Abstract
A investigação sobre o uso da transferência de genes mediada por vírus para prender ou reverter a perda auditiva tem sido amplamente relegado para o sistema auditivo periférico. Poucos estudos examinaram transferência de genes para o sistema auditivo central. O núcleo dorsal coclear (DCN) do tronco cerebral, que contém neurônios de segunda ordem da via auditiva, é um local potencial de transferência de genes. Neste protocolo, uma técnica para exposição direta e máxima da DCN murino através de uma abordagem posterior fossa é demonstrada. Esta abordagem permite a qualquer cirurgia aguda ou sobrevivência. Após a visualização direta da DCN, uma série de experimentos são possíveis, incluindo a injeção de opsinas para o núcleo coclear e subsequente estimulação por uma fibra óptica acoplada a uma luz de laser azul. Outros experimentos neurofisiologia, como a estimulação elétrica e traçados injetores neurais também são viáveis. O nível de Visualização e a duração da estimulação realizável que esta abordagem seja aplicável a uma ampla gama de experiências.
Protocol
NOTA: Todos os procedimentos experimentais são realizados de acordo com o Cuidado e Uso Comitê Animal do Massachusetts Eye e Ear Infirmary e Harvard Medical School, que seguem as diretrizes nacionais de cuidados de animais, incluindo a Política Pública de Saúde de serviço na Humane Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, o Guia ILAR, e da Lei do Bem-Estar Animal. Procedimentos experimentais listados abaixo exposição do DCN esquerda detalhe. Usar instrumentos esterilizados durante a realização da cirurgia de sobrevivência.
1. Primária Craniotomia e Dorsal Coclear Nucleus Exposição
- Anestesia
- Anestesiar um rato, com idade 8-12 semanas, com peso de 18-24 g, com xilazina 20 mg / kg de cetamina e 100 mg / kg via intraperitoneal. Confirme anestesia adequada pelo monitoramento da frequência cardíaca, frequência respiratória, bem como reflexo toe pitada retirada. Lugar vet pomada nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. Uma vez adequadamente sob anestesia, cabelo shave recobre tele couro cabeludo para fornecer acesso livre para o local da cirurgia.
- Posicionamento cirúrgico
- Posicione o mouse de forma segura em um suporte estereotáxico de pequenos animais, mantido no lugar por um grampo focinho.
- Certifique-se de que o grampo focinho é solto o suficiente para permitir a respiração adequada, mas firme o suficiente para imobilizar completamente a cabeça do rato. Se a cabeça do mouse é solto, o animal é provável cair fora do suporte da cabeça durante a parte craniotomia de procedimento.
- Coloque auditivo de tronco cerebral implante de eletrodos em forma padrão, o que permite o monitoramento da frequência cardíaca. A freqüência respiratória deve ser monitorizada através da visualização. Note-se que a frequência cardíaca normal e taxa respiratória irá variar dependendo da idade do rato.
- Um termômetro é colocado e é assegurada euthermia via colocação em um cobertor térmico homeotérmicos.
- Incisão da pele e exposição dos ossos interparietal e occipital do crânio
- Sob uma Microscope, fazer uma incisão vertical através da pele a partir da linha média, diretamente entre o pavilhão auricular, e estendendo-se até a porção caudal do occipital. Seguindo na linha média da pele incisão, deslocar a pele lateralmente. Visualize os músculos que cobrem a esquerda da face posterior do crânio.
- Remover muscular que recobre a parietal esquerdo, interparietal, e os ossos occipital do crânio pela desarticulação de anexos musculares para seus respectivos ossos com um bisturi ou tesoura iris. Observar um pequeno grau de sangramento ao longo das bordas musculares corte. Minimizar isso por uma leve pressão com um aplicador com ponta de algodão para 10-15 seg.
- Sobreposta craniotomia Coclear Nucleus
- Identificar linhas de sutura relevantes, incluindo suturas sagital e lambda linhas (Figura 1, painel da esquerda).
