Abstract
Enquête sur l'utilisation du transfert de gène à médiation virale pour arrêter ou inverser la perte auditive a largement été reléguée au système auditif périphérique. Peu d'études ont examiné le transfert de gènes au système auditif central. Le noyau cochléaire dorsal (DCN) du tronc cérébral, qui contient des neurones de second ordre de la voie auditive, est un site potentiel de transfert de gènes. Dans ce protocole, une technique pour une exposition directe et maximale de la DCN murin par une approche de la fosse postérieure est démontrée. Cette approche permet une chirurgie aiguë ou la survie. Suite à la visualisation directe de la DCN, une multitude d'expériences sont possibles, y compris l'injection de opsins dans le noyau cochléaire et une stimulation ultérieure par une fibre optique couplée à un laser à lumière bleue. D'autres expériences de neurophysiologie, telles que la stimulation électrique et tracés d'injection de neurones sont également possibles. Le niveau de visualisation et la durée de la stimulation font réalisables cette approche applicable à un large éventail d'expériences.
Protocol
NOTE: Toutes les procédures expérimentales sont effectuées en conformité avec le soin et l'utilisation Comité pour les Animaux du Massachusetts Eye and Ear Infirmary et Harvard Medical School, qui suivent les lignes directrices de soins aux animaux nationaux, y compris la politique de santé publique service sur Humane soin et l'utilisation des animaux de laboratoire, le Guide ILAR, et la Loi sur la protection des animaux. Les procédures expérimentales énumérés ci-dessous l'exposition détaillée de la DCN gauche. Utilisez des instruments stériles tout en effectuant la chirurgie de survie.
1. Craniotomie primaire et Dorsale Cochlear Nucleus exposition
- Anesthésie
- Anesthésier une souris, âgées de 8 à 12 semaines, pesant 18 à 24 g, de xylazine 20 mg / kg de kétamine et 100 mg / kg par une administration intrapéritonéale. Confirmez anesthésie appropriée par le taux de surveillance cardiaque, fréquence respiratoire, ainsi que pincement de l'orteil réflexe de retrait. Lieu vétérinaire onguent sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Une fois correctement sous anesthésie, cheveux rasage recouvrant til cuir chevelu pour fournir un accès libre sur le site chirurgical.
- Positionnement chirurgical
- Placez la souris en toute sécurité dans un petit porte-stéréotaxique animal, maintenu en place par une pince de museau.
- Assurez-vous que la pince de museau est assez lâche pour permettre une respiration adéquate, mais assez serré pour immobiliser complètement la tête de la souris. Si la tête de la souris est lâche, l'animal est susceptible de tomber sur le support de tête pendant la partie craniotomie de la procédure.
- Placez électrodes implant du tronc cérébral à la mode standard, ce qui permet un suivi de la fréquence cardiaque. La fréquence respiratoire doit être surveillée par la visualisation. Notez que la fréquence cardiaque normale et la fréquence respiratoire varient en fonction de l'âge de la souris.
- Un thermomètre est placé et euthermia est assurée par le placement sur une couverture chauffante homéotherme.
- incision de la peau et l'exposition des os interpariétales et occipital du crâne
- Sous un Microscope, faire une incision verticale à travers la peau à partir de la ligne médiane, directement entre le pavillon de l'oreille, et se étendant jusqu'à la partie caudale de l'occiput. Après incision médiane de la peau, la peau déplacer latéralement. Visualiser les muscles couvrant la gauche de la face postérieure du crâne.
- Retirer muscle recouvrant la pariétale gauche, interpariétal, et les os occipital du crâne par désarticulation des attaches musculaires à leurs os respectifs avec un scalpel ou de l'iris ciseaux. Observer un petit degré de saignement le long des bords de coupe de muscle. Réduire cette par une légère pression avec un applicateur coton-tige pour 10-15 sec.
- Recouvrant Craniotomie Cochlear Nucleus
- Identifier les lignes de suture pertinents, y compris des sutures sagittale et lambda lignes (Figure 1, panneau de gauche).
- Utilisation de rongeurs, faire une craniotomie sur l'os interpariétal, à gauche de la ligne médiane, ~ 2 mm caudale à la ligne lambda de suture. Cette région recouvre la DCN.
- Following craniotomie, observer une mince couche de dure qui recouvre le cervelet. En utilisant une lame de scalpel, enlever la dure-mère. (Figure 1, panneau moyen).
