Abstract
Onderzoek naar het gebruik van virus-gemedieerde genoverdracht te arresteren of achteruit gehoorverlies is grotendeels verbannen naar de perifere auditieve systeem. Enkele studies hebben genoverdracht naar het centrale auditieve systeem onderzocht. De dorsale cochleaire nucleus (DCN) van de hersenstam, die tweede orde neuronen van het auditieve pad bevat, is een potentiële site voor genoverdracht. In dit protocol is een techniek voor het direct en maximale blootstelling van de muizen DCN via een fossa posterior aanpak is. Deze aanpak maakt het voor zowel acute of overleving chirurgie. Na directe visualisatie van het DCN, een reeks experimenten mogelijk, zoals injectie van opsins in de cochleaire kern en daaropvolgende stimulatie door een optische vezel gekoppeld met een blauw laserlicht. Andere neurofysiologie experimenten, zoals elektrische stimulatie en neurale injector traces zijn ook mogelijk. Het niveau van visualizatie en de duur van de stimulatie stand te brengen is deze benadering voor diverse experimenten.
Protocol
OPMERKING: Alle experimentele procedures worden uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Care en gebruik Comite van het Massachusetts Eye en Ear Infirmary en de Harvard Medical School, die de nationale richtlijnen verzorging van dieren te volgen, waaronder GGD Beleid inzake Humane zorg en het gebruik van proefdieren, de ILAR Guide, en de Animal Welfare Act. Opgesomd experimentele procedures hieronder detail blootstelling van de linker DCN. Gebruik steriele instrumenten tijdens het uitvoeren van de overleving chirurgie.
1. Primaire Craniotomie en Dorsale Cochlear Nucleus Exposure
- Anesthesie
- Verdoven een muis, 8-12 weken, gewicht 18-24 g jaar, met xylazine 20 mg / kg ketamine en 100 mg / kg via de intraperitoneale toediening. Bevestig de juiste verdoving door bewaking hartslag, ademhaling, evenals teen knijpen terugtrekking reflex. Plaats dierenarts zalf op ogen droog terwijl onder narcose voorkomen. Zodra voldoende onder narcose, scheren haar bovenliggende tHij hoofdhuid onbelemmerde toegang tot de chirurgische site.
- Chirurgische positionering
- Plaats de muis stevig in een klein dier stereotaxisch houder, op zijn plaats gehouden door een snuit klem.
- Zorg ervoor dat de snuit klem is los genoeg zodat er passende ademhaling, maar strak genoeg om volledig te immobiliseren het hoofd van de muis. Als de muis hoofd los is, het dier is waarschijnlijk uit de kop houder te vallen tijdens de craniotomie deel van de procedure.
- Plaats auditieve hersenstam implantaat elektroden in standaard mode, die het mogelijk maakt voor hartslagmeting. Rate luchtwegen moet worden gecontroleerd door visualisatie. Merk op dat de normale hartslag en ademhaling zal variëren afhankelijk van de leeftijd van de muis.
- Een thermometer wordt via plaatsing geplaatst en euthermia is verzekerd op een homeothermic verwarming deken.
- Huidincisie en de blootstelling van de interparietal en occipitale beenderen van de schedel
- Onder een Microscope, maak een verticale incisie door de huid vanaf de middellijn, rechtstreeks tussen de oorschelp, en zich uitstrekt tot het caudale gedeelte van de achterhoofdsknobbel. Volgende middellijn incisie in de huid, verdringen de huid lateraal. Visualiseer de spieren die het liet de achterste deel van de schedel.
- Verwijder spier bovenop de linker pariëtale, interparietal en occipitale beenderen van de schedel door exarticulatie van spieraanhechtingen hun respectieve botten met een scalpel of iris schaar. Observeer een kleine mate van bloeding langs cut spier randen. Minimaliseer deze door lichte druk met een wattenstaafje voor 10-15 sec.
- Craniotomie bovenliggende Cochlear Nucleus
- Identificeer relevante hechtdraad lijnen, met inbegrip van sagittale en lambda hechtingen lijnen (figuur 1, linker paneel).
- Met behulp van rongeurs, maak een craniotomie over de interparietal bot, links van de middellijn, ~ 2 mm caudaal van de lambda hechting. Deze regio ligt over de DCN.