- Usando rongeurs, fazer uma craniotomia sobre o osso interparietal, à esquerda da linha média, ~ 2 milímetros caudal para a linha de sutura lambda. Esta região sobrepõe à DCN.
- Seguireig craniotomia, observar uma fina camada de dura-máter que se sobrepõe ao cerebelo. Usando uma lâmina de bisturi, remover a dura-máter. (Figura 1, painel médio).
NOTA: A remoção da dura-máter pode causar um pequeno grau de hemorragia. Este processo de usar a lâmina de bisturi para remover a dura destina-se a reduzir a quantidade de perda de sangue durante a aspiração cerebelo, que vai reunir na superfície do tronco cerebral e identificação obscura do DCN. Volume total de sangue de rato é de aproximadamente 1,5 ml não deve exceder> de 15%. Se o sangramento for superior a esse valor, o rato deve ser fornecido com a suplementação com fluido. - Retirar sangue coagulado sobrepondo o cerebelo com o aplicador de ponta de algodão. Opcionalmente, pingar soro fisiológico delicadamente usando um ponto dental para o cerebelo para limpar o sangue para fora do sangue.
- Cerebelar Aspiração
- Usando uma sucção 5 francês, aspirar a porção mais lateral do cerebelo que se sobrepõe à esquerda DCN até o DCN é visual (Figura 1, painel da direita). Retirar cerca de 1/4 a 1/3 do cerebelo esquerdo. O principal marco adjacente à DCN é a ampola do canal semicircular superior.
NOTA: A aspiração do cerebelo é o passo fundamental do protocolo. Dirigido aspiração do cerebelo é realizado com mais sucesso se ocorrer em uma única tentativa e não com várias passagens da sucção, pois isso irá causar sangramento. Para auxiliar na aspiração, definir o plano focal do microscópio na profundidade prevista para o CN, o qual será ligeiramente distai para a superfície do cerebelo. Definir o plano focal para o CN vai melhorar a visualização e garantir uma imagem nítida. - Após aspiração, de nova hemorragia, líquido cefalorraquidiano (LCR) build-up, e deslocamento cerebelo no DCN são esperados. Instilar 0,5 cc de solução salina estéril rapidamente na craniotomia para impedir a coagulação do sangue. Uma combinação de pontuar suave com um ponto dental e sucção pode então serusado para limpar um caminho para a visualização direta da DCN. Não contactar directamente a superfície do DCN.
- Usando uma sucção 5 francês, aspirar a porção mais lateral do cerebelo que se sobrepõe à esquerda DCN até o DCN é visual (Figura 1, painel da direita). Retirar cerca de 1/4 a 1/3 do cerebelo esquerdo. O principal marco adjacente à DCN é a ampola do canal semicircular superior.
2. Microinjection Pressão para mediada-Virus Gene Transferência e recuperação cirúrgica
- Após a DCN é livre de sangue sobrejacente e CSF e é claramente visível, fazer microinjeções de pressão no DCN usando a 10 ul Hamilton seringa durante um período de 2 min.
- Introduzir a agulha com um micromanipulador até que a ponta já não é visível sob a superfície do DCN.
- Para um desempenho óptimo, utilizar uma agulha de calibre 33 ou 34 (com uma seringa estanque aos gases com a agulha de calibre 34) com um chanfro raso, tal como 45 °, para minimizar o trauma sem corte e localizar o volume de injecção no interior da DCN, que é uma fina e estrutura do tronco cerebral raso (<300 mm de espessura).
NOTA: Outros instrumentos microinjeção pode ser utilizado com base. Idealmente, a injeção instrumento deve ser flexível para permitir uma ligeira bend, se necessário, para atingir diretamente o DCN. Além disso, como o rato se move ligeiramente ao longo do processo, devido à respiração, o instrumento deve ser suficientemente robusto para resistir a pequenas quantidades de movimento.
