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Neuroscience

Visualizzazione diretta del Murine Dorsale Cochlear Nucleus per optogenetic stimolazione del percorso uditivo

Published: January 20, 2015 doi: 10.3791/52426
* These authors contributed equally

Abstract

Indagine sull'uso di trasferimento genico virus-mediata di arrestare o invertire la perdita dell'udito è stata in gran parte relegato al sistema uditivo periferico. Pochi studi hanno esaminato il trasferimento di geni al sistema uditivo centrale. Il nucleo dorsale cocleare (DCN) del tronco encefalico, che contiene neuroni secondo ordine del percorso uditivo, è un sito di capacità di trasferimento genico. In questo protocollo, una tecnica per l'esposizione diretta e massima della murino DCN mediante un approccio posteriore fossa è dimostrata. Questo approccio permette sia per la chirurgia acuta o sopravvivenza. Dopo la visualizzazione diretta del DCN, una serie di esperimenti sono possibili, compresa l'iniezione di opsine nel nucleo cocleare e la stimolazione successiva da una fibra ottica accoppiata ad un laser a luce blu. Altri esperimenti di neurofisiologia, come la stimolazione elettrica e tracciati iniettori neurali sono anche possibili. Il livello di Visualizazione e la durata della stimolazione rendono realizzabile questo approccio applicabile ad una vasta gamma di esperimenti.

Protocol

NOTA: Tutte le procedure sperimentali sono eseguite in conformità con la cura e l'uso degli animali Comitato del Massachusetts Eye and Ear Infirmary e Harvard Medical School, che seguono le linee guida nazionali per la cura degli animali, tra cui la politica di sanità pubblica Service Humane cura e l'uso di animali da laboratorio, la ILAR Guida, e la legge sulla protezione degli animali. Procedure sperimentali elencate di seguito dettagliato esposizione della DCN di sinistra. Usare strumenti sterili durante l'esecuzione di un intervento chirurgico di sopravvivenza.