- Following craniotomie, observeren een dun laagje dura dat de kleine hersenen bedekt. Met behulp van een scalpel, verwijder de dura. (Figuur 1, Midden-Panel).
LET OP: Het verwijderen van dura kan een kleine mate van bloeden veroorzaken. Dit proces van het gebruik van de scalpel de dura verwijderen beoogt de hoeveelheid bloedverlies te verminderen tijdens het cerebellum aspiratie, die pool op de hersenstam oppervlak obscure identificatie van het DCN. De totale bloedvolume van muis ~ 1,5 ml niet overschrijden> dan 15%. Als bloeden dit bedrag overschrijdt, moet de muis worden voorzien met vocht suppletie. - Verwijder gestold bloed bedekken het cerebellum met de katoenen tip applicator. Optioneel zachtjes druppelen zoutoplossing met behulp van een tandheelkundige punt op de kleine hersenen om bloed bloed te ruimen.
- Cerebellaire Aspiration
- Met een 5 French zuiging, zuig het meest laterale deel van de linker cerebellum bovenop de DCN totdat het DCN is visUAL (figuur 1, rechter paneel). Verwijder ongeveer 1/4 tot 1/3 van de linker cerebellum. Het belangrijkste monument naast de DCN is de ampulla van de superieure halfronde gracht.
OPMERKING: Aspiratie van het cerebellum is de belangrijkste stap van het protocol. Gericht aspiratie van het cerebellum is het meest succesvol uitgevoerd als het zich voordoet in één poging en niet met meerdere passages van de zuiging, omdat dit zal leiden tot bloeden. Om te helpen bij aspiratie, stelt het brandvlak van de microscoop op de verwachte diepte van de GN, die enigszins distaal van het oppervlak van het cerebellum is. De focal plane instellen op de GN zal visualisatie te verbeteren en te zorgen voor een scherp beeld. - Als gevolg van aspiratie, verder bloeden, cerebrospinale vloeistof (CSF) te bouwen-up, en het cerebellum verdringing op de DCN worden verwacht. Inboezemen 0,5 cc steriele zoutoplossing snel in de craniotomie om bloedstolling te voorkomen. Een combinatie van zacht deppen met een tandheelkundige punt en zuigkracht kan dangebruikt te ruimen een pad voor directe visualisatie van het DCN. Niet direct contact op met de oppervlakte van de DCN.
- Met een 5 French zuiging, zuig het meest laterale deel van de linker cerebellum bovenop de DCN totdat het DCN is visUAL (figuur 1, rechter paneel). Verwijder ongeveer 1/4 tot 1/3 van de linker cerebellum. Het belangrijkste monument naast de DCN is de ampulla van de superieure halfronde gracht.
2. Druk Micro-injectie voor-Virus gemedieerde Gene Transfer en Chirurgische Recovery
- Na de DCN is vrij van bovenliggende bloed en CSF en is duidelijk zichtbaar, maken druk micro-injecties in de DCN met behulp van een 10 ul Hamilton spuit over een 2 min periode.
- Breng de naald met een micromanipulator totdat de tip niet meer zichtbaar onder het oppervlak van het DCN.
- Voor optimale prestaties gebruikt een 33 of 34 gauge naald (gebruik een gasdichte injectiespuit met 34 gauge naald) met ondiepe afschuining, zoals 45 °, stompe trauma te minimaliseren en het injectievolume binnen het DCN, dat een dun lokaliseren en ondiepe hersenstam structuur (<300 micrometer dik).
OPMERKING: Andere micro-injectie instrumenten kunnen worden gebruikt gebaseerd. Idealiter zou de injectie instrument flexibel waardoor enige lichte bend, indien nodig direct richten op de DCN. Verder, zoals de muis zich verplaatst gedurende de procedure door ademhaling, het instrument moet robuust genoeg zijn om kleine hoeveelheden beweging weerstaan.
3. Chirurgische Recovery
- Onmiddellijk na de injectie, opnieuw benaderen van de huid en laat de muis om te herstellen per standaard invorderingsprocedure. Resterende cerebellum en littekenweefsel zal in de holte, veroorzaakt door aspiratie van het cerebellum te vullen. Voortdurend te controleren dieren totdat voldoende bewustzijn is hersteld om borstligging behouden. Monitor hartslag, ademhaling, alsmede het vermogen om te voeden.