REMARQUE: Enlèvement de dure peut causer un faible degré de saignement. Ce processus d'utilisation de la lame de scalpel pour enlever la dure-mère est destiné à réduire la quantité de perte de sang pendant l'aspiration de cervelet, qui mettra en commun sur la surface du tronc cérébral et l'identification obscur de la DCN. Le volume de sang total de souris est d'environ 1,5 ml devraient pas dépasser> à 15%. Si le saignement dépasse ce montant, la souris doit être muni d'une supplémentation fluide. - Retirer sang coagulé recouvrant le cervelet avec la pointe du coton applicateur. Eventuellement, égoutter doucement solution saline en utilisant un point dentaires sur le cervelet pour effacer le sang loin sang.
- Cérébelleuse aspiration
- L'utilisation d'un 5 aspiration français, aspirer la partie latérale la plus du cervelet gauche recouvrant la DCN jusqu'à ce que la DCN est visUAL (Figure 1, panneau de droite). Retirer environ 1/4 à 1/3 du cervelet gauche. Le principal point de repère à côté de la DCN est l'ampoule du canal semi-circulaire supérieur.
NOTE: L'aspiration du cervelet est l'étape clé du protocole. Réalisé aspiration du cervelet est effectué le plus de succès si elle se produit en une seule tentative et non avec de multiples passes de l'aspiration car cela pourrait causer des saignements. Pour aider à l'aspiration, régler le plan focal du microscope à la profondeur prévue de la NC, qui sera légèrement distale par rapport à la surface du cervelet. Réglage du plan focal du CN améliorer la visualisation et d'assurer une image nette. - Après aspiration, le saignement, liquide céphalo-rachidien (LCR) accumulation, et le déplacement du cervelet sur la DCN sont attendus. Instiller 0,5 ml de solution saline stérile rapidement dans la craniotomie pour empêcher la coagulation du sang. Une combinaison de tamponnant doucement avec un point dentaire et aspiration peut alors êtreutilisé pour déblayer un chemin pour la visualisation directe de la DCN. Ne pas directement contact avec la surface de la DCN.
- L'utilisation d'un 5 aspiration français, aspirer la partie latérale la plus du cervelet gauche recouvrant la DCN jusqu'à ce que la DCN est visUAL (Figure 1, panneau de droite). Retirer environ 1/4 à 1/3 du cervelet gauche. Le principal point de repère à côté de la DCN est l'ampoule du canal semi-circulaire supérieur.
2. microinjection à pression à médiation virale Gene Transfer and Recovery chirurgical
- Après la DCN est libre de sang recouvrant et le LCR et est clairement visible, assurez microinjections de pression dans la DCN en utilisant une seringue Hamilton de 10 ul sur une période de 2 min.
- Introduire l'aiguille avec un micromanipulateur jusqu'au bout ne est plus visible sous la surface de la DCN.
- Pour des performances optimales, utilisez une aiguille de calibre 33 ou 34 (utiliser une seringue étanche aux gaz avec l'aiguille 34 gauge) avec un biseau peu profonde, comme 45 °, afin de minimiser traumatisme contondant et localiser le volume d'injection dans le DCN, qui est un mince et la structure du tronc cérébral peu profondes (<300 um d'épaisseur).
NOTE: D'autres instruments de micro-injection peuvent être fondées utilisé. Idéalement, l'instrument d'injection doit être souple pour permettre une légère bend, si nécessaire pour cibler directement la DCN. En outre, comme la souris se déplace légèrement tout au long de la procédure en raison de la respiration, l'instrument doit être suffisamment robuste pour supporter des quantités mineures de mouvement.
3. Récupération chirurgicale
- Immédiatement après l'injection, re-rapprochant la peau et laissez la souris pour récupérer par la procédure de récupération standard. Restant tissu cicatriciel cervelet et remplira la cavité provoquée par l'aspiration du cervelet. Surveiller constamment animaux jusqu'à ce que la conscience suffisante est retrouvé à maintenir décubitus sternal. Surveiller le rythme cardiaque, fréquence respiratoire, ainsi que la capacité à nourrir.
REMARQUE: Aucun animal qui a subi une intervention chirurgicale est retourné dans une cage avec les autres animaux jusqu'à guérison complète. - Si une souris commence à tourner en rond après l'opération (<5% des cas), généralement 2-4 heures après la fermeture de l'incision de la peau, immédiatement sacrifier la souris, comme il aurait probablement un temps à se nourrir difficile. Tson effet secondaire est probablement due à l'aspiration du cervelet. L'animal doit être surveillé pour la douleur post-opératoire, et les stupéfiants appropriées devrait être accordée pour assurer le confort des animaux basée sur des normes institutionnelles. Les antibiotiques peuvent être nécessaires, si la preuve de l'infection.