3. Recuperação Cirúrgica
- Imediatamente após a injecção, re-aproximar a pele e permitir que o mouse para se recuperar por procedimento padrão de recuperação. Restante cerebelo e cicatriz irá preencher a cavidade causada pela aspiração do cerebelo. Constantemente monitorar os animais até que a consciência suficiente é recuperada para manter decúbito esternal. Monitor de frequência cardíaca, frequência respiratória, bem como a capacidade para se alimentar.
NOTA: Nenhum animal que foi submetido a cirurgia é devolvido para uma gaiola com outros animais até totalmente recuperado. - Se um rato começa a andar em círculos de pós-operatório (<5% dos casos), geralmente 2-4 horas após o fechamento da incisão na pele, sacrificar imediatamente o mouse, como ele provavelmente teria uma alimentação momento difícil. Tseu efeito colateral é provavelmente devido à aspiração de o cerebelo. O animal deve ser monitorado para a dor no pós-operatório, e narcóticos adequadas devem ter para garantir o conforto dos animais com base em normas institucionais. Antibióticos podem ser necessárias, se houver sinais de infecção.
4. Secundária Craniotomia e Coclear Nucleus Exposição
- Após 2-4 semanas de cicatrização e gene transferência de incubação mediada por vírus, re-anestesiar uma previamente injetados mouse e repita o passo 1,1-1,5 tempo de incubação Optimal varia com o tipo de gene transferido.
- Remover o tecido cicatricial no local da craniotomia por uma combinação de uma pinça, bisturi, e fórceps.
- Após visualizar a craniotomia, identificar uma combinação de permanecer cerebelo e tecido cicatricial que recobre a DCN. Use a 5 de sucção para aspirar francês cerebelo sobreposta / tecido cicatricial (similar à aspiração cerebelar anterior).
- Após aspiração, esperar mais sangramento, CSF build-up, e os bits restantes do cerebelo. Introduzir rapidamente em solução salina a craniotomia para impedir a coagulação do sangue. Use uma combinação de suave dabbing ponto dental e sucção para limpar o caminho para a visualização direta da DCN.
- Observar a superfície do DCN. Realizar experimentos de fisiologia à base de optogenética como DCN é agora acessível. Introduzir um estímulo de luz, por exemplo com uma fibra óptica (Figura 2), para conduzir uma experiência baseada Optogenetics.
5. Histologia
- Após a conclusão dos experimentos, sacrificar o mouse com uma overdose de cetamina. Perfundir do rato com soro fisiológico normal seguido por paraformaldeído a 4%.
- Extraia o tronco cerebral a partir do crânio e pós-correção para 2 horas. Cryoprotect do tronco cerebral em 30% de sacarose por 24-48 horas. Secção do tronco cerebral utilizando um criostato padrão usando 60 mm secções.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Parcial Cerebellar aspiração demonstra ter acesso ao núcleo coclear
Após a pele e músculo sobrejacente ao crânio são removidos, marcadores de superfície do crânio, como as linhas de sutura coronal e lamda, demonstrar a localização aproximada da craniotomia. Após craniotomia com fórceps, o cerebelo é visualizada. Aspiração cuidadosa da pequena porção de o cerebelo demonstra visualização do CN, que podem então ser injectados (Figura 1).
Secundária Coclear Nucleus Exposição para estimulação com laser Blue Light
Após a exposição inicial de DCN, a transferência de genes com uma opsina, e o período de incubação, o DCN pode ser estimulada por uma luz laser azul. A craniotomia secundário expondo a superfície do DCN para estimulação óptica é semelhante em abordagem técnica para a craniotomia primário (Supl. 1 Filme). O DCN, sendouma estrutura de superfície que é inferior a 300 um de espessura. A preparação experimental murino permanece viável por até 6 horas.