OPMERKING: Geen enkel dier dat een operatie heeft ondergaan is teruggekeerd naar een kooi met andere dieren tot ze volledig hersteld. - Als een muis begint te lopen in cirkels na operatie (<5% van de gevallen), meestal 2-4 uur na sluiting van de incisie in de huid, onmiddellijk te offeren de muis, omdat het waarschijnlijk zou hebben een moeilijke tijd het voeden. Tzijn zijde effect is waarschijnlijk te wijten aan aspiratie van het cerebellum. Het dier moeten worden gecontroleerd op de pijn na de operatie, en passende verdovende middelen moet worden besteed aan het comfort van dieren te verzekeren op basis van de institutionele normen. Antibiotica kan nodig zijn, als bewijs van de infectie.
4. Secundaire Craniotomie en Cochlear Nucleus Exposure
- Na 2-4 weken van genezing en virus-gemedieerde genoverdracht incubatie opnieuw verdoven een eerder geïnjecteerde muis en herhaal stap 1,1-1,5 Optimale incubatietijd varieert met het type van gen overgedragen.
- Verwijder littekenweefsel over de craniotomie plaats door een combinatie van een pincet, scalpel, en rongeurs.
- Na het visualiseren van de craniotomie, identificeren van een combinatie van de resterende cerebellum en littekenweefsel bovenop de DCN. Gebruik een 5 Franse afzuigen bovenliggende cerebellum / littekenweefsel (vergelijkbaar met de vorige cerebellaire aspiratie) te zuigen.
- Als gevolg van aspiratie, verwachten een verdere bloeden, CSF build-up, en de overige bits van het cerebellum. Snel introduceren zoutoplossing in de craniotomie om bloedstolling te voorkomen. Gebruik een combinatie van zachte tandheelkundige punt deppen en zuigkracht om het pad voor de directe visualisatie van de DCN wissen.
- Let op de oppervlakte van de DCN. Uitvoeren-optogenetics basis fysiologie experimenten als DCN is nu toegankelijk. Introductie van een licht stimulus, bijvoorbeeld een optische vezel (Figuur 2), om een optogenetics experiment brengt drijven.
5. Histologie
- Na afloop van experimenten euthanaseren de muis met een overdosis ketamine. Perfuse de muis met een fysiologische zoutoplossing, gevolgd door 4% paraformaldehyde.
- Pak de hersenstam van de schedel en de post-fix voor 2 uur. Cryoprotect de hersenstam in 30% sucrose gedurende 24-48 uur. Deel van de hersenstam met een standaard cryostaat met behulp van 60 micrometer secties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gedeeltelijke Cerebellar Aspiration toegang verschaft tot de Cochlear Nucleus
Nadat de huid en spieren die over de schedel verwijderd, schedeloppervlak monumenten, zoals de coronale en Lamda hechtdraad lijnen tonen de benaderde lokalisatie van de craniotomie. Na craniotomie met rongeurs, wordt het cerebellum gevisualiseerd. Zorgvuldig aspireren van het kleine deel van het cerebellum toont visualisatie van de GN, die vervolgens kan worden geïnjecteerd (Figuur 1).
Secundaire Cochlear Nucleus Exposure voor stimulatie met Blue Light Laser
Na de eerste blootstelling van de DCN, genoverdracht met een opsin, en de incubatietijd kan de DCN dan worden gestimuleerd door een blauw licht laser. De secundaire craniotomie blootstellen van het oppervlak van het DCN voor optische stimulatie soortgelijke technische aanpak van de primaire craniotomie (Supp. Film 1). De DCN, zijndeeen oppervlaktestructuur die kleiner is dan 300 urn dik. De experimentele muizen bereiding levensvatbaar blijft tot 6 h.
