Neuroscience

הדמיה ישירה של Murine הגבי שבלול Nucleus לoptogenetic גירוי של הנתיב השמיעתי

Published: January 20, 2015 doi: 10.3791/52426

Elliott D. Kozin*¹, Keith N. Darrow*², Ariel E. Hight*¹, Ashton E. Lehmann¹, Alyson B. Kaplan¹, M. Christian Brown¹, Daniel J. Lee¹

¹Department of Otology and Laryngology, Harvard Medical School, ²Department of Communication Sciences and Disorders, Worcester State University

* These authors contributed equally

Abstract

חקירת השימוש בהעברת גני וירוס בתיווך לעצור או להפוך אובדן השמיעה במידה רבה נדחקה למערכת השמיעה ההיקפית. מחקרים מעטים בחנו העברת גנים למערכת השמיעה המרכזית. גרעין גב השבלול (DCN) של גזע המוח, המכיל נוירונים מסדר שני של המסלול השמיעתי, הוא אתר פוטנציאל להעברת גנים. בפרוטוקול זה, טכניקה לחשיפה ישירה ומקסימלי של DCN העכברי באמצעות גישה הפוסות אחורי מודגמת. גישה זו מאפשרת לאף אחד מניתוח אקוטי או הישרדות. בעקבות הדמיה ישירה של DCN, מארח של ניסויים אפשריים, כולל הזרקה של opsins לתוך גרעין השבלול ולאחר מכן על ידי הגירוי של סיבים אופטיים מצמידים את אור לייזר כחול. ניסויי נוירופיזיולוגיה אחרים, כגון גירוי חשמלי והעתקי מזרק עצביים הם גם אפשריים. רמת visualization ואת משך הזמן של גירוי השגה להפוך גישה זו ישימה למגוון רחב של ניסויים.

Protocol

הערה: כל הליכי הניסוי מבוצעים בהתאם לועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש בעיני מסצ'וסטס ומרפאת אוזן ובית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד, שפועל לפי הנחיות טיפול בבעלי החיים לאומיות, ובכלל זה לבריאות ציבור שירות מדיניות על הומניות טיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה, ILAR מדריך, ובעלי חי חוק צער. הפרוצדורות מפורטות להלן פירוט חשיפה של DCN השמאל. השתמש בכלים סטריליים בעת ביצוע ניתוח הישרדות.

