام شفط الفرنسي 5 إلى نضح المخيخ المغطي / ندبا (على غرار تطلع المخيخ السابق).
- التالية الطموح، ونتوقع المزيد من النزيف، CSF بuild المتابعة، والبتات المتبقية من المخيخ. إدخال بسرعة المالحة في حج القحف لمنع تخثر الدم. استخدام مزيج من لطيف اللمس نقطة الأسنان والشفط لتمهيد الطريق لرؤية مباشرة للDCN.
- مراقبة سطح DCN. إجراء تجارب علم وظائف الأعضاء على أساس علم البصريات الوراثي كما DCN الآن يمكن الوصول إليها. إدخال التحفيز خفيفة، على سبيل المثال مع الألياف البصرية (الشكل 2)، لدفع التجربة على أساس علم البصريات الوراثي.
5. علم الأنسجة
- وبعد الانتهاء من التجارب، والموت ببطء الفأر مع جرعة زائدة من الكيتامين. يروي الماوس مع محلول ملحي تليها بارافورمالدهيد 4٪.
- استخراج الدماغ من الجمجمة وبعد الإصلاح، لمدة 2 ساعة. Cryoprotect الدماغ في 30٪ سكروز لمدة 24-48 ساعة. قسم الدماغ باستخدام ناظم البرد قياسي باستخدام 60 ميكرون أقسام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الجزئي مخيخي الطموح يوضح الوصول إلى القوقعة نواة
بعد إزالة الجلد والعضلات التي تغمر الجمجمة، ومعالم سطح الجمجمة، مثل خطوط الدرز الإكليلي وLAMDA، وإظهار توطين التقريبي للحج القحف. وبعد حج القحف مع رينجرز، هو تصور المخيخ. طموح دقيق للجزء صغير من المخيخ يوضح التصور من CN، ومن ثم يمكن حقن (الشكل 1).
الثانوية القوقعة نواة التعرض للتحفيز مع ليزر أزرق فاتح
بعد التعرض الأولي للDCN، نقل الجينات مع أوبسين، وفترة الحضانة، وDCN يمكن بعد ذلك يحفزه على ضوء الليزر الأزرق. حج القحف الثانوي تعريض سطح DCN لتحفيز البصري هو مماثل في النهج الفني للحج القحف الابتدائي (الملحق. الفيلم 1). وDCN، ويجريبنية السطح الذي هو أقل من 300 ميكرون في سمك. إعداد الفئران التجريبية لا يزال قابلا للتطبيق لمدة تصل إلى 6 ساعات.
الشكل 1: يوضح الطموح المخيخ الجزئي الوصول إلى نواة القوقعة الظهرية. لوحة اليسار: بعد وضع الماوس في حامل، يتم إجراء شق عموديا من خلال الجلد والأنسجة اللينة على طول الجانب الخلفي من الجمجمة إلى الأنسجة اللينة من الرقبة. الجلد هو lateralized، وتتم إزالة العضلات التي تغمر خط الدرز الإكليلي لوحة الأوسط: ثم يتم الانتهاء من حج القحف على المنطقة من المخيخ والكامنة نواة القوقعة الظهرية مع رينجرز العظام لوحة اليمين: وبالنسبة للتعرض للالظهرية نواة القوقعة ، ثم يتم استخدام شفط الفرنسي 5 إلى نضح المخيخالمغطي نواة القوقعة حتى يتم تصور نواة القوقعة الظهرية.
الشكل 2: التعرض لسطح نواة القوقعة لالتحفيز مع الأزرق ضوء الليزر لإنتاج وأثار بصريا للاستجابة الدماغ السمعية التنسيب من الألياف البصرية بالإضافة إلى ليزر الضوء الأزرق على سطح ظهري نواة القوقعة يسمح لتحفيز البصري. الظهرية القوقعة نواة المصابة أوبسين. الأزرق شريط = 400 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتصف هذه الورقة تقنية التصور المباشر للDCN في نموذج الفئران للتلاعب من النظام السمعي المركزي. النهج المبين التصور المباشر يوفر مزايا هامة على البديل الرئيسي، والتي هي نهج التجسيمي. في المقام الأول، والتصور المباشر للDCN يسمح للتأكيد فوري للموقع من جذع الدماغ، في حين أن النهج التجسيمي لا تحمل رؤية مباشرة. في التجارب التي تستلزم فترات طويلة فترات الحضانة، كما هو الحال في فيروس بوساطة نقل الجينات، هناك احتمال لانخفاض كفاءة العدوى إذا كان حقن "يفتقد" موقع الهدف. وعلاوة على ذلك، نهج التصور المباشر يسمح للحقن في الأعمار واسعة النطاق الحيوان. ويمكن استخدام هذا النهج الجراحية مماثل في التجارب البقاء على قيد الحياة مع النماذج الحيوانية الأخرى، مثل الفئران والخنازير الغينية.
هناك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. أولا،الماوس يجب وضعه بشكل صحيح في حامل المجسم. فإن أي حركة من الرأس يؤدي إلى صعوبة في جعل حج القحف. ثانيا، موقع حج القحف أمر بالغ الأهمية. إذا لم يتم حج القحف في الموقف الصحيح، والتصور من DCN التالية تطلع المخيخ تكون صعبة، إن لم يكن مستحيلا. وأخيرا، فإن الخطوة الأكثر أهمية من البروتوكول هو التطلع توجه الجزئي من المخيخ. هناك نوعان من المناهج الفنية لتطلع المخيخ. في نهج طموح الأول، ويقام شفط باستمرار على المخيخ، ورفع لأعلى، قبالة الدماغ. في هذا النهج، وDCN يمكن تصور جزئيا تحت المخيخ ويقام شفط حتى يتم تصور للCN بالكامل والمخيخ إزالتها. وفي النهج الثاني، ويستنشق المخيخ جزئيا في العديد من التمريرات الطبقات حتى يتم تصور للDCN. ويمكن استخدام نقاط الأسنان مع اللمس لطيف لمسح الدم أو ما تبقى المخيخ fragmeاليلة من CN إذا كان لا يمكن تصور تماما.