Figura 1: aspiração cerebelar parcial demonstra ter acesso ao núcleo coclear dorsal. Painel esquerdo: Após o rato é colocado no suporte, é feita uma incisão vertical através da pele e do tecido mole ao longo do aspecto posterior do crânio para o tecido mole do pescoço. A pele é lateralizada, e o músculo sobrejacente à linha de sutura coronária é removido painel médio:. Uma craniotomia é então completada através da região do cerebelo e subjacente núcleo coclear dorsal com os fórceps osso Painel direito:. Para a exposição do núcleo coclear dorsal , um 5 sucção francês é então utilizada para aspirar o cerebelosobrepondo-se ao núcleo coclear até o núcleo coclear dorsal é visualizado.
Figura 2: A exposição da superfície do núcleo coclear para estimulação com luz laser azul para produzir uma resposta do tronco cerebral auditivo opticamente evocado Colocação de fibra óptica acoplada a uma luz laser azul na superfície do núcleo coclear dorsal permite a estimulação da óptica. cóclea núcleo dorsal infectadas com opsina. Barra azul = 400 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este artigo descreve a técnica de visualização direta do DCN no modelo murino para a manipulação do sistema auditivo central. A abordagem descrita de visualização direta oferece vantagens significativas sobre a alternativa principal, que são abordagens estereotáxica. Primeiramente, a visualização direta da DCN permite confirmação imediata do local do tronco cerebral, enquanto abordagens estereotáxica não pagar a visualização direta. Em experiências que implicam o prolongados períodos de incubação, como é o caso da transferência de genes mediada por vírus, existe o potencial para a baixa eficiência de infecção, se a injecção de "falha" o local alvo. Além disso, uma abordagem visualização direta permite a injeção em uma ampla gama de idades dos animais. Uma abordagem cirúrgica análogo pode ser utilizado em experiências de sobrevivência com outros modelos animais, tais como ratos e porquinhos da índia.
Há vários passos críticos neste protocolo. Em primeiro lugar, omouse deve ser posicionado corretamente no suporte estereotáxico. Qualquer movimento da cabeça irá resultar em dificuldade para fazer a craniotomia. Em segundo lugar, a localização da craniotomia é crucial. Se a craniotomia não é feita na posição apropriada, a visualização do DCN seguinte aspiração do cerebelo será difícil, se não impossível. Finalmente, a etapa mais importante do protocolo é a aspiração dirigida parcial do cerebelo. Existem duas abordagens técnicas à aspiração do cerebelo. Na primeira abordagem de aspiração, a sucção é constantemente realizado no cerebelo, levantando-o para cima, fora do tronco cerebral. Nesta abordagem, o DCN pode ser parcialmente visualizados sob o cerebelo e a sucção é mantida até que a CN é completamente visualizada e cerebelo removido. Na segunda abordagem, o cerebelo é parcialmente aspirado em vários passes mergulhado até que o DCN é visualizada. Pontos dentários podem ser usados com dabbing suave para limpar sangue ou permanecer cerebelo Fragments da CN se ele não pode ser totalmente visualizada.
O sangramento é uma grande desvantagem da abordagem visualização direta e, principalmente, ocorre durante a craniotomia inicial e após a aspiração do cerebelo. Em muitos casos, durante a craniotomia inicial, irá parar o sangramento com o tempo dentro de 2-5 min. A colocação de um papel de seda ou ponto dentário no local da hemorragia e permitindo a hemostasia. Em termos de sangramento após a aspiração do cerebelo, é importante para injectar solução salina normal (0,5-1 cm) no local da craniotomia para diluir o sangue e prevenir a formação de coágulos de sangue no nível da NC. Uma combinação de sucção suave e ponto de pontuar dentária pode ser usado para limpar o sangue e soro fisiológico. Com efeito, a principal limitação desta abordagem é a natureza invasiva do procedimento.