1. primario Craniotomia e dorsale cocleare Nucleus Esposizione

  1. Anestesia
    1. Anestetizzare un mouse, età 8-12 settimane, del peso di 18-24 g, con xilazina 20 mg / kg e 100 mg ketamina / kg tramite somministrazione intraperitoneale. Verificare il corretto anestesia per il monitoraggio della frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, nonché punta ritiro pizzico reflex. Luogo veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Una volta adeguatamente sotto anestesia, capelli barba sovrastante tegli cuoio capelluto per fornire libero accesso al sito chirurgico.
  2. Posizionamento chirurgico
    1. Posizionare il mouse saldamente in un piccolo supporto stereotassico animali, tenuto in posizione da un morsetto muso.
    2. Assicurarsi che il morsetto muso è abbastanza largo per permettere un'adeguata respirazione, ma abbastanza stretto per immobilizzare completamente la testa del mouse. Se la testa del mouse è allentato, l'animale rischia di cadere dal supporto testa durante la parte craniotomia di procedura.
    3. Posizionare uditive elettrodi impianto tronco in modo standard, che consente il monitoraggio della frequenza cardiaca. La frequenza respiratoria deve essere monitorata da visualizzazione. Si noti che la frequenza cardiaca normale e la frequenza respiratoria variano a seconda dell'età del mouse.
    4. Un termometro è posto e eutermia è assicurata tramite il posizionamento su una coperta riscaldamento omeotermi.
  3. Incisione cutanea e l'esposizione delle ossa interparietale e occipitale del cranio
    1. Sotto un microscOPE, fare una incisione verticale attraverso la pelle a partire dalla linea mediana, direttamente tra il padiglione auricolare, e si estende alla porzione caudale dell'occipite. Dopo mediana pelle incisione, spostare la pelle lateralmente. Visualizza i muscoli che coprono la sinistra la faccia posteriore del cranio.
    2. Rimuovere sovrastante parietale sinistra, interparietale muscolare, e le ossa occipitali del cranio per disarticolazione di inserzioni muscolari ai rispettivi ossa con un bisturi o iris forbice. Osservare un piccolo grado di sanguinamento lungo i bordi muscolari taglio. Minimizzare questo con una leggera pressione con un applicatore con punta di cotone per 10-15 sec.
  4. Sovrastante Craniotomy Cochlear Nucleus
    1. Identificare linee di sutura pertinenti, tra cui suture sagittale e lambda linee (Figura 1, pannello di sinistra).
    2. Utilizzando rongeurs, fare una craniotomia sopra l'osso interparietale, a sinistra di linea mediana, ~ 2 mm caudale alla linea lambda sutura. Questa regione si sovrappone il DCN.
    3. Following craniotomia, osservare un sottile strato di dura che sovrasta il cervelletto. Usando un bisturi, rimuovere la dura. (Figura 1, pannello centrale).
      NOTA: La rimozione di dura può causare un piccolo grado di sanguinamento. Questo processo di utilizzare il bisturi per rimuovere la dura lo scopo di ridurre la quantità di perdita di sangue durante l'aspirazione del cervelletto, che riunirà in superficie tronco encefalico e oscura l'identificazione del DCN. Volume di sangue totale di mouse è ~ 1,5 ml non deve superare i> del 15%. Se l'emorragia supera tale importo, il mouse deve essere provvisto di integrazione con il fluido.
    4. Rimuovere sangue coagulato sovrapponendo il cervelletto con il cotton-fioc. Facoltativamente, gocciola delicatamente salina con un punto dentale sul cervelletto per eliminare il sangue via il sangue.
  5. Cerebellare Aspirazione
    1. Utilizzando una aspirazione 5 French, aspirare la porzione laterale più a sinistra del cervelletto sovrastante il DCN finché il DCN è visUAL (Figura 1, pannello di destra). Rimuovere circa 1/4 a 1/3 del cervelletto sinistro. Il punto di riferimento principale adiacente al DCN è l'ampolla del canale semicircolare superiore.
      NOTA: L'aspirazione del cervelletto è il passo fondamentale del protocollo. Diretto aspirazione del cervelletto viene eseguita con maggior successo se si verifica in un unico tentativo, e non con più passaggi di aspirazione ciò causerebbe sanguinamento. Per facilitare l'aspirazione, impostare il piano focale del microscopio alla profondità prevista della NC, che sarà leggermente distale alla superficie del cervelletto. Impostazione del piano focale per il CN migliorare la visualizzazione e di garantire un'immagine nitida.
    2. Dopo l'aspirazione, ulteriori emorragie, liquido cerebrospinale (CSF) accumulo, e lo spostamento del cervelletto sulla DCN sono attesi. Instillare 0,5 cc di soluzione fisiologica sterile rapidamente nel craniotomia per evitare la coagulazione del sangue. Una combinazione di dolce tamponando con un punto dentale e di aspirazione può quindi essereutilizzata per eliminare un percorso per la visualizzazione diretta del DCN. Non contattare direttamente la superficie del DCN.

2. Pressione microiniezione di trasferimento genico Virus-mediata e ripristino chirurgico

  1. Dopo l'DCN è libera di sangue sovrastante e CSF ed è chiaramente visibile, fare microiniezioni pressione nel DCN utilizzando una siringa da 10 microlitri Hamilton un periodo di 2 min.
  2. Introdurre l'ago con un micromanipolatore finché la punta non è più visibile sotto la superficie della DCN.
  3. Per ottenere prestazioni ottimali, utilizzare un ago calibro 33 o 34 (utilizzare una siringa a tenuta di gas con l'ago 34 gauge) con uno smusso superficiale, come ad esempio 45 °, per ridurre al minimo il trauma smussato e localizzare il volume di iniezione ai DCN, che è un sottile e struttura tronco superficiale (<300 micron di spessore).
    NOTA: Altri strumenti microiniezione possono basarsi utilizzato. Idealmente, lo strumento di iniezione deve essere flessibile per consentire qualche lieve bend, se necessario di indirizzare direttamente il DCN. Inoltre, come il mouse si sposta un po 'tutta la procedura a causa di respirazione, lo strumento dovrebbe essere abbastanza robusta per sopportare piccole quantità di movimento.

