Abstract
Gransking av bruken av virus-mediert genoverføring å arrestere eller reversere hørselstap har i stor grad blitt henvist til det perifere hørselssystemet. Få studier har undersøkt genoverføring til det sentrale hørselssystemet. Rygg cochlea nucleus (DCN) av hjernestammen, som inneholder andre ordens nevroner av hørselsbanen, er et potensielt område for genoverføring. I denne protokollen, er en teknikk for direkte og maksimal eksponering av det murine DCN via en bakre fossa tilnærming demonstrert. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for enten akutt eller overlevelse kirurgi. Etter direkte visualisering av DCN, en rekke eksperimenter er mulige, inklusive injeksjon av opsins inn i sneglehuset kjernen og etterfølgende stimulering med en optisk fiber er koplet til et blått lys laser. Andre nevrofysiologi eksperimenter som elektrisk stimulering og nevrale injektor tracings er også mulig. Nivået på visualizasjon og varigheten av stimulering oppnåelig gjør denne tilnærming gjelder for et bredt spekter av eksperimenter.
Protocol
MERK: Alle eksperimentelle prosedyrer er utført i samsvar med Animal Care og bruk komité ved Massachusetts øye og øre Infirmary og Harvard Medical School, som følge nasjonale retningslinjer dyr omsorg, herunder Public Health Service politikk på Humane Stell og bruk av forsøksdyr, den ILAR Guide, og dyrevernloven. Eksperimentelle prosedyrene nedenfor detalj eksponering av venstre DCN. Bruk sterile instrumenter mens du utfører overlevelse kirurgi.
1. Primær kraniotomi og Dorsal Cochlear Nucleus Eksponering
- Anestesi
- Bedøve en mus, i alderen 8-12 uker, veier 18-24 g, med xylazine 20 mg / kg og ketamin 100 mg / kg via en intraperitoneal administrasjon. Bekreft riktig anestesi ved overvåking hjertefrekvens, respirasjonsfrekvens, samt tå klype tilbaketrekking refleks. Sted dyrlege salve på øynene for å hindre tørrhet mens under narkose. Når tilstrekkelig under narkose, barbering hår liggende tHan hodebunnen for å gi uhindret adgang til det kirurgiske området.
- Kirurgisk posisjonering
- Plasser musen sikkert i et lite dyr stereotaksisk holder, holdt på plass av en snute klemme.
- Sørg for at snuten klemmen er løs nok til å tillate tilstrekkelig respirasjon men stramt nok til å fullstendig immobilisere hodet av musen. Hvis musen hodet er løs, er dyret sannsynlig å falle ut av hodeholderen under kraniotomi del av prosedyren.
- Plassere auditive hjernestammen implantat elektroder i standard mote, noe som gir mulighet for pulsmåling. Respirasjonsfrekvens bør overvåkes av visualisering. Legg merke til at normal puls og respirasjonsfrekvens vil variere avhengig av alder på musen.
- Et termometer er plassert og euthermia sikres via plassering på en homeothermic varmeteppe.
- Hud snitt og eksponering av interparietal og occipital bein i skallen
- Under en mikroskopope, lage en vertikal snitt gjennom huden starter på midtlinjen, midt mellom det ytre øret, og strekker seg til hale del av bakhodet. Etter midtlinjen snitt i huden, fortrenge hud sidelengs. Visualisere musklene som dekker venstre bakre del av skallen.
- Fjern muskelliggende den venstre parietal, interparietal, og occipital bein i skallen ved disarticulation av muskel vedlegg til sine respektive bein med en skalpell eller iris saks. Observere en liten grad av blødning langs kutt muskel kanter. Minimere dette ved forsiktig press med en bomull-tipped applikator for 10-15 sek.
- Craniotomy liggende Cochlear Nucleus
- Identifisere relevante sutur linjer, inkludert sagittal og lambda sting linjer (Figur 1, Venstre Panel).
- Ved hjelp Rongeurs, lage en kraniotomi over interparietal bein, til venstre for midtlinjen, ~ 2 mm caudal til lambda suturlinje. Denne regionen ligger over DCN.