1. היסודי Craniotomy וחשיפה הגבי שבלול Nucleus

הרדמה
1. הרדימי עכבר, בגילי 8-12 שבועות, במשקל 18-24 גרם, עם 20 מ"ג / קילוגרם xylazine וקטמין 100 מ"ג / קילוגרם באמצעות ממשל intraperitoneal. אשר הרדמה תקינה על ידי קצב ניטור לב, קצב נשימה, כמו גם רפלקס נסיגת קמצוץ הבוהן. משחה וטרינר מקום על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. ברגע כראוי בהרדמה, לא מעל שיער גילוחהוא הקרקפת כדי לספק גישה ללא הפרעה לאתר כירורגית.
מיקום כירורגי
1. מניחים את העכבר באופן מאובטח בבעל החיים קטן stereotaxic, שנערך במקום על ידי מהדק חוטם.
2. ודא שמהדקים החוטם הוא רופף מספיק כדי לאפשר לנשימה נאותה אבל חזק מספיק כדי לשתק את הראש של העכבר לחלוטין. אם ראש העכבר הוא רופף, בעל החיים עלולים ליפול מבעל הראש במהלך חלק craniotomy של הליך.
3. מניחים אלקטרודות שתל גזע המוח שמיעתיות באופנה סטנדרטית, המאפשרת לניטור קצב לב. קצב נשימה צריך להיות במעקב על ידי הדמיה. שים לב שקצב לב נורמלי וקצב נשימה משתנים בהתאם לגילו של העכבר.
4. מדחום ממוקם וeuthermia מובטח באמצעות מיקום על שמיכת חימום homeothermic.
חתך בעור וחשיפה של עצמות interparietal והעורפיות של הגולגולת
1. תחת microscאופ, לעשות חתך אנכי דרך העור מתחיל בקו האמצע, ישירות בין האפרכסת, והארכת לחלק הזנב של העורף. בעקבות חתך בעור קו האמצע, לעקור את העור רוחבי. דמיינו את השרירים המכסים את עזב את החלק האחורי של הגולגולת.
2. הסר שריר שמעל השמאל הקודקודית, interparietal, ועצמות עורפיות של הגולגולת על ידי disarticulation של קבצים מצורפים שרירים לעצמות שלהם עם מספריים או אזמל איריס. שים לב במידה קטנה של דימום לאורך קצות שרירים לחתוך. למזער את זה על ידי לחץ עדין עם המוליך כותנה שקצה במשך 10-15 שניות.
שמעליה craniotomy השבלול Nucleus
1. לזהות קווי תפר רלוונטיים, כולל קווי תפרים sagittal ולמבדה (איור 1, שמאל לוח).
2. שימוש rongeurs, להפוך את פתיחת גולגולת על עצם interparietal, השמאלית של קו האמצע, ~ הזנב 2 מ"מ לקו התפר למבדה. אזור זה overlies DCN.
3. Followincraniotomy g, להתבונן בשכבה דקה של דורה שoverlies המוח הקטן. באמצעות סכין אזמל, להסיר את הדורה. (איור 1, פנל באמצע).
  הערה: הסרת הדורה עלולה לגרום למידה קטנה של דימום. תהליך זה של שימוש בלהב סכין המנתחים כדי להסיר את הדורה נועד להפחית את כמות איבוד דם במהלך שאיפת המוח הקטן, שברכה על פני השטח של גזע המוח וזיהוי אלמוני של DCN. סה"כ נפח דם של עכבר הוא ~ 1.5 מיליליטר לא יעלה> מ -15%. אם הדימום עולה על סכום זה, העכבר צריך להיות מסופק עם עם תוספת נוזלים.
4. הסר דם קרוש כיסה את המוח הקטן עם המוליך קצה כותנה. לחלופין, בעדינות לטפטף מי מלח באמצעות נקודת שיניים על המוח הקטן כדי לנקות דם משם דם.
המוח הקטן שאיפה
1. באמצעות 5 יניקה צרפתית, לשאוב את החלק לרוחב-ביותר של המוח הקטן השמאלי מעל DCN עד DCN הוא מולרע"מ (איור 1, ימין לוח). הסר כ 1/4 עד 1/3 של המוח הקטן משמאל. ציון דרך העיקרי בסמוך לDCN הוא ampulla של התעלה חצי עגולה מעולה.
  הערה: שאיפה של המוח הקטן היא צעד מפתח לפרוטוקול. שאיפת בימוי של המוח הקטן מתבצעת ביותר בהצלחה אם היא מתרחשת בניסיון בודד ולא עם מעברים מרובים של היניקה כמו זה יגרום לדימום. כדי לסייע בשאיפה, להגדיר את מישור המוקד של המיקרוסקופ בעומק הצפוי של CN, שיהיה מעט דיסטלי אל פני השטח של המוח הקטן. הגדרת מישור המוקד לCN תשפר הדמיה ולהבטיח תמונה חדה.
2. השאיפה הבאה, דימום נוסף, נוזל השדרתי (CSF) הצטברות, ועקירת המוח הקטן על DCN צפויים. להחדיר 0.5 סמ"ק של תמיסת מלח סטרילית במהירות לפתיחת הגולגולת כדי למנוע קרישת דם. שילוב של ספיגה עדינה עם נקודה ויניקת שיניים יכול להיות אזנהג לסלק דרך להדמיה ישירה של DCN. ישירות לא לפנות אל פני השטח של DCN.