3. Recupero Surgical

  1. Subito dopo l'iniezione, ri-approssimare la pelle e lasciare il mouse per recuperare per procedura di recupero standard. Rimanendo cervelletto e tessuto cicatriziale riempirà nella cavità causata dalla aspirazione del cervelletto. Monitorare costantemente animali fino coscienza sufficiente riguadagnato a mantenere decubito sternale. Monitorare la frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, nonché la capacità di nutrire.
    NOTA: Nessun animale che ha subito un intervento chirurgico viene restituita una gabbia con altri animali fino alla completa guarigione.
  2. Se un mouse comincia a camminare in cerchio post-operatorio (<5% dei casi), tipicamente 2-4 ore dopo la chiusura della incisione cutanea, sacrificare immediatamente il mouse, come sarebbe probabilmente un'alimentazione momento difficile. Til suo effetto collaterale è probabilmente dovuto all'aspirazione del cervelletto. L'animale deve essere monitorata per il dolore postoperatorio, e narcotici appropriate deve essere somministrato a garantire il comfort degli animali sulla base di norme istituzionali. Gli antibiotici possono essere necessarie, se le prove di infezione.

4. secondaria Craniotomia e Cochlear Nucleus Esposizione

  1. Dopo 2-4 settimane di guarigione e virus-mediata gene trasferimento incubazione, ri-anestetizzare un precedentemente iniettato mouse e ripetere il passo 1,1-1,5 tempo di incubazione ottimale varia con il tipo di gene trasferito.
  2. Rimuovere il tessuto cicatriziale sul sito craniotomia da una combinazione di pinzette, bisturi, e rongeurs.
  3. Dopo visualizzare la craniotomia, individuare una combinazione di rimanere cervelletto e tessuto cicatriziale sovrastante il DCN. Utilizzare un 5 di aspirazione francese per aspirare cervelletto sovrastante / tessuto cicatriziale (simile al precedente aspirazione cerebellare).
  4. Dopo l'aspirazione, si aspettano ulteriori emorragie, CSF build-up, e rimanenti bit di cervelletto. Introdurre rapidamente salina nel craniotomia per prevenire la coagulazione del sangue. Utilizzare una combinazione di dolce punto tamponando e di aspirazione dentale per spianare la strada per la visualizzazione diretta del DCN.
  5. Osservare la superficie della DCN. Effettuare esperimenti di fisiologia basato optogenetics-come DCN è ora accessibile. Introdurre un stimolo luminoso, ad esempio con una fibra ottica (Figura 2), per guidare un esperimento basato optogenetics-.

5. Istologia

  1. Dopo la conclusione degli esperimenti, eutanasia il mouse con una overdose di ketamina. Profumato il mouse con soluzione fisiologica seguita da 4% paraformaldeide.
  2. Estrarre il tronco cerebrale dal cranio e post-fix per 2 ore. Cryoprotect tronco encefalico nel 30% di saccarosio per 24-48 ore. Sezione tronco cerebrale utilizzando un criostato standard utilizzando 60 sezioni micron.

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Representative Results

Parziale cerebellare aspirazione possa accedere alla Cochlear Nucleus

Dopo la pelle ei muscoli sovrastante il cranio vengono rimossi, monumenti superficie del cranio, come le linee di sutura coronale e Lamda, dimostrano la localizzazione approssimativa della craniotomia. A seguito di craniotomia con rongeurs, il cervelletto è visualizzato. Accurata aspirazione della piccola porzione del cervelletto dimostra visualizzazione della NC, che possono poi essere iniettato (Figura 1).

Secondary Cochlear Nucleus di esposizione per la stimolazione con Laser luce blu

Dopo l'esposizione iniziale del DCN, il trasferimento genico con opsin, e il periodo di incubazione, la DCN può essere stimolato da un laser a luce blu. La craniotomia secondario esponendo la superficie della DCN per la stimolazione ottica è simile approccio tecnico alla craniotomia primario (Supp. Film 1). Il DCN, essendouna struttura di superficie che è inferiore a 300 micron di spessore. La preparazione sperimentale murino rimane valida per un massimo di 6 ore.

