Abstract
Tutuklama veya işitme kaybı ters virüs aracılı gen transferi kullanımı soruşturma büyük ölçüde çevresel işitme sisteminin küme olmuştur. Birkaç çalışma, merkezi işitme sistemine gen transferi inceledik. işitsel yolun ikinci dereceden nöronları içeren beyin sapı dorsal koklear nükleus (DCN), gen transferi için potansiyel bir sitedir. Bu protokol, posterior fossa yaklaşımı ile kemirgen DCN doğrudan ve maksimal maruz kalma bir tekniktir gösterilmiştir. Bu yaklaşım, akut ya da hayatta kalma cerrahi sağlar. DCN doğrudan görselleştirme sonra, deney bir ana bilgisayar, bir mavi ışık lazer bağlanmış bir fiber optik ile koklear nükleus ve daha sonra stimülasyon içine opsins püskürtülmesi de dahil olmak üzere uygulanabilir. Böyle elektrik stimülasyonu ve nöral enjektör iz gibi diğer nörofizyoloji deneyler de mümkün bulunmaktadır. Visualiza düzeyiyon ve uyarılma süresi elde deneyler geniş bu yaklaşım uygulanamaz hale.
Protocol
NOT: Bütün deneysel prosedürler Halk Sağlığı Servisi İnsanca Bakım Politikası ve laboratuvar Hayvanların Kullanımı, dahil olmak üzere ulusal hayvan bakımı yönergeleri izleyin Massachusetts Göz Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Kulak Revir ve Harvard Tıp Okulu, uygun yapılmaktadır Ilar Kılavuzu ve Hayvan Refahı Yasası. Deneysel işlemler sol DCN detay maruz aşağıda listelenen. Sağkalım ameliyat yaparken steril aletler kullanın.
1. İlköğretim Kraniyotomi ve Dorsal Cochlear Nucleus Pozlama
- Anestezi
- Bir intraperitonal uygulama yoluyla ksilazin 20 mg / kg ve ketamin 100 mg / kg ile 18-24 g ağırlığında 8-12 haftalık, yaşlı bir fare, anestezisi. Izleme kalp hızı, solunum hızı, yanı sıra ayak tutam çekilme refleksi ile uygun anestezi onaylayın. Gözleri yerleştirin veteriner merhem anestezi altında iken kuruluğu önlemek için. Bir kez yeterli anestezi altında, tıraş saç örten tO cerrahi siteye engelsiz erişim sağlamak için kafa derisi.
- Cerrahi konumlandırma
- Bir burun kelepçe ile yerinde tutulan küçük bir hayvan steryotaksik tutucu, güvenli bir şekilde fare yerleştirin.
- Burun kelepçe tamamen fare kafasını hareketsiz yeterli solunum ama yeterince sıkı sağlamak için yeterli gevşek olduğundan emin olun. Fare kafası gevşek ise, hayvan prosedürünün kraniotomi bölümü sırasında baş yuvasından dışarı düşmesi muhtemeldir.
- Kalp hızı izleme sağlar standart moda, işitsel beyinsapı implantı elektrotları yerleştirin. Solunum hızı görselleştirme tarafından takip edilmelidir. Normal kalp hızı ve solunum hızı fare yaşına bağlı olarak değişecektir unutmayın.
- Bir homotermik ısıtma battaniye yerleştirme yoluyla bir termometre yerleştirilir ve euthermia sağlanır.
- Cilt kesi ve kafatası interparietal ve oksipital kemikler maruz
- Bir Microsc altındaope, deri yoluyla dikey kesi doğrudan kepçesi arasında, orta hatta başlayan ve oksiputa kaudal kısmına uzanan yapmak. Orta hat cilt kesi ardından, yanal cildi yerinden. Kafatasının sol arka yönünü kapsayan kasları gözünüzde canlandırın.
- Bir neşter veya iris makas ile kendi kemiklere, kas ekleri dezartikülasyon ile kas sol parietal, interparietal örten ve kafatasının oksipital kemikleri çıkarın. Kesme kas kenarları boyunca kanama küçük bir derecede dikkat edin. 10-15 saniye için bir pamuk uçlu bir aplikatör ile hafif basınç ile bu en aza indirin.
- Kranyotomi üstteki Cochlear Nucleus
- Sagital ve lambda sütür hatları (Şekil 1, Sol Panel) dahil olmak üzere ilgili dikiş hatları, tanımlayın.