- Following kraniotomi, observere et tynt lag av dura som ligger over lillehjernen. Ved hjelp av en skalpell blad, fjerne dura. (Figur 1, Middle Panel).
MERK: Fjerning av dura kan føre til en liten grad av blødning. Denne prosessen av å bruke skalpellblad for å fjerne dura er beregnet på å redusere mengden av blodtapet under cerebellum aspirasjon, som vil samle på hjerneoverflaten og uklar identifikasjon av DCN. Totale blodvolum på mus er ~ 1.5 ml bør ikke overstige> enn 15%. Hvis blødningen overstiger dette beløpet, bør musen være utstyrt med med væske tilskudd. - Fjerne koagulert blod overliggende lillehjernen med bomullstupp applikator. Eventuelt forsiktig dryppe saltvann ved hjelp av en tannlege punkt på lillehjernen å fjerne blod bort blod.
- Lillehjernen aspire
- Ved hjelp av en 5 French sug, aspirere den laterale rste parti av den venstre cerebellum liggende DCN inntil DCN er visual (Figur 1, Høyre Panel). Fjern tilnærmet 1/4 til 1/3 av den venstre cerebellum. Den viktigste av fjell ved siden av DCN er ampullen av den overlegne halvsirkelformet kanalen.
MERK: Aspirasjon av lillehjernen er nøkkelen trinn i protokollen. Regissert aspirasjon av lillehjernen er mest vellykket utført hvis det skjer i ett forsøk og ikke med flere passeringer av suge som dette vil føre til blødninger. For å bidra til aspirasjon, sett fokalplanet av mikroskopet på den forventede dybde av CN, noe som vil være litt distalt til overflaten av lillehjernen. Sette fokusplanet til CN vil bedre visualisering og sikre et skarpt bilde. - Er forventet etter aspirasjon, ytterligere blødning, cerebrospinalvæsken (CSF) bygge opp, og lillehjernen forskyvning på DCN. Innpode 0,5 cc sterilt saltvann raskt inn i craniotomy å forhindre blodkoagulering. En kombinasjon av skånsom dabbing med en tannpunktet og suge kan deretter blibrukes til å fjerne en bane for direkte visualisering av DCN. Ikke direkte kontakt med overflaten på DCN.
- Ved hjelp av en 5 French sug, aspirere den laterale rste parti av den venstre cerebellum liggende DCN inntil DCN er visual (Figur 1, Høyre Panel). Fjern tilnærmet 1/4 til 1/3 av den venstre cerebellum. Den viktigste av fjell ved siden av DCN er ampullen av den overlegne halvsirkelformet kanalen.
2. Trykkmikroinjeksjon for virus-mediert genoverføring og Kirurgisk Recovery
- Etter DCN er fri for overliggende blod og CSF og er klart synlige, blir trykk microinjections inn i DCN ved anvendelse av en 10 pl Hamilton-sprøyte i løpet av en 2 minutters periode.
- Innføre nålen med en mikromanipulator til spissen ikke lenger er synlig under overflaten av DCN.
- For optimal ytelse, må du bruke en 33 eller 34 gauge nål (bruk en gasstett sprøyte med 34 gauge nål) med en grunne skråkant, slik som 45 °, for å minimere sløv traumer og lokalisere injeksjonsvolumet innenfor DCN, som er en tynn og grunne hjernestruktur (<300 mikrometer tykk).
MERK: Andre mikroinjeksjon instrumenter kan benyttes basert. Ideelt sett bør injeksjon instrument være fleksibel for å tillate noen små bend, hvis det er nødvendig for å direkte rettet mot DCN. Videre, som musen beveger seg litt i løpet av fremgangsmåten på grunn av respirasjon, må instrumentet være robust nok til å tåle mindre mengder av bevegelse.