4. secondaire exposition Craniotomie et Cochlear Nucleus
- Après 2-4 semaines de cicatrisation et virus transfert génique à médiation par incubation, re-anesthésier une souris et répétez les étapes 1.1 à 1.5 temps d'incubation optimal précédemment injectée varie en fonction du type de gène transféré.
- Retirer le tissu de cicatrice sur le site de craniotomie par une combinaison de pinces, scalpel, et rongeurs.
- Après la visualisation de la craniotomie, identifier une combinaison de cervelet et tissu cicatriciel recouvrant la DCN reste. Utilisez un 5 aspiration française pour aspirer cervelet recouvrant / tissu cicatriciel (similaire à l'aspiration cérébelleuse précédente).
- Après aspiration, attendre le saignement, CSF benforcer-up, et les bits restants du cervelet. Introduire rapidement une solution saline dans la craniotomie pour empêcher la coagulation du sang. Utilisez une combinaison de douceur dentaires tamponnant point et d'aspiration pour dégager le chemin pour la visualisation directe de la DCN.
- Observer la surface de la DCN. Effectuer des expériences de physiologie base optogénétique-DCN est maintenant accessible. Présentez un stimulus lumineux, par exemple avec une fibre optique (Figure 2), à conduire une expérience basée optogénétique.
5. histologie
- Après la conclusion d'expériences, euthanasier la souris avec une surdose de kétamine. Perfuser la souris avec une solution saline normale suivie par 4% de paraformaldéhyde.
- Extraire le tronc cérébral du crâne et de post-correctif pour 2 heures. Cryoprotect le tronc cérébral dans 30% de saccharose pendant 24-48 h. Section du tronc cérébral au moyen d'un cryostat standard en utilisant 60 sections um.
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Representative Results
Partielle cérébelleuse aspiration démontre avoir accès à noyau cochléaire
Après la peau et le muscle recouvrant le crâne, les sites d'intérêt sont éliminés de la surface du crâne, comme les lignes de suture coronale et lamda, démontrer la localisation approximative de la craniotomie. Après craniotomie avec rongeurs, le cervelet est visualisée. Une aspiration soigneuse de la petite partie du cervelet montre la visualisation de la NC, qui peut alors être injecté (figure 1).
Exposition secondaire Cochlear Nucleus pour stimulation par laser Light Blue
Après une première exposition de la DCN, le transfert de gènes avec un opsine, et la période d'incubation, la DCN peut alors être stimulée par un laser à lumière bleue. La craniotomie secondaire exposer la surface de la DCN pour la stimulation optique est similaire dans l'approche technique à la craniotomie primaire (Supp. 1 Film). La DCN, étantune structure de surface qui est inférieure à 300 pm d'épaisseur. La préparation expérimental murin reste viable pour un maximum de 6 heures.
Figure 1: aspiration cérébelleuse partielle démontre avoir accès à du noyau cochléaire dorsal. Panneau de gauche: Après la souris est placée dans le support, une incision est faite verticalement à travers la peau et des tissus mous ainsi que la face postérieure du crâne des tissus mous du cou. La peau est latéralisée, et le muscle recouvrant la ligne de suture coronale est retiré Panel Moyen:. Une craniotomie est ensuite complétée sur la région du cervelet et sous-jacente noyau cochléaire dorsal avec les rongeurs d'os panneau de droite:. Pour l'exposition du noyau cochléaire dorsal , 5 aspiration française est ensuite utilisé pour aspirer le cerveletrecouvrant le noyau cochléaire jusqu'à ce que le noyau cochléaire dorsal est visualisée.
Figure 2: Exposition de la surface du noyau cochléaire pour la stimulation avec laser bleu de lumière pour produire une réponse du tronc cérébral optiquement évoqué placement de fibre optique couplée à une lumière laser bleu sur la surface du noyau cochléaire dorsal permet pour la stimulation optique. dorsale cochlée noyau opsin infectées. Bleu bar = 400 um.