- Rongeurs kullanarak, lambda dikiş hattına orta hat sol interparietal kemik üzerinde opera, ~ 2 mm kaudal yapmak. Bu bölge DCN üzerler.
- Following kraniotomi, beyincik üzerinde uzanan dura ince bir tabaka gözlemlemek. Bir neşter bıçak kullanarak, dura çıkarın. (Şekil 1, Orta Panel).
Not: dura çıkarılması kanama küçük olmasına neden olabilir. Dura kaldırmak için neşter bıçak kullanarak Bu süreç beyin yüzeyinin ve DCN ve karanlık tanımlanmasına havuz olacak beyincik aspirasyon sırasında kan kaybı miktarını azaltmak için tasarlanmıştır. Fare toplam kan hacmi% 15 daha> ~ 1.5 ml geçmemelidir değildir. Kanama, bu miktarı aşarsa, fare sıvı takviyesi ile birlikte sağlanmalıdır. - Pamuk uçlu aplikatör ile beyincik kaplayan pıhtılaşmış kan çıkarın. İsteğe bağlı olarak, yavaşça kan kanı temizlemek için beyincik üzerine bir diş noktası kullanarak tuzlu damla.
- Serebellar Aspirasyon
- DCN karşısında olduğu kadar 5 Fransız emme kullanarak, DCN örten sol beyincik lateral-en bölümünü aspireual (Şekil 1, Sağ Panel). Sol beyincik yaklaşık 1/4 1/3 çıkarın. DCN bitişik ana dönüm superior semisirküler kanalın ampulla olduğunu.
NOT: beyincik Aspirasyon protokolünün önemli bir adımdır. O kanamaya neden olur, bu gibi emme birden paslar ile bir tek denemede oluşur ve eğer beyinciğin Yönetmen aspirasyon en başarılı yapılır. Aspirasyon yardımcı olmak için, beyincik yüzeyine biraz uzak olacak CN, beklenen derinlikte mikroskop odak düzlemi ayarlanır. CN odak düzlemi ayarlanması görselleştirme geliştirmek ve keskin bir görüntü sağlayacaktır. - DCN aşağıdaki aspirasyon, daha kanama, beyin omurilik sıvısı (BOS) birikmesi ve beyincik deplasman bekleniyor. Kan pıhtılaşmasını önlemek için hızla Kraniotomi içine steril serum fizyolojik 0.5 cc aşılamak. Bir diş alanına ve emme ile hafifçe vurma bir kombinasyonu daha sonra olabilirDCN doğrudan görüntülenmesi için bir yol temizlemek için kullanılır. Doğrudan DCN yüzeyine temas etmeyin.
- DCN karşısında olduğu kadar 5 Fransız emme kullanarak, DCN örten sol beyincik lateral-en bölümünü aspireual (Şekil 1, Sağ Panel). Sol beyincik yaklaşık 1/4 1/3 çıkarın. DCN bitişik ana dönüm superior semisirküler kanalın ampulla olduğunu.
Virüs-aracılı Gen Transferi ve Cerrahi Kurtarma 2. Basınç Mikroenjeksiyon
- DCN örten kan ve CSF serbest olan ve net bir şekilde görülebilir sonra, 2 dakikalık bir süre boyunca, 10 ul Hamilton şırıngası kullanılarak DCN içine basınç microinjections olun.
- Ucu artık DCN yüzeyinin altında görünür oluncaya kadar bir micromanipulator ile iğne tanıtın.
- En iyi performans için, künt travma en aza indirmek ve bir ince DCN içinde enjeksiyon hacmi, lokalize, 45 ° olarak, sığ konik böyle bir 33 veya 34 gauge iğne (34 gauge iğne ile bir gaz geçirmez şırınga kullanın) kullanın ve sığ beyin yapısı (<300 mikron kalınlığında).
NOT: Diğer mikroenjeksiyon aletleri kullanılan dayalı olabilir. İdeal olarak, enjeksiyon enstrüman bazı hafif ben izin vermek için esnek olmalıdırd eğer doğrudan DCN hedef için gerekli. Fare nedeniyle solunum prosedür boyunca hafifçe hareket gibi Ayrıca, enstrüman hareketinin küçük miktarlarda dayanacak kadar sağlam olmalıdır.
3. Cerrahi Kurtarma
- Hemen ardından enjeksiyon, cilt yeniden yaklaştığı ve fare standart kurtarma prosedürüne göre kurtarmak için izin verir. Kalan beyincik ve skar dokusu beyincik aspirasyonu nedeniyle boşluğunda dolduracaktır. Yeterli bilinç sternum yatma korumak için sağlanıncaya kadar sürekli hayvanları izlemek. Kalp hızı, solunum sayısı, hem de besleme becerisi izleyin.
NOT: Tamamen iyileşene kadar hiçbir hayvan ameliyatı geçirmiş diğer hayvanlarla bir kafese geri döner. - Bir fare operasyon sonrası çevrelerinde yürümeye başlarsa büyük olasılıkla zor bir zaman besleme olurdu gibi (<olguların% 5), cilt kesi kapatılması sonra genellikle 2-4 saat, hemen, fare kurban. TOnun yan etkisi nedeniyle beyincik aspirasyon muhtemeldir. Hayvan postoperatif ağrı için izlenmelidir, ve uygun uyuşturucu kurumsal standartlara dayalı hayvan konfor sağlamak için verilmelidir. Antibiyotikler, gerekli enfeksiyon durumunda kanıtı olabilir.
4. İkincil Kraniyotomi ve Cochlear Nucleus Pozlama
- Şifa ve virüs aracılı gen transferi inkübasyon 2-4 hafta sonra, önceden enjekte fare ve adımı tekrarlayın 1,1-1,5 Optimal inkübasyon süresi aktarılan genin tipine göre değişir yeniden uyutmak.
- Cımbız, neşter ve rongeurs bir kombinasyonu ile Kraniotomi sitesi üzerinden skar dokusu çıkarın.
- Kraniotomiye görselleştirmek sonra, DCN örten beyincik ve skar dokusu kalan bir arada tanımlamak. Örten beyincik / (önceki serebellar aspirasyon benzer) skar dokusu aspire 5 Fransız emiş kullanın.
- Aspirasyon ardından, daha kanama, BOS b bekliyoruzuild-up ve beyincik kalan bitleri. Hızla kan pıhtılaşmasını önlemek için Kraniotomi içine tuzlu tanıtmak. DCN doğrudan görselleştirme yolunu temizlemek için yumuşak diş nokta dabbing ve emme bir arada kullanın.
- DCN yüzeyini gözlemlemek. DCN artık erişilebilir olduğu gibi Optogenetik-tabanlı fizyolojisi deneyleri. Bir Optogenetik tabanlı deney sürmek için, bir fiber optik (Şekil 2), örneğin, hafif bir uyarıcı, tanıtılması.
5. Histoloji
- Deneylerin sonucu takiben, ketamin dozu ile fare euthanize. % 4 paraformaldehid tarafından takip normal tuzlu su ile fare serpmek.
- 2 saat kafatası ve post-fix gelen beyin sapı ayıklayın. 24-48 saat süreyle% 30 sukroz içinde beyin sapı cryoprotect. Bölüm 60 mikron bölümleri kullanarak standart bir kriyostat kullanarak beyin sapı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kısmi Serebellar Aspirasyon Koklear Nucleus Erişim gösterir
Kafatası örten deri ve kas gibi koronal ve lamda sütür hatları gibi, kafatası yüzey işaretlerini, kaldırıldıktan sonra, Kraniotomi yaklaşık lokalizasyonu göstermektedir. Rongeurs ile kraniyotomi ardından, beyincik görüntülenmiştir. Serebellumun küçük bir kısmı dikkatlice aspire enjekte edilebilir CN, (Şekil 1) görselleştirme gösterir.
Mavi Işık Lazer ile Uyarım için ikincil Cochlear Nucleus Pozlama
DCN, bir opsin ile gen transferi, ve kuluçka döneminin ilk maruz ardından, DCN sonra mavi bir ışık lazer ile teşvik edilebilir. Optik uyarılması için DCN yüzeyini açığa ikincil kraniotomi birincil kraniotomi (Dest. Film 1) teknik yaklaşım benzer. DCN olmakkalınlığından az 300 um olan bir yüzey yapısı. deney sıçangiller hazırlanması 6 saat kadar uzun süre canlı kalır.
Şekil 1: Kısmi serebellar aspirasyon dorsal koklear nükleus erişimi gösterir. Sol Panel: fare yuvasına yerleştirildikten sonra, bir kesi boynun yumuşak dokuya kafatasının arka yüzü boyunca deri ve yumuşak doku yoluyla dikey yapılır. Cilt lateralize ve koronal sütür hattını örten kas kaldırılır Orta Paneli:. Bir Kraniyotomi sonra kemik rongeurs ile beyincik ve altta yatan dorsal koklear nükleus bölgede tamamlandı Sağ Panel:. dorsal koklear nükleus maruz için , 5 Fransız emme sonra beyincik aspire için kullanılırdorsal koklear çekirdek görüntülenmiştir kadar koklear çekirdeğini örten.
Şekil 2: mavi ışık lazer uyarımı için koklear çekirdeğin yüzeyine maruz bırakılması bir optik olarak uyarılmış beyin sapı bir cevap üretmek için dorsal koklear çekirdeğin yüzeyinde bir mavi ışık lazer bağlanmış optik elyafın Sıralama optik uyarılmasına imkan verir. opsin-enfekte dorsal koklea çekirdeği. Mavi çubuk = 400 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu kağıt, merkezi işitme sisteminin manipülasyonu için fare modelinde DCN doğrudan görselleştirme tekniği anlatılmaktadır. Doğrudan görselleştirme özetlenen yaklaşım stereotaksik yaklaşımlar ana alternatif üzerinde önemli avantajlar sağlar. Stereotaksik yaklaşımlar doğrudan görselleştirme göze değil oysa Öncelikle, DCN doğrudan görselleştirme, beyin sapı sitenin hemen onay veriyor. Virüs-aracılı gen transferi durumunda olduğu gibi, inkübasyon sürelerini uzun süreli gerektirecek deneylerde, enjeksiyon hedef konumu "kurtarma", düşük enfeksiyon verimliliği için potansiyel vardır. Bundan başka, bir doğrudan görüntüleme yaklaşımı çeşitli hayvan yaşlarda enjeksiyonu sağlar. Buna benzer bir cerrahi bir yaklaşım, farelere ve gine domuzlanna gibi diğer hayvan modelleri ile hayatta kalma deneylerinde kullanılabilmektedir.
Bu protokolde birkaç kritik adımlar vardır. İlk olarak,Fare stereotaktik bir tutacak içerisine düzgün bir şekilde yerleştirilmesi gerekir. Başının hareket etmesi zor kraniyotomi hale neden olur. İkincisi, Kraniotomi yeri çok önemlidir. Kraniyotomi doğru konumda yapılmaması durumunda imkansız değilse, beyincik aspirasyon aşağıdaki DCN görselleştirme, zorlu olacaktır. Son olarak, protokolün en önemli adımı beyincik kısmi yönlendirilmiş aspirasyon olduğunu. Beyincik aspirasyon iki teknik yaklaşım vardır. İlk aspirasyon yaklaşımda, emme sürekli beyin sapı kapalı, yukarı kaldırarak, beyincik üzerinde tutulur. Bu yaklaşımda, DCN kısmen beyincik altında görülebilir ve CN tamamen görsel ve beyincik kaldırılana kadar emiş tutulur. DCN görüntülenmiştir kadar ikinci yaklaşımda, beyincik kısmen birkaç katmanlı geçiş aspire edilir. Diş noktaları, kan veya diğer beyincik fragme temizlemek için hafifçe vurma ile kullanılabilecektirCN NTS tam görüntülenmiştir olamaz eğer.
Kanama, doğrudan görüntüleme yaklaşımının önemli bir dezavantajı ve esas ilk kraniotomi sırasında ve serebellar aspirasyon sonra oluşur. İlk Kraniotomi sırasında birçok durumda, kanama 2-5 dakika içinde zaman duracaktır. Kanama yerinde bir doku kağıt veya diş noktasını yerleştirip ve hemostaz için izin. Serebellar aspirasyon sonrası kanama açısından, bu kanı sulandırmak ve CN düzeyinde kan pıhtı oluşumunu engellemek için Kraniotomi yerinde, normal tuzlu (0.5-1 cc) enjekte etmek önemlidir. Emme ve nazik diş nokta dabbing kombinasyonu kan ve tuzlu temizlemek için kullanılabilir. Nitekim, bu yaklaşımın en önemli kısıtlılığı prosedürünün invaziv doğasıdır.
Protokol işitme sisteminin manipülasyonu ötesinde etkileri vardır. merkezi sinir sistemi içine in vivo gen transferi div kontrolünü kolaylaştırırnöral yolları erse ve bellek, motor kontrolü, koku duyusunun ve seçmelere dahil olmak üzere birden sinirsel fonksiyonlar, anlayışlar teklif etti. 16,21-26 cerrahi yaklaşım, gen transferi ve stimülasyon amacıyla doğrudan görselleştirme sağlayan potansiyel olarak diğer bölgelere uygulanabilir beyin sapı, hem yukarıda ve diğerleri sıraladı. DCN doğrudan görselleştirme ustalık ardından, deneyler ev sahibi mavi ışık lazer ile CN içine opsins enjeksiyonu ve sonraki stimülasyon dahil, mümkündür. Bu tür elektrik stimülasyonu ve nöral enjektör iz gibi diğer nörofizyolojisi deneyler, 18 de kullanılabilir. görüntüleme ve bu yaklaşımın uyarım süresi seviyesi deney geniş bir aralığı için birden fazla uygulama için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Finansman: Bu çalışma Vakfı Bertarelli hibe (DJL), bir MED-EL hibe (DJL) ve Sağlık Hibeler DC01089 bir National Institutes (MCB) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic holder | Stoelting | 51500 | |
| Homeothermic blanket | Harvard | 507214 | |
| Scalpel blade #11 | Fine Surgical Tools | 10011-00 | |
| Iris scissor | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| 5 French suction | Symmetry Surgical | 2777914 | |
| Dental Points | Henry Schein | 100-8170 | |
| Bone rongeur | Fine Surgical Tools | 16020-14 | |
| 10 µl Hamilton syringe | Hamilton | 7633-01 | |
| 34 gauge, needle | Hamilton | 207434 | |
| Rongeurs | Fine Surgical Tools | 16021-14 |
References
- Lalwani, A., Mhatre, A. Cochlear gene therapy. Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).
- Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. Current issues in cochlear gene transfer. Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Koh, S., Pettis, R., Mhatre, A., Lalwani, A. Cochlear microinjection and its effects upon auditory function in the guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
- Lalwani, A., Walsh, B., Reilly, P., Muzyczka, N., Mhatre, A. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
- Wareing, M., Lalwani, A. Cochlear gene therapy: current perspectives. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 5 Suppl 1. (49), 27-30 (1999).
- Han, J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. J Clin Invest. 124 (3), 1114-1129 (2014).
- Adamantidis, A., et al. Optogenetic interrogation of dopaminergic modulation of the multiple phases of reward-seeking behavior. J Neurosci. 30 (31), 10829-10835 (2011).
- Kim, K., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PloS One. 7 (4), e33612 (2012).
- Britt, J., Bonci, A. Optogenetic interrogations of the neural circuits underlying addiction. Curr Opin Neurobiol. 23 (4), 539-545 (2013).
- Abbott, S., Coates, M., Stornetta, R., Guyenet, P. Optogenetic stimulation of c1 and retrotrapezoid nucleus neurons causes sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats. Hypertension. 61 (4), 835-841 (2013).
- Carter, M., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
- Darrow, K., et al. Optogenetic control of central auditory neurons. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. (695), (2012).
- Shimano, T., et al. Assessment of the AAV-mediated expression of channelrhodopsin-2 and halorhodopsin in brainstem neurons mediating auditory signaling. Brain Res. 1511, 138-152 (2013).
- Doucet, J., Ryugo, D. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. J Comp Neurol. 385, 245-264 (1997).
- Brown, M., Drottar, M., Benson, T., Darrow, K. Commissural axons of the mouse cochlear nucleus. J Comp Neurol. 521, 1683-1696 (2013).
- Verma, R., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hear Res. 310, 69-75 (2014).
- Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. J Neurophysiol. 93 (1), 557-569 (2005).
- Rolls, A., et al. Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation. Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 13305-13310 (2011).
- Huff, M., Miller, R., Deisseroth, K., Moorman, D., LaLumiere, R. Posttraining optogenetic manipulations of basolateral amygdala activity modulate consolidation of inhibitory avoidance memory in rats. Proc Natl Acad Sci. 110 (9), 3597-3602 (2013).
- Stortkuhl, K., Fiala, A. The Smell of Blue Light: A New Approach toward Understanding an Olfactory Neuronal Network. Front Neurosci. 5 (72), (2011).
- Hira, R., et al. Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex. J Neurosci Methods. 179 (2), 258-263 (2009).
- Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice. Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).
- Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