Figura 1
Figura 1: aspirazione cerebellare parziale possa accedere al nucleo cocleare dorsale. Pannello sinistro: dopo il mouse è posizionato nel supporto, un'incisione è fatta verticalmente attraverso la cute e dei tessuti molli lungo la faccia posteriore del cranio per i tessuti molli del collo. La pelle è lateralizzato, e il muscolo sovrastante la linea di sutura coronale viene rimosso Pannello Medio:. Una craniotomia viene poi completata sulla regione del cervelletto e sottostante nucleo cocleare dorsale con il Rongeurs osso pannello di destra:. Per l'esposizione del nucleo cocleare dorsale , un 5 di aspirazione francese è quindi utilizzato per aspirare il cervellettosovrastante il nucleo cocleare fino a quando il nucleo cocleare dorsale viene visualizzato.

Figura 2
Figura 2: esposizione della superficie del nucleo cocleare per stimolazione con luce laser blu per produrre una risposta tronco cerebrale uditivo otticamente evocato Posizionamento di fibra ottica accoppiata ad un laser a luce blu sulla superficie del nucleo cocleare dorsale consente per la stimolazione ottica. coclea dorsale nucleo opsin-infetti. Blu bar = 400 micron.

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Discussion

Questo documento descrive la tecnica di visualizzazione diretta del DCN nel modello murino per la manipolazione del sistema uditivo centrale. L'approccio delineato di visualizzazione diretta offre notevoli vantaggi rispetto l'alternativa principale, che sono approcci stereotassica. In primo luogo, la visualizzazione diretta della DCN consente conferma immediata del sito del tronco encefalico, considerando approcci stereotassica non danno visualizzazione diretta. In esperimenti che necessitano prolungati periodi di incubazione, come avviene nel trasferimento mediato da virus, vi è il potenziale di bassa efficienza infezione se l'iniezione "perde" la posizione di destinazione. Inoltre, un approccio visualizzazione diretta permette iniettabile in una vasta gamma di età degli animali. Un approccio chirurgico analogo può essere utilizzato in esperimenti di sopravvivenza con altri modelli animali quali ratti e cavie.

Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo. In primo luogo, lamouse deve essere posizionato correttamente nel supporto stereotassica. Qualsiasi movimento della testa si tradurrà in difficoltà rendendo la craniotomia. In secondo luogo, la posizione della craniotomia è cruciale. Se la craniotomia non viene effettuata nella posizione corretta, la visualizzazione della DCN seguente aspirazione del cervelletto sarà difficile, se non impossibile. Infine, la fase più critica del protocollo è l'aspirazione parziali diretto del cervelletto. Ci sono due approcci tecnici aspirazione del cervelletto. Nel primo approccio di aspirazione, l'aspirazione viene costantemente tenuto il cervelletto, sollevandolo verso l'alto, fuori dal tronco cerebrale. In questo approccio, la DCN può essere parzialmente visualizzata sotto il cervelletto e aspirazione viene mantenuto fino NC è completamente visualizzato e cervelletto rimosso. Nel secondo approccio, il cervelletto è parzialmente aspirata in più passate strati fino alla DCN viene visualizzato. Punti dentali possono essere utilizzati con dolce tamponando per cancellare il sangue o residuo del cervelletto Fragmenti dalla NC, se non possono essere completamente visualizzati.

Il sanguinamento è un grave inconveniente dell'approccio visualizzazione diretta e principalmente si verifica durante la craniotomia iniziale e dopo l'aspirazione cerebellare. In molti casi, durante la craniotomia iniziale, sanguinamento si arresta con il tempo entro 2-5 min. Effettuazione di una carta velina o punto dentale nel sito di sanguinamento e consentendo emostasi. In termini di sanguinamento dopo aspirazione cerebellare, è importante iniettare soluzione fisiologica (0.5-1 cc) nel sito della craniotomia per diluire il sangue e prevenire la formazione di coaguli di sangue a livello della NC. Una combinazione di aspirazione e delicata punto tamponando dentale può essere utilizzato per eliminare il sangue e soluzione salina. Infatti, il principale limite di questo approccio è la natura invasiva della procedura.