Figuur 1: Gedeeltelijke cerebellaire aspiratie toegang verschaft tot de dorsale cochleaire nucleus. Linker paneel: Na de muis wordt in de houder, een incisie wordt verticaal door de huid en zacht weefsel langs de dorsale zijde van de schedel om de zachte weefsels van de hals gemaakt. De huid is gelateraliseerd, en de spier bovenop de coronale hechtdraad lijn wordt verwijderd Middle Panel:. Een craniotomie wordt dan voltooid over de regio van het cerebellum en de onderliggende dorsale cochleaire nucleus met het bot rongeurs Right Panel:. Voor de blootstelling van de dorsale cochleaire nucleus een 5 French zuigkracht wordt vervolgens gebruikt om de kleine hersenen zuigenbovenop de cochleaire nucleus tot de dorsale cochleaire nucleus wordt gevisualiseerd.
Figuur 2: Blootstelling van het oppervlak van de cochleaire kern van stimulatie met blauw licht laser een optisch opgewekte auditieve hersenstam respons Plaatsing van optische vezel gekoppeld met een blauw laserlicht op het oppervlak van de dorsale cochleaire kern zorgt voor optische stimulatie van. de-opsin geïnfecteerde dorsale slakkenhuis kern. Blauwe balk = 400 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft de techniek van directe visualisatie van het DCN in het muismodel manipulatie van het centrale auditieve systeem. De geschetste aanpak van directe visualisatie biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van de belangrijkste alternatief, dat stereotaxisch benaderingen zijn. In de eerste plaats, directe visualisatie van de DCN zorgt voor directe bevestiging van de site van de hersenstam, terwijl stereotaxisch benaderingen niet veroorloven directe visualisatie. In experimenten die incubatietijd noodzaken verlengd, zoals het geval is in virus-gemedieerde genoverdracht, er tegen lage infectie-efficiëntie als de injectie "mist" de doellocatie. Verder is een directe visualisatie aanpak maakt injectie in diverse dier ouder. Een analoge chirurgische benadering kan worden gebruikt overlevingsexperimenten met andere diermodellen, zoals ratten en cavia's.
Er zijn een aantal cruciale stappen in dit protocol. Ten eerste, demuis moet goed in de stereotactische houder worden geplaatst. Elke beweging van het hoofd zal resulteren in moeilijkheden waardoor de craniotomie. Tweede, de locatie van de craniotomie is cruciaal. Als de craniotomie niet in de juiste positie zal visualisatie van de DCN na aspiratie van het cerebellum uitdagend, zo niet onmogelijk. Ten slotte is de meest kritische fase van het protocol is de gedeeltelijke gericht aspiratie van het cerebellum. Er zijn twee technische benaderingen van aspiratie van het cerebellum. In de eerste benadering aspiratie, wordt de zuigkracht constant gehouden op het cerebellum tillen boven, van de hersenstam. In deze benadering kan het DCN gedeeltelijk gevisualiseerd onder het cerebellum en zuiging wordt gehouden totdat de GN volledig gevisualiseerd en cerebellum verwijderd. In de tweede benadering wordt het cerebellum gedeeltelijk opgezogen in meerdere lagen passen totdat de DCN wordt gevisualiseerd. Tandheelkundige punten kunnen worden gebruikt met zacht deppen met bloed of resterende cerebellum Fragme wissennts van de GN indien niet volledig zichtbaar.
Bloeden is een belangrijk nadeel van de directe visualisatie aanpak en voornamelijk optreedt tijdens de eerste craniotomie en na cerebellaire aspiratie. In veel gevallen tijdens de eerste craniotomie, zal bloeden te stoppen met de tijd binnen 2-5 min. Het plaatsen van een tissuepapier of tandheelkundige punt op de plaats van bloeden en waardoor hemostase. Qua bloeden na cerebellaire aspiratie, is het belangrijk fysiologisch zout (0,5-1 cc) op de plaats van de craniotomie injecteren om het bloed te verdunnen en voorkomen de vorming van bloedklonters op het niveau van de GN. Een combinatie van afzuig- en zachte tandheelkundige punt deppen kan worden gebruikt om bloed en zoutoplossing ruimen. Inderdaad, de belangrijkste beperking van deze benadering is het invasieve karakter van de procedure.