3. Kirurgisk Recovery
- Umiddelbart etter injeksjon, re-omtrent huden og la musen til å gjenopprette per standard fremgangsmåte for gjenoppretting. Gjenværende cerebellum og arrvev vil fylle i hulrommet som følge av aspirasjon av lillehjernen. Kontinuerlig overvåke dyr inntil tilstrekkelig bevissthet er gjenvunnet for å opprettholde sternum recumbency. Overvåke hjertefrekvens, respirasjonsfrekvens, samt evne til å mate.
MERK: Ingen dyr som har gjennomgått kirurgi returneres til et bur med andre dyr før fullt restituert. - Hvis en mus begynner å gå i sirkler postoperativt (<5% av tilfellene), vanligvis 2-4 timer etter at nedleggelse av huden innsnitt, umiddelbart ofre musen, som det ville sannsynligvis ha en vanskelig tid fôring. Thans bivirkning skyldes sannsynligvis aspirasjon av lillehjernen. Dyret bør overvåkes for smerte postoperativt, og hensiktsmessige narkotika bør gis for å sikre dyr komfort basert på institusjonelle standarder. Antibiotika kan være nødvendig, hvis tegn på infeksjon.
4. Sekundær kraniotomi og Cochlear Nucleus Eksponering
- Etter 2-4 uker med healing og virus-mediert genoverføring inkubasjon, re-bedøve en tidligere injisert mus og gjenta steg 1,1-1,5 Optimal inkubasjonstiden varierer med type genet overføres.
- Fjerne arrvev over craniotomy stedet av en kombinasjon av pinsett, skalpell, og Rongeurs.
- Etter å visualisere kraniotomi, identifisere en kombinasjon av gjenværende lillehjernen og arrvev liggende den DCN. Bruk en 5 fransk sug til å suge liggende cerebellum / arrvev (lik den forrige lillehjernen aspirasjon).
- Etter aspirasjon, forventer ytterligere blødning, CSF build-up, og gjenværende biter av lillehjernen. Raskt innføre saltvann inn i craniotomy å forhindre blodkoagulering. Bruk en kombinasjon av milde tann punkt dabbing og sug å rydde veien for direkte visualisering av DCN.
- Observere overflaten av DCN. Utføre optogenetics baserte fysiologi eksperimenter som DCN er nå tilgjengelig. Innføre en lett stimulus, for eksempel med en optisk fiber (figur 2), for å drive en optogenetics basert forsøk.
5. Histologi
- Følgende konklusjon av eksperimenter, avlive mus med en overdose av ketamin. Perfuse musen med fysiologisk saltvann, etterfulgt av 4% paraformaldehyde.
- Pakk hjernestammen fra skallen og post-fix for 2 timer. Cryoprotect hjernestammen i 30% sukrose for 24-48 hr. Seksjon hjernestammen ved hjelp av en standard kryostat bruker 60 mikrometer seksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Delvis Cerebellar Aspirasjon Demonstrerer Tilgang til Cochlear Nucleus
Etter at huden og muskelen som ligger over kraniet fjernes, landemerker skallen overflate, for eksempel de koronale og Lamda sutur linjer, viser den omtrentlige lokalisering av kraniotomi. Etter kraniotomi med Rongeurs, er lillehjernen visualisert. Forsiktig aspirasjon av den lille del av cerebellum demonstrerer visualisering av CN, som deretter kan injiseres (figur 1).
Sekundær Cochlear Nucleus Eksponering for Stimulering med Blue Light Laser
Etter innledende eksponering av DCN, genoverføring med en opsin, og inkubasjonsperioden kan DCN deretter bli stimulert av et blått lys laser. Den sekundære kraniotomi eksponere overflaten av DCN for optisk stimulering er lik i teknisk tilnærming til den primære kraniotomi (Supp. Film 1). DCN, bliren overflatestruktur som er mindre enn 300 um i tykkelse. Den eksperimentelle murine forberedelse forblir levedyktig i opptil seks timer.