Il protocollo ha implicazioni oltre manipolazione del sistema uditivo. In vivo trasferimento genico nel sistema nervoso centrale consente la manipolazione di divERSE percorsi neurali e ha offerto approfondimenti molteplici funzioni neurali, tra cui memoria, controllo motorio, olfatto, e audizione. 16,21-26 L'approccio chirurgico, consentendo la visualizzazione diretta ai fini del trasferimento di geni e di stimolazione possono potenzialmente essere applicato ad altre regioni del tronco cerebrale, sia quelli elencati sopra e altri. Dopo la padronanza di visualizzazione diretta del DCN, una serie di esperimenti sono possibili, compresa l'iniezione di opsine nel CN ​​e la stimolazione successiva con un laser a luce blu. Altri esperimenti di neurofisiologia, come la stimolazione elettrica e tracciati iniettori neurali, 18 sono anche possibili. Il livello di visualizzazione e la durata della stimolazione di questo approccio consente applicazioni multiple per una vasta gamma di esperimenti.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Fondazione Bertarelli (DJL), una borsa di MED-EL (DJL), e un National Institutes of Health sovvenzioni DC01089 (MCB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereotaxic holder Stoelting 51500
Homeothermic blanket Harvard 507214
Scalpel blade #11 Fine Surgical Tools 10011-00
Iris scissor Fine Surgical Tools 14084-08
5 French suction Symmetry Surgical 2777914
Dental Points Henry Schein 100-8170
Bone rongeur Fine Surgical Tools 16020-14
10 µl Hamilton syringe Hamilton  7633-01
34 gauge, needle Hamilton  207434
Rongeurs Fine Surgical Tools 16021-14

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References

  1. Lalwani, A., Mhatre, A. Cochlear gene therapy. Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).
  2. Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. Current issues in cochlear gene transfer. Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).
  3. Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
  4. Koh, S., Pettis, R., Mhatre, A., Lalwani, A. Cochlear microinjection and its effects upon auditory function in the guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
  5. Lalwani, A., Walsh, B., Reilly, P., Muzyczka, N., Mhatre, A. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
  6. Wareing, M., Lalwani, A. Cochlear gene therapy: current perspectives. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 5 Suppl 1. (49), 27-30 (1999).
  7. Han, J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
  8. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
  9. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. J Clin Invest. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  10. Adamantidis, A., et al. Optogenetic interrogation of dopaminergic modulation of the multiple phases of reward-seeking behavior. J Neurosci. 30 (31), 10829-10835 (2011).
  11. Kim, K., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PloS One. 7 (4), e33612 (2012).
  12. Britt, J., Bonci, A. Optogenetic interrogations of the neural circuits underlying addiction. Curr Opin Neurobiol. 23 (4), 539-545 (2013).
  13. Abbott, S., Coates, M., Stornetta, R., Guyenet, P. Optogenetic stimulation of c1 and retrotrapezoid nucleus neurons causes sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats. Hypertension. 61 (4), 835-841 (2013).
  14. Carter, M., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
  15. Darrow, K., et al. Optogenetic control of central auditory neurons. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. (695), (2012).
  16. Shimano, T., et al. Assessment of the AAV-mediated expression of channelrhodopsin-2 and halorhodopsin in brainstem neurons mediating auditory signaling. Brain Res. 1511, 138-152 (2013).
  17. Doucet, J., Ryugo, D. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. J Comp Neurol. 385, 245-264 (1997).
  18. Brown, M., Drottar, M., Benson, T., Darrow, K. Commissural axons of the mouse cochlear nucleus. J Comp Neurol. 521, 1683-1696 (2013).
  19. Verma, R., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hear Res. 310, 69-75 (2014).
  20. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. J Neurophysiol. 93 (1), 557-569 (2005).
  21. Rolls, A., et al. Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation. Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 13305-13310 (2011).
  22. Huff, M., Miller, R., Deisseroth, K., Moorman, D., LaLumiere, R. Posttraining optogenetic manipulations of basolateral amygdala activity modulate consolidation of inhibitory avoidance memory in rats. Proc Natl Acad Sci. 110 (9), 3597-3602 (2013).
  23. Stortkuhl, K., Fiala, A. The Smell of Blue Light: A New Approach toward Understanding an Olfactory Neuronal Network. Front Neurosci. 5 (72), (2011).
  24. Hira, R., et al. Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex. J Neurosci Methods. 179 (2), 258-263 (2009).
  25. Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice. Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).
  26. Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).

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