Microinjection לחץ 2. להעברת גנים בתיווך וירוס ושחזור כירורגי

לאחר DCN הוא חופשי של דם וCSF שמעליה ונראים בבירור, להפוך microinjections לחץ לDCN באמצעות מזרק המילטון 10 μl על פני תקופה 2 דקות.
להציג את המחט עם micromanipulator עד הקצה הוא כבר לא נראה לעין מתחת לפני השטח של DCN.
לקבלת ביצועים מיטביים, השתמש במחט 33 או 34 מד (להשתמש במזרק gastight עם מחט 34 מד) עם שיפוע רדוד, כגון 45 מעלות, כדי למזער את הטראומה קהה ולמקם את עוצמת הזריקה בתוך DCN, שהוא דק ו מבנה גזע המוח רדוד (<300 מיקרומטר עבה).
הערה: מכשירי microinjection אחרים עשויים להיות מבוססים מנוצלים. באופן אידיאלי, מכשיר ההזרקה צריך להיות גמיש כדי לאפשר לכמה בן קלד, נחוץ אם לפנות ישירות לקהל DCN. יתר על כן, כפי שהעכבר זז מעט לאורך כל ההליך בשל נשימה, המכשיר צריך להיות חזק מספיק כדי לעמוד בכמויות קטנות של תנועה.

שחזור כירורגי 3.

מייד ההזרקה הבאה, מחדש משוערת העור ולאפשר העכבר כדי להתאושש להליך התאוששות סטנדרטי. רקמת המוח הקטן וצלקת שנותרה למלא את החלל שנגרם על ידי שאיפה של המוח הקטן. כל הזמן לפקח על בעלי חיים עד תודעה מספיק הוא חזר כדי לשמור על כיבה sternal. לעקוב אחר קצב לב, קצב נשימה, כמו גם יכולת להאכיל.
הערה: אין חיה שעברה ניתוח חזר לכלוב עם בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש לחלוטין.
אם עכבר מתחיל ללכת במעגלים לאחר ניתוח (<5% מהמקרים), בדרך כלל 2-4 שעות לאחר סגירת החתך בעור, להקריב מייד העכבר, כפי שהוא עלול להביא להאכלת תקופה קשה. Tתופעת הלוואי שלו היא כנראה עקב שאיפה של המוח הקטן. בעלי החיים צריכים להיות במעקב לכאב לאחר הניתוח, ויש לתת סמים מתאימים כדי להבטיח נוחות בעלי חיים המבוססים על תקנים מוסדיים. אנטיביוטיקה עשויה להיות נחוצה, אם עדות לזיהום.

4. חשיפה Craniotomy והשבלול Nucleus משנית

לאחר 2-4 שבועות של ריפוי ודגירת העברת גני וירוס בתיווך, מחדש להרדים זמן דגירה אופטימלית הזריק בעבר צעד עכבר וחזור על 1.1-1.5 משתנה בהתאם לסוג של גן הועבר.
הסרה של רקמת צלקת על אתר craniotomy על ידי שילוב של פינצטה, אזמל, וrongeurs.
לאחר לדמיין את פתיחת הגולגולת, לזהות שילוב של רקמת המוח הקטן ונותר צלקת מעל DCN. השתמש 5 יניקה צרפתית כדי לשאוב המוח הקטן שמעליה / רקמת צלקת (בדומה לשאיפת המוח הקטן הקודמת).
בעקבות שאיפה, מצפה דימום נוסף, ב CSFuild-אפ, וחתיכות הנותרות של המוח הקטן. במהירות להציג מלוח לפתיחת הגולגולת כדי למנוע קרישת דם. השתמש בשילוב של ספיגה עדינה שיניים נקודה ויניקה כדי לנקות את הנתיב להדמיה ישירה של DCN.
שים לב פני השטח של DCN. לבצע ניסויי פיזיולוגיה מבוסס optogenetics כDCN נגיש כעת. להציג את גירוי אור, למשל עם סיב אופטי (איור 2), לנהוג ניסוי מבוסס optogenetics.