Figur 1: Delvis lillehjernen aspirasjon demonstrerer tilgang til rygg cochlea kjernen. Venstre panel: Etter mus blir plassert i holderen, er et snitt tatt vertikalt gjennom hud og mykt vev langs den bakre del av hodet til det myke vevet av halsen. Huden er lateralized, og muskelen liggende den koronale suturlinje fjernes Middle Panel:. En kraniotomi blir deretter gjennomført over regionen av lillehjernen og underliggende rygg cochlea kjerne med bein Rongeurs Høyre Panel:. For eksponering av rygg cochlea nucleus , en 5 French suge blir så brukt til å suge cerebellumliggende den cochlea kjernen inntil rygg cochlea kjernen er visualisert.
Figur 2: Eksponering av overflaten av cochlea kjernen for stimulering med blått lys laser for å frembringe en optisk-fremkalt auditive hjernestammen respons Plassering av optisk fiber er koplet til et blått lys laser på overflaten av den dorsale cochlea kjernen muliggjør optiske stimulering av. den opsin-smittet rygg cochlea kjernen. Blå bar = 400 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette dokumentet beskriver teknikken for direkte visualisering av DCN i den murine modellen for manipulering av den sentrale hørselssystemet. Den skisserte tilnærming av direkte visualisering gir betydelige fordeler i forhold til hovedalternativet, som er stereotaksiske tilnærminger. Primært direkte visualisering av DCN åpner for umiddelbar bekreftelse på stedet av hjernestammen, mens stereotaksiske tilnærminger ikke råd til direkte visualisering. I eksperimenter som nødvendig lengre inkuberingsperioder, som er tilfelle i virus-mediert genoverføring, det er mulighet for infeksjon lav virkningsgrad hvis injeksjon "bommer" på målstedet. Videre tillater en direkte visualisering tilnærming til injeksjon i et bredt spekter dyre aldre. En analog kirurgisk tilnærming kan brukes i overlevelses eksperimenter med andre dyremodeller, for eksempel rotter og marsvin.
Det er flere viktige skritt i denne protokollen. Først,mus må plasseres riktig i stereotaktisk holderen. Enhver bevegelse av hodet vil resultere i vanskeligheter med å gjøre kraniotomi. Sekund, plassering av kraniotomi er avgjørende. Hvis kraniotomi ikke er gjort i den riktige stilling, vil visualisering av DCN følgende aspirasjon av lillehjernen være vanskelig, om ikke umulig. Til slutt, er den mest kritiske trinn av protokollen delvis rettet aspirasjon av lillehjernen. Det er to tekniske tilnærminger til aspirasjon av lillehjernen. I den første aspirasjon tilnærming, er suge stadig holdt på lillehjernen, løfte den opp, av hjernestammen. I denne tilnærmingen, kan den DCN være delvis visualisert under cerebellum og suge holdes inntil CN er fullt visualisert og cerebellum fjernet. I den andre tilnærming, er cerebellum delvis suget i flere lagdelte passerer inntil DCN visualiseres. Tann poeng kan tas med milde dabbing å fjerne blod eller gjenværende cerebellum fragments fra CN dersom det ikke kan være fullt visualisert.
Blødning er en viktig ulempe ved den direkte visualisering tilnærming og fremst forekommer under den innledende kraniotomi og etter cerebellar aspirasjon. I mange tilfeller under den innledende kraniotomi, vil stoppe blødning med tiden i løpet av 2-5 min. Plassere et silkepapir eller dental punkt på stedet av blødninger og åpner for hemostase. I form av blødning etter cerebellar aspirasjon, er det viktig å injisere normal saltløsning (0,5-1 cm) ved stedet av kraniotomi å fortynne blodet og forhindre blodklumpdannelse på nivå med CN. Kan brukes En kombinasjon av sug og skånsom tann punkt dabbing å fjerne blod og saltvann. Faktisk, er den viktigste begrensning av denne metode er det invasive natur av fremgangsmåten.