O protocolo tem implicações para além manipulação do sistema auditivo. Na transferência génica in vivo no sistema nervoso central, permite uma manipulação de divERSE vias neurais e ofereceu insights sobre múltiplas funções neurais, incluindo a memória, o controle motor, olfato e audição. 16,21-26 A abordagem cirúrgica, permitindo a visualização direta para fins de transferência de genes e estimulação pode, potencialmente, ser aplicado a outras regiões do tronco cerebral, tanto aqueles listados acima e outros. Após o domínio da visualização direta do DCN, uma série de experimentos são possíveis, incluindo a injeção de opsinas no CN e estimulação subsequente com uma luz laser azul. Outros experimentos neurofisiologia, como a estimulação elétrica e traçados injetores neurais, 18 também são viáveis. O nível de visualização e a duração da estimulação desta abordagem permite múltiplas aplicações para uma ampla gama de experiências.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Financiamento: Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Bertarelli (DJL), uma subvenção MED-EL (DJL), e um dos Institutos Nacionais de Saúde Grants DC01089 (MCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic holder | Stoelting | 51500 | |
| Homeothermic blanket | Harvard | 507214 | |
| Scalpel blade #11 | Fine Surgical Tools | 10011-00 | |
| Iris scissor | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| 5 French suction | Symmetry Surgical | 2777914 | |
| Dental Points | Henry Schein | 100-8170 | |
| Bone rongeur | Fine Surgical Tools | 16020-14 | |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7633-01 | |
| 34 gauge, needle | Hamilton | 207434 | |
| Rongeurs | Fine Surgical Tools | 16021-14 |
References
- Lalwani, A., Mhatre, A. Cochlear gene therapy. Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).
- Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. Current issues in cochlear gene transfer. Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Koh, S., Pettis, R., Mhatre, A., Lalwani, A. Cochlear microinjection and its effects upon auditory function in the guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
- Lalwani, A., Walsh, B., Reilly, P., Muzyczka, N., Mhatre, A. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
- Wareing, M., Lalwani, A. Cochlear gene therapy: current perspectives. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 5 Suppl 1. (49), 27-30 (1999).
- Han, J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. J Clin Invest. 124 (3), 1114-1129 (2014).
- Adamantidis, A., et al. Optogenetic interrogation of dopaminergic modulation of the multiple phases of reward-seeking behavior. J Neurosci. 30 (31), 10829-10835 (2011).
- Kim, K., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PloS One. 7 (4), e33612 (2012).
- Britt, J., Bonci, A. Optogenetic interrogations of the neural circuits underlying addiction. Curr Opin Neurobiol. 23 (4), 539-545 (2013).
- Abbott, S., Coates, M., Stornetta, R., Guyenet, P. Optogenetic stimulation of c1 and retrotrapezoid nucleus neurons causes sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats. Hypertension. 61 (4), 835-841 (2013).
- Carter, M., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
- Darrow, K., et al. Optogenetic control of central auditory neurons. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. (695), (2012).
- Shimano, T., et al. Assessment of the AAV-mediated expression of channelrhodopsin-2 and halorhodopsin in brainstem neurons mediating auditory signaling. Brain Res. 1511, 138-152 (2013).
- Doucet, J., Ryugo, D. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. J Comp Neurol. 385, 245-264 (1997).
- Brown, M., Drottar, M., Benson, T., Darrow, K. Commissural axons of the mouse cochlear nucleus. J Comp Neurol. 521, 1683-1696 (2013).
- Verma, R., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hear Res. 310, 69-75 (2014).
- Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. J Neurophysiol. 93 (1), 557-569 (2005).
- Rolls, A., et al. Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation. Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 13305-13310 (2011).
- Huff, M., Miller, R., Deisseroth, K., Moorman, D., LaLumiere, R. Posttraining optogenetic manipulations of basolateral amygdala activity modulate consolidation of inhibitory avoidance memory in rats. Proc Natl Acad Sci. 110 (9), 3597-3602 (2013).
- Stortkuhl, K., Fiala, A. The Smell of Blue Light: A New Approach toward Understanding an Olfactory Neuronal Network. Front Neurosci. 5 (72), (2011).
- Hira, R., et al. Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex. J Neurosci Methods. 179 (2), 258-263 (2009).
- Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice. Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).
- Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