النزيف هو العيب الرئيسي للنهج التصور المباشر ويحدث خلال حج القحف الأولي وبعد تطلع المخيخ أساسا. في كثير من الحالات خلال حج القحف الأولي، وسوف يتوقف النزيف مع مرور الوقت خلال 2-5 دقيقة. وضع المناديل الورقية أو نقطة طب الأسنان في موقع النزيف والسماح للالارقاء. من حيث النزيف بعد تطلع المخيخ، من المهم لحقن محلول ملحي (0.5-1 سم مكعب) في موقع حج القحف لتمييع الدم ومنع تشكل جلطة دموية في مستوى CN. مزيج من شفط ولطيف نقطة اللمس الأسنان يمكن أن تستخدم لازالة الدم والمالحة. والواقع أن أوجه القصور الرئيسية لهذا النهج هي طبيعة الغازية لهذا الإجراء.
بروتوكول آثار ما بعد التلاعب بالنظام السمعي. في الجسم الحي نقل الجينات في الجهاز العصبي المركزي يمكن التلاعب شعبةERSE المسارات العصبية وعرضت نظرة ثاقبة وظائف العصبية متعددة، بما في ذلك الذاكرة، والتحكم في المحركات، الشم، والسمع. 16،21-26 النهج الجراحية، مما يتيح رؤية مباشرة لأغراض نقل الجينات والتحفيز يحتمل أن تطبق على مناطق أخرى من جذع الدماغ، سواء تلك المذكورة أعلاه وغيرها. وبعد التمكن من رؤية مباشرة للDCN، مجموعة من التجارب ممكنة، بما في ذلك حقن opsins في CN والتحفيز لاحقة مع ضوء الليزر الأزرق. التجارب الفسيولوجيا العصبية الأخرى، مثل التحفيز الكهربائي واقتفاء أثر حاقن العصبية، 18 أيضا ممكنا. مستوى التصور ومدة التحفيز لهذا النهج يسمح لتطبيقات متعددة لمجموعة واسعة من التجارب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
التمويل: تم دعم هذا العمل من خلال منحة مؤسسة Bertarelli (DJL)، منحة MED-EL (DJL)، والمعاهد الوطنية للصحة المنح DC01089 (MCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic holder | Stoelting | 51500 | |
| Homeothermic blanket | Harvard | 507214 | |
| Scalpel blade #11 | Fine Surgical Tools | 10011-00 | |
| Iris scissor | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| 5 French suction | Symmetry Surgical | 2777914 | |
| Dental Points | Henry Schein | 100-8170 | |
| Bone rongeur | Fine Surgical Tools | 16020-14 | |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7633-01 | |
| 34 gauge, needle | Hamilton | 207434 | |
| Rongeurs | Fine Surgical Tools | 16021-14 |
References
- Lalwani, A., Mhatre, A. Cochlear gene therapy. Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).
- Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. Current issues in cochlear gene transfer. Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Koh, S., Pettis, R., Mhatre, A., Lalwani, A. Cochlear microinjection and its effects upon auditory function in the guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
- Lalwani, A., Walsh, B., Reilly, P., Muzyczka, N., Mhatre, A. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
- Wareing, M., Lalwani, A. Cochlear gene therapy: current perspectives. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 5 Suppl 1. (49), 27-30 (1999).
- Han, J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. J Clin Invest. 124 (3), 1114-1129 (2014).
- Adamantidis, A., et al. Optogenetic interrogation of dopaminergic modulation of the multiple phases of reward-seeking behavior. J Neurosci. 30 (31), 10829-10835 (2011).
- Kim, K., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PloS One. 7 (4), e33612 (2012).
- Britt, J., Bonci, A. Optogenetic interrogations of the neural circuits underlying addiction. Curr Opin Neurobiol. 23 (4), 539-545 (2013).
- Abbott, S., Coates, M., Stornetta, R., Guyenet, P. Optogenetic stimulation of c1 and retrotrapezoid nucleus neurons causes sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats. Hypertension. 61 (4), 835-841 (2013).
- Carter, M., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
- Darrow, K., et al. Optogenetic control of central auditory neurons. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. (695), (2012).
- Shimano, T., et al. Assessment of the AAV-mediated expression of channelrhodopsin-2 and halorhodopsin in brainstem neurons mediating auditory signaling. Brain Res. 1511, 138-152 (2013).
- Doucet, J., Ryugo, D. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. J Comp Neurol. 385, 245-264 (1997).
- Brown, M., Drottar, M., Benson, T., Darrow, K. Commissural axons of the mouse cochlear nucleus. J Comp Neurol. 521, 1683-1696 (2013).
- Verma, R., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hear Res. 310, 69-75 (2014).
- Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. J Neurophysiol. 93 (1), 557-569 (2005).
- Rolls, A., et al. Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation. Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 13305-13310 (2011).
- Huff, M., Miller, R., Deisseroth, K., Moorman, D., LaLumiere, R. Posttraining optogenetic manipulations of basolateral amygdala activity modulate consolidation of inhibitory avoidance memory in rats. Proc Natl Acad Sci. 110 (9), 3597-3602 (2013).
- Stortkuhl, K., Fiala, A. The Smell of Blue Light: A New Approach toward Understanding an Olfactory Neuronal Network. Front Neurosci. 5 (72), (2011).
- Hira, R., et al. Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex. J Neurosci Methods. 179 (2), 258-263 (2009).
- Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice. Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).
- Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