Het protocol heeft implicaties voorbij manipulatie van het gehoorsysteem. In vivo genoverdracht in het centrale zenuwstelsel maakt manipulatie van divErse zenuwbanen en heeft aangeboden inzichten in verschillende neurale functies, zoals het geheugen, motorische controle, reukzin en gehoor. 16,21-26 De chirurgische benadering, waardoor directe visualisatie behoeve van gentransfer en stimulatie kunnen eventueel worden toegepast op andere gebieden van de hersenstam, beide hierboven genoemde en andere. Volgende beheersing van directe visualisatie van de DCN, een groot aantal experimenten zijn mogelijk, waaronder injectie van opsins in de GN en de daaropvolgende stimulatie met een blauw licht laser. Andere neurofysiologie experimenten, zoals elektrische stimulatie en neurale injector traces, 18 zijn ook mogelijk. Het niveau van visualisatie en de duur van de stimulatie van deze benadering voor meerdere toepassingen voor een groot aantal experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Financiering: Dit werk werd ondersteund door een stichting Bertarelli subsidie (DJL), een MED-EL-subsidie (DJL), en een National Institutes of Health Subsidies DC01089 (MCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic holder | Stoelting | 51500 | |
| Homeothermic blanket | Harvard | 507214 | |
| Scalpel blade #11 | Fine Surgical Tools | 10011-00 | |
| Iris scissor | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| 5 French suction | Symmetry Surgical | 2777914 | |
| Dental Points | Henry Schein | 100-8170 | |
| Bone rongeur | Fine Surgical Tools | 16020-14 | |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7633-01 | |
| 34 gauge, needle | Hamilton | 207434 | |
| Rongeurs | Fine Surgical Tools | 16021-14 |
References
- Lalwani, A., Mhatre, A. Cochlear gene therapy. Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).
- Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. Current issues in cochlear gene transfer. Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Koh, S., Pettis, R., Mhatre, A., Lalwani, A. Cochlear microinjection and its effects upon auditory function in the guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
- Lalwani, A., Walsh, B., Reilly, P., Muzyczka, N., Mhatre, A. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
- Wareing, M., Lalwani, A. Cochlear gene therapy: current perspectives. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 5 Suppl 1. (49), 27-30 (1999).
- Han, J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. J Clin Invest. 124 (3), 1114-1129 (2014).
- Adamantidis, A., et al. Optogenetic interrogation of dopaminergic modulation of the multiple phases of reward-seeking behavior. J Neurosci. 30 (31), 10829-10835 (2011).
- Kim, K., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PloS One. 7 (4), e33612 (2012).
- Britt, J., Bonci, A. Optogenetic interrogations of the neural circuits underlying addiction. Curr Opin Neurobiol. 23 (4), 539-545 (2013).
- Abbott, S., Coates, M., Stornetta, R., Guyenet, P. Optogenetic stimulation of c1 and retrotrapezoid nucleus neurons causes sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats. Hypertension. 61 (4), 835-841 (2013).
- Carter, M., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
- Darrow, K., et al. Optogenetic control of central auditory neurons. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. (695), (2012).
- Shimano, T., et al. Assessment of the AAV-mediated expression of channelrhodopsin-2 and halorhodopsin in brainstem neurons mediating auditory signaling. Brain Res. 1511, 138-152 (2013).
- Doucet, J., Ryugo, D. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. J Comp Neurol. 385, 245-264 (1997).
- Brown, M., Drottar, M., Benson, T., Darrow, K. Commissural axons of the mouse cochlear nucleus. J Comp Neurol. 521, 1683-1696 (2013).
- Verma, R., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hear Res. 310, 69-75 (2014).
- Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. J Neurophysiol. 93 (1), 557-569 (2005).
- Rolls, A., et al. Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation. Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 13305-13310 (2011).
- Huff, M., Miller, R., Deisseroth, K., Moorman, D., LaLumiere, R. Posttraining optogenetic manipulations of basolateral amygdala activity modulate consolidation of inhibitory avoidance memory in rats. Proc Natl Acad Sci. 110 (9), 3597-3602 (2013).
- Stortkuhl, K., Fiala, A. The Smell of Blue Light: A New Approach toward Understanding an Olfactory Neuronal Network. Front Neurosci. 5 (72), (2011).
- Hira, R., et al. Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex. J Neurosci Methods. 179 (2), 258-263 (2009).
- Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice. Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).
- Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