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Discussion
Cet article décrit la technique de visualisation directe de la DCN dans le modèle murin pour la manipulation du système auditif central. L'approche décrite de la visualisation directe offre des avantages significatifs par rapport à la principale alternative, qui sont des approches stéréotaxiques. Principalement, la visualisation directe de la DCN permet de confirmation immédiate du site du tronc cérébral, alors que les approches stéréotaxiques ne offrent pas la visualisation directe. Dans les expériences qui nécessitent des périodes d'incubation prolongées, comme ce est le cas dans le transfert de gène à médiation virale, il ya le potentiel pour une faible efficacité de l'infection si l'injection "manque" l'emplacement cible. En outre, une approche de la visualisation directe permet pour l'injection dans un vaste éventail d'animaux âges. Une approche chirurgicale analogue peut être utilisé dans des expériences de survie avec d'autres modèles animaux, tels que les rats et les cobayes.
Il ya plusieurs étapes critiques dans ce protocole. Tout d'abord, lasouris doit être correctement positionné dans le support stéréotaxique. Tout mouvement de la tête se traduira par la difficulté à faire la craniotomie. En second lieu, l'emplacement de la craniotomie est cruciale. Si la craniotomie ne est pas fait dans la bonne position, la visualisation de la DCN consécutif à l'aspiration du cervelet sera difficile, voire impossible. Enfin, l'étape la plus critique du protocole est l'aspiration dirigée partielle du cervelet. Il ya deux approches techniques à l'aspiration du cervelet. Dans la première approche d'aspiration, l'aspiration est constamment maintenu sur le cervelet, le soulevant, hors du tronc cérébral. Dans cette approche, la DCN peut être partiellement visualisé sous le cervelet et aspiration est maintenue jusqu'à ce que le CN est complètement visualisé et le cervelet retiré. Dans la seconde approche, le cervelet est partiellement aspiré en plusieurs passes couches jusqu'à ce que la DCN est visualisée. Les points dentaires peuvent être utilisés avec tamponnant doucement pour effacer le sang ou de rester cervelet fragments du CN si elle ne peut pas être entièrement visualisées.
Le saignement est un inconvénient majeur de l'approche de la visualisation directe et se produit au cours de la craniotomie initiale et après aspiration cérébelleuse principalement. Dans de nombreux cas au cours de la craniotomie initiale, le saignement se arrête avec le temps dans les 2-5 min. Plaçant un mouchoir en papier ou un point dentaires sur le site de saignement et permettant l'hémostase. En termes de saignement après aspiration du cervelet, il est important d'injecter une solution saline normale (0,5 à 1 cm) sur le site de la craniotomie pour diluer le sang et empêcher la formation de caillots de sang au niveau de la NC. Une combinaison de l'aspiration et doux dentaire point de tamponnage peut être utilisé pour déblayer le sang et une solution saline. En effet, la principale limitation de cette approche est le caractère invasif de la procédure.
Le protocole a des implications au-delà de la manipulation du système auditif. In vivo transfert de gène dans le système nerveux central permet la manipulation des divErse voies neurales et a donné un aperçu des multiples fonctions neuronales, y compris la mémoire, le contrôle moteur, l'olfaction, et l'audition. 16,21-26 L'approche chirurgicale, permettant une visualisation directe aux fins de transfert de gènes et la stimulation peut potentiellement être appliqué à d'autres régions du tronc cérébral, à la fois ceux qui sont énumérés ci-dessus et d'autres. Suite à la maîtrise de la visualisation directe de la DCN, une foule d'expériences sont possibles, y compris l'injection de opsines dans le CN et la stimulation ultérieure avec un laser à lumière bleue. D'autres expériences de neurophysiologie, telles que la stimulation électrique et tracés d'injection de neurones, 18 sont également possibles. Le niveau de la visualisation et la durée de la stimulation de cette approche permet de multiples applications pour une large gamme d'expériences.
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Disclosures
Les auteurs ne ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Financement: Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation Bertarelli (DJL), un MED-EL subvention (DJL) et les Instituts nationaux de la santé Subventions DC01089 (RCM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic holder | Stoelting | 51500 | |
| Homeothermic blanket | Harvard | 507214 | |
| Scalpel blade #11 | Fine Surgical Tools | 10011-00 | |
| Iris scissor | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| 5 French suction | Symmetry Surgical | 2777914 | |
| Dental Points | Henry Schein | 100-8170 | |
| Bone rongeur | Fine Surgical Tools | 16020-14 | |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7633-01 | |
| 34 gauge, needle | Hamilton | 207434 | |
| Rongeurs | Fine Surgical Tools | 16021-14 |
References
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