Protokollen har implikasjoner utover manipulering av hørselssystemet. In vivo genoverføring inn i sentralnervesystemet gjør at manipulering av divErse nervebaner og har tilbudt innsikt i flere nevrale funksjoner, inkludert minne, motorisk kontroll, luktesans, og audition. 16,21-26 Den kirurgiske tilnærming, slik at direkte visualisering i forbindelse med genoverføring og stimulering kan potensielt brukes til andre regioner av hjernestammen, både de som er nevnt ovenfor, og andre. Etter mestring av direkte visualisering av DCN, en rekke eksperimenter er mulig, inkludert injeksjon av opsins inn i CN og påfølgende stimulering med et blått lys laser. Andre nevrofysiologi eksperimenter som elektrisk stimulering og nevrale injektor tracings, 18 er også mulig. Nivået for visualisering og varigheten av stimuleringen av denne tilnærmingen gir mulighet for flere anvendelser for en rekke eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av en Foundation Bertarelli stipend (DJL), en MED-EL stipend (DJL), og en National Institutes of Health Grants DC01089 (MCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic holder | Stoelting | 51500 | |
| Homeothermic blanket | Harvard | 507214 | |
| Scalpel blade #11 | Fine Surgical Tools | 10011-00 | |
| Iris scissor | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| 5 French suction | Symmetry Surgical | 2777914 | |
| Dental Points | Henry Schein | 100-8170 | |
| Bone rongeur | Fine Surgical Tools | 16020-14 | |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7633-01 | |
| 34 gauge, needle | Hamilton | 207434 | |
| Rongeurs | Fine Surgical Tools | 16021-14 |
References
- Lalwani, A., Mhatre, A. Cochlear gene therapy. Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).
- Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. Current issues in cochlear gene transfer. Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Koh, S., Pettis, R., Mhatre, A., Lalwani, A. Cochlear microinjection and its effects upon auditory function in the guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
- Lalwani, A., Walsh, B., Reilly, P., Muzyczka, N., Mhatre, A. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
- Wareing, M., Lalwani, A. Cochlear gene therapy: current perspectives. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 5 Suppl 1. (49), 27-30 (1999).
- Han, J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. J Clin Invest. 124 (3), 1114-1129 (2014).
- Adamantidis, A., et al. Optogenetic interrogation of dopaminergic modulation of the multiple phases of reward-seeking behavior. J Neurosci. 30 (31), 10829-10835 (2011).
- Kim, K., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PloS One. 7 (4), e33612 (2012).
- Britt, J., Bonci, A. Optogenetic interrogations of the neural circuits underlying addiction. Curr Opin Neurobiol. 23 (4), 539-545 (2013).
- Abbott, S., Coates, M., Stornetta, R., Guyenet, P. Optogenetic stimulation of c1 and retrotrapezoid nucleus neurons causes sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats. Hypertension. 61 (4), 835-841 (2013).
- Carter, M., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
- Darrow, K., et al. Optogenetic control of central auditory neurons. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. (695), (2012).
- Shimano, T., et al. Assessment of the AAV-mediated expression of channelrhodopsin-2 and halorhodopsin in brainstem neurons mediating auditory signaling. Brain Res. 1511, 138-152 (2013).
- Doucet, J., Ryugo, D. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. J Comp Neurol. 385, 245-264 (1997).
- Brown, M., Drottar, M., Benson, T., Darrow, K. Commissural axons of the mouse cochlear nucleus. J Comp Neurol. 521, 1683-1696 (2013).
- Verma, R., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hear Res. 310, 69-75 (2014).
- Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. J Neurophysiol. 93 (1), 557-569 (2005).
- Rolls, A., et al. Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation. Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 13305-13310 (2011).
- Huff, M., Miller, R., Deisseroth, K., Moorman, D., LaLumiere, R. Posttraining optogenetic manipulations of basolateral amygdala activity modulate consolidation of inhibitory avoidance memory in rats. Proc Natl Acad Sci. 110 (9), 3597-3602 (2013).
- Stortkuhl, K., Fiala, A. The Smell of Blue Light: A New Approach toward Understanding an Olfactory Neuronal Network. Front Neurosci. 5 (72), (2011).
- Hira, R., et al. Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex. J Neurosci Methods. 179 (2), 258-263 (2009).
- Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice. Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).
- Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