5. היסטולוגיה

בעקבות מסקנה של ניסויים, להרדים את העכבר עם מנת יתר של קטמין. Perfuse העכבר עם מלח רגיל ואחריו paraformaldehyde 4%.
חלץ את גזע המוח מהגולגולת ופוסט-התיקון לשעה 2. Cryoprotect גזע המוח בסוכרוז 30% במשך 24-48 שעות. סעיף גזע המוח באמצעות cryostat סטנדרטי באמצעות 60 מיקרומטר חלקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חלקית המוח הקטן שאיפה מדגימה גישה לגרעין השבלול

לאחר העור והשרירים שמעל הגולגולת יוסרו, ציוני דרך פני גולגולת, כגון קווי תפר העטרה ומדא, מדגים את הלוקליזציה המשוערת של פתיחת הגולגולת. בעקבות פתיחת גולגולת עם rongeurs, המוח הקטן הוא מדמיין. שאיפה זהירה של החלק הקטן של המוח הקטן מדגימה הדמיה של CN, אז מה שיכול להיות מוזרק (איור 1).

חשיפה השבלול Nucleus משנית לגירוי עם אור לייזר הכחול

בעקבות חשיפה ראשונית של DCN, העברת גנים עם opsin, ותקופת הדגירה, אז יכול להיות מגורה על ידי DCN אור לייזר כחול. Craniotomy המשנית חושפת את פני השטח של DCN לגירוי אופטי דומה בגישה טכנית לפתיחת הגולגולת העיקרית (Supp. סרט 1). DCN, להיותמבנה פני השטח שהוא פחות מ -300 מיקרומטר בעובי. ההכנה העכברית הניסיונית נשארת קיימא עבור עד 6 שעות.

איור 1: שאיפת המוח הקטן חלקית מדגימה גישה לגרעין שבלול הגב. שמאל פנל: אחרי העכבר ממוקם בבעל, מבצע חתך אנכי דרך העור והרקמות רכות יחד החלק האחורי של הגולגולת לרקמות הרכות של הצוואר. העור הוא לטרלית, והשרירים שמעל קו תפר העטרה מוסר הלוח התיכון:. Craniotomy לאחר מכן הושלם באזור של המוח הקטן וגרעין שבלול גב בסיסי עם rongeurs עצם ימין פנל:. לחשיפה של גרעין שבלול הגב , 5 יניקה צרפתית לאחר מכן נעשה שימוש כדי לשאוב את המוח הקטןמעל גרעין השבלול עד גרעין שבלול הגב היא דמיינה.

איור 2: חשיפה של פני השטח של גרעין השבלול לגירוי עם אור לייזר כחול לייצר תגובת גזע המוח שמיעתית אופטי עוררת מיקום של סיבים אופטיים מצמידים את אור לייזר כחול על פני השטח של גרעין שבלול הגב מאפשר גירוי אופטי של. גרעין שבלול גב נגוע opsin. בר כחול = 400 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מתאר את הטכניקה של הדמיה הישירה של DCN במודל העכברי למניפולציה של מערכת השמיעה המרכזית. הגישה המתוארת של הדמיה ישירה מספקת יתרונות משמעותיים על פני החלופה המרכזית, שהם גישות stereotaxic. בעיקר, להדמיה ישירה של DCN מאפשרת לאישור מיידי של האתר של גזע המוח, ואילו גישות stereotaxic לא להרשות לעצמו להדמיה ישירה. בניסויים שמחייבים ממושכים תקופות דגירה, כמו במקרה של העברת גנים בוירוס בתיווך, יש פוטנציאל ליעילות זיהום נמוך אם ההזרקה "מתגעגעת" מיקום היעד. יתר על כן, גישה להדמיה ישירה מאפשרת להזרקה בגילי מגוון רחב של בעלי חיים. גישה ניתוחית דומה עשויה לשמש בניסויי הישרדות עם מודלים של בעלי חיים אחרים, כגון חולדות ושרקנים.

ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול זה. ראשון,העכבר חייב להיות ממוקם כראוי בבעל stereotactic. כל תנועה של הראש תגרום לקושי שהופך את פתיחת הגולגולת. שנית, מיקום של פתיחת הגולגולת הוא קריטי. אם craniotomy לא נעשתה במיקום הנכון, ויזואליזציה של DCN הבא שאיפה של המוח הקטן תהיה מאתגרת, אם לא בלתי אפשרי. לבסוף, השלב הקריטי ביותר של הפרוטוקול הוא השאיפה המכוונת החלקית של המוח הקטן. ישנן שתי גישות טכניות לשאיפה של המוח הקטן. בגישת השאיפה הראשונה, היניקה מתקיימת כל הזמן במוח הקטן, מרים אותו כלפי מעלה, מגזע המוח. בגישה זו, DCN עשוי להיות דמיין באופן חלקי מתחת למוח הקטן ויניקה מתקיימת עד CN היא דמיינה באופן מלא והוציא המוח הקטן. בגישה השנייה, המוח הקטן הוא aspirated באופן חלקי בכמה מעברים שכבתיים עד DCN היא דמיין. נקודות שיניים ניתן להשתמש בספיגה עדינה כדי לנקות fragme המוח הקטן דם או שנותרNTS מCN אם זה לא יכול להיות דמיין באופן מלא.

דימום הוא חסרון עיקרי של הגישה להדמיה הישירה ובעיקר מתרחש במהלך craniotomy הראשוני ולאחר שאיפת המוח הקטן. במקרים רבים במהלך craniotomy הראשוני, דימום ייפסק עם זמן בתוך 2-5 דקות. הצבת נייר טישו או נקודת שיניים באתר של דימום ומאפשר לעצירת דימום. במונחים של דימום לאחר שאיפת המוח הקטן, חשוב להזריק מלח רגיל (0.5-1 סמ"ק) באתר של פתיחת הגולגולת כדי לדלל את הדם ולמנוע היווצרות קריש דם ברמה של CN. שילוב של שאיבה וספיגת נקודת שיניים עדינה ניתן להשתמש כדי לנקות את הדם ומלח. ואכן, המגבלה העיקרית של גישה זו היא הטבע פולשנית של ההליך.

יש פרוטוקול השלכות מעבר למניפולציה של מערכת השמיעה. בvivo העברת גנים למערכת העצבים המרכזי מאפשרת מניפולציה של diverse מסלולים עצביים והציע תובנות פונקציות עצביות מרובות, כוללים זיכרון, שליטה מוטורית, olfaction, ואודישן. ^16,21-26 גישה הניתוחית, המאפשר הדמיה ישירה לצורך העברת גנים והגירוי פוטנציאלי עלול להיות מיושם על אזורים אחרים של גזע המוח, הן אלה שצוינו לעיל ואחרים. בעקבות שליטה של הדמיה ישירה של DCN, מארח של ניסויים אפשריים, כולל הזרקה של opsins לCN וגירוי לאחר מכן עם אור לייזר כחול. ניסויי נוירופיזיולוגיה אחרים, כגון גירוי חשמלי והעתקי מזרק עצביים, ¹⁸ גם הם אפשריים. הרמה של דמיון ואת משך הזמן של גירוי של גישה זו מאפשרת למספר רב של יישומים עבור מגוון רחב של ניסויים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לי המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מימון: עבודה זו נתמכה על ידי מענק הקרן Bertarelli (Djl), מענק MED-EL (Djl), ומכון לאומי לבריאות מענקי DC01089 (MCB).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic holder	Stoelting	51500
Homeothermic blanket	Harvard	507214
Scalpel blade #11	Fine Surgical Tools	10011-00
Iris scissor	Fine Surgical Tools	14084-08
5 French suction	Symmetry Surgical	2777914
Dental Points	Henry Schein	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7633-01
34 gauge, needle	Hamilton	207434
Rongeurs	Fine Surgical Tools	16021